tìm hiểu thành phần hóa học của lá bằng lăng nước lagerstroemia speciosa

Ngày nay, với sự hỗ trợ của các máy móc, thiết bị hiện đại thì việc chiết xuất và phân lập các hợp chất tự nhiên càng có nhiều thuận lợi, ngày càng có nhiều hợp chất thiên nhiên hữu ích

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA CÔNG NGHỆ

- -

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

TÌM HIỂU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LÁ BẰNG LĂNG NƯỚC

LAGERSTROEMIA SPECIOSA

Ths Tôn Nữ Liên Hương Lê Thành Việt Tân

Tháng 4/2012

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam

Khoa Công nghệ Độc lập – Tự do – Hạnh Phúc

Bộ Môn: Công nghệ Hóa học

PHIẾU ĐỀ NGHỊ ĐỀ TÀI TỐT NGHIỆP CHO SINH VIÊN

NĂM HỌC: 2011 – 2012

1 Họ và tên của cán bộ hướng dẫn: Ths Tôn Nữ Liên Hương

2 Tên đề tài: Tìm hiểu thành phần hóa học của lá Bằng lăng nước

Lagerstroemia speciosa

3 Địa điểm thực hiện: Phòng thí nghiệm hóa hữu cơ - khoa Khoa học Tự nhiên - Trường Đại học Cần Thơ

4 Số lượng sinh viên thực hiện: 01 sinh viên

5 Họ và tên sinh viên: Lê Thành Việt Tân MSSV: 2082193 Lớp: Công Nghệ Hóa Học Khóa: 34

6 Mục đích của đề tài

Phân lập chất từ cao chloroform của lá Bằng lăng nước Lagerstroemia

speciosa

7 Các nội dung chính và giới hạn của đề tài

- Tìm hiểu về Bằng lăng nước Lagestroemia speciosa

- Phân lập chất từ cao chloroform của lá Bằng lăng nước Lagerstroemia

speciosa

8 Các yêu cầu hỗ trợ cho việc thực hiện đề tài: các hóa chất để thực hiện đề tài

9 Kinh phí dự trù cho đề tài: 2.000.000 đồng

Ths Tôn Nữ Liên Hương

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG THI & XÉT TỐT NGHIỆP

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa Công nghệ Độc lập – Tự do – Hạnh Phúc

Bộ Môn: Công nghệ Hóa học

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

1 Cán bộ hướng dẫn: Ths Tôn Nữ Liên Hương

2 Đề tài: Tìm hiểu thành phần hóa học của lá Bằng lăng nước

Lagerstroemia speciosa

3 Sinh viên thực hiện: Lê Thành Việt Tân MSSV: 2082193 Lớp: Công nghệ Hóa học Khóa 34

4 Nội dung nhận xét:

a Nhận xét về hình thức LVTN:

b Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

c Những vấn đề còn hạn chế:

d Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

5 Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2012 Cán bộ hướng dẫn

Th.s Tôn Nữ Liên Hương

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa Công nghệ Độc lập – Tự do – Hạnh Phúc

Bộ Môn: Công nghệ Hóa học

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ CHẤM PHẢN BIỆN

1 Cán bộ chấm phản biện:

2 Đề tài: Tìm hiểu thành phần hóa học của lá Bằng lăng nước

Lagerstroemia speciosa

3 Sinh viên thực hiện: Lê Thành Việt Tân MSSV: 2082193 Lớp: Công nghệ Hóa học Khóa 34

4 Nội dung nhận xét:

a Nhận xét về hình thức của LVTN:

b Nhận xét về nội dung của LVTN ( Đề nghị ghi chi tiết đầy đủ):  Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

 Những vấn đề còn hạn chế:

c Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

d Kết luận, đề nghị và điểm:

Cán bộ chấm phản biện

Đặc biệt em xin gởi lời cảm ơn sâu sắc và chân thành đến cô Tôn Nữ Liên Hương, cô là người đã chỉ dẫn em thực hiện đề tài Trong quá trình thực hiện đề tài

có nhiều điều em còn chưa biết, chưa hiểu thì cô là người đã chỉ dạy cho em, khơi dậy trong em niềm tin và sức mạnh tinh thần để em vượt qua khó khăn để từ đó hoàn thành tốt công việc của mình

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể quý thầy cô trong khoa Công nghệ đặc biệt là quý thầy cô trong Bộ môn Công nghệ hóa học đã truyền đạt cho em những kiến thức cần thiết

Em xin tỏ lòng biết ơn chân thành đến thầy Trương Chí Thành trưởng Bộ môn Công nghệ hóa – Khoa công nghệ đã nhiệt tình giảng giải, định hướng và tạo mọi điều kiện thuận để em hoàn thành đề tài luận văn này

Em xin cám ơn cô Lê Thị Bích Thuyền cố vấn học tập lớp công nghệ hóa K34,

đã hết lòng hướng dẫn, giảng dạy giúp em có được những hiểu biết đầu tiên khi bước chân vào trường đại học

Em cũng xin cảm ơn các anh chị và các bạn cùng làm việc trong phòng thí nghiệm đã chỉ bảo cho em nhiều điều bổ ích Đặc biệt, em xin gửi lời cám ơn đến anh Nguyễn Duy Tuấn và anh Đỗ Minh Kiệp luôn chỉ dạy và giúp đỡ em hoàn thành luận văn của mình

Tôi xin cám ơn tất cả các bạn lớp Công nghệ Hóa 34 đã động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập Đặc biệt các bạn trong nhóm làm luận văn với tôi đã hỗ trợ cho tôi hoàn thành tốt đề tài

Con xin ghi ơn công lao to lớn của ba mẹ, ba mẹ đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho con được đến truờng và luôn là chỗ dựa vũng chắc cho con

Xin chân thành cảm ơn!

Ngày nay, với sự hỗ trợ của các máy móc, thiết bị hiện đại thì việc chiết xuất

và phân lập các hợp chất tự nhiên càng có nhiều thuận lợi, ngày càng có nhiều hợp chất thiên nhiên hữu ích được chiết xuất ra để phục vụ cho con người Các hợp chất

ấy rất tốt cho sức khỏe và có nguồn nguyên liệu rất phong phú, đa dạng

Bằng lăng nước là một loại thực vật có nhiều ở Việt Nam Ngày nay, Bằng lăng được trồng ngày một nhiều hơn, hầu như ở các công trình công cộng lúc nào cũng có mặt cây bằng lăng như một loài cây cảnh và để che bóng mát

Trong nền y học cổ truyền Châu Mỹ, Ấn Độ, Philipphines,… Bằng lăng nướcđược sử dụng như một loại thuốc trị đau bao tử, trị bệnh tiểu đường, kiết lỵ và đặc biệt cao Bằng lăng chữa bỏng rất hiệu quả Đôi khi các chất trích ly được thương mại hóa được dùng làm thuốc để chữa béo phì Chất trích từ lá Bằng lăng nước thường tìm thấy trong các thuốc bổ sung đa thành phần để làm giảm cân

Đến nay, thế giới đã công bố rất nhiều công trình nghiên cứu về cây Bằng lăng, đặc biệt là ở một số nước phát triển như: Mỹ, Nhật …Tuy nhiên, ở Việt Nam

các nghiên cứu về loài thực vật này còn chưa nhiều Do đó, đề tài “Tìm hiểu thành

phần hóa học của lá Bằng lăng nước Lagerstroemia speciosa ” được chúng em

chọn để thực hiện, với mong muốn sẽ vận dụng được những kiến thức đã học vào thực tếvà góp một phần vào việc nghiên cứu loài thực vật này

iii

TÓM TẮT

  

Bằng lăng nước là một loài thực vật có khá nhiều công dụng đã được sử dụng

từ lâu trong nền y học của một số quốc gia như: Ấn Độ, Philipphines,…Trên thế giới đã công bố nhiều nghiên cứu về loài thực vật này Tuy nhiên, ở Việt Nam Bằng lăng nước chỉ mới bước đầu được nghiên cứu

Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành điều chế cao methanol tổng từ nguyên liệu bột lá bằng kỹ thuật chiết rắn – lỏng, sử dụng các kỹ thuật chiết lỏng – lỏng để điều chế các cao chloroform và cao ethyl acetate Chúng tôi tiến hành sắc ký cột trên cao chloroform của lá Bằng lăng nước để cô lập được một hợp chất tinh khiết, xác định cấu trúc hợp chất thu được

Kết quả chúng tôi đã cô lập được stigmasterol

iv

MỤC LỤC

  

LỜI CẢM ƠN ii

LỜI MỞ ĐẦU iii

TÓM TẮT iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC HÌNH viii

DANH MỤC BẢNG x

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT xi

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT 1

1.1 Giới thiệu chung về các cây thuộc chi Lagerstroemia 1

1.2 Giới thiệu về cây Bằng lăng nước Lagerstroemia speciosa 2

1.2.1 Tên gọi và phân loại 3

1.2.2 Đặc điểm, xuất xứ và phân bố 3

1.2.3 Thành phần hóa học 4

1.2.4 Công dụng 5

CHƯƠNG 2: GIỚI THIỆU VỀ STEROID 6

2.1 Đại cương 6

2.2 Sterol 6

2.3 Một số loại Steroid khác 8

2.4 Các phương pháp chiết tách 8

2.5 Một số đại diện thiên nhiên 10

CHƯƠNG 3: CƠ SỞ LÝ THUYẾT VÀ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 11

3.1 Các kỹ thuật chiết tách chất ra khỏi cây 11

3.1.1 Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng 11

3.1.2 Kỹ thuật chiết rắn – lỏng 12

v

3.2 Một số thủ thuật khi cô lập các hợp chất hữu cơ 14

3.2.1 Làm khô mẫu chất 14

3.2.2 Sự kết tinh lại 15

3.3 Các phương pháp sắc ký 15

3.3.1 Sắc ký cột 15

3.3.1.1 Ngyuên tắc 15

3.3.1.2 Lựa chọn chất hấp phụ, dung môi giải ly cột, cột sắc ký 16 3.3.1.3 Chuẩn bị cột 16

3.3.1.4 Đưa mẫu chất cần phân tách vào cột 17

3.3.1.5 Giải ly cột 18

3.3.2 Sắc ký lớp mỏng 20

3.3.2.1 Nguyên tắc 20

3.3.2.2 Chất hấp phụ dùng trong SKLM 21

3.3.2.3 Dung môi triển khai 21

3.3.2.4 Ứng dụng của SKLM 22

CHƯƠNG 4: THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

4.1 Thời gian 23

4.2 Địa điểm 23

4.3 Phương tiện 23

4.3.1 Dụng cụ 23

4.3.2 Hóa chất 24

4.4 Phương pháp nghiên cứu 24

4.4.1 Phương pháp chiết tách 24

4.4.2 Phân lập các hợp chất hữu cơ 25

CHƯƠNG 5: THỰC NGHIỆM 26

5.1 Nguyên liệu 26

5.2 Điều chế các loại cao 26

vi

5.2.1 Điều chế cao metanol tổng 26

5.2.2 Điều chế cao chloroform 28

5.2.3 Điều chế cao ethyl acetate 29

5.3 Sắc ký cột cao Chloroform 30

5.4 Sắc ký cột phân đoạn BL.C06 33

5.5 Xác định cấu trúc hợp chất thu được 35

5.5.1 Đặc điểm hợp chất 36

5.5.2 Biện luận cấu trúc hợp chất 36

CHƯƠNG 6 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39

6.1 Kết luận 39

6.2 Kiến nghị 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

PHỤ LỤC 41

vii

DANH MỤC HÌNH

  

Hình 1.1: Bằng lăng ổi Lagerstroemia crispa 1

Hình 1.2: Bằng lăng lá nhỏ Lagerstroemia lecomtei Gagn 1

Hình 1.3: Tường vy Lagerstroemia indica L 2

Hình 1.4: Bằng lăng nhiều hoa Lagerstroemia floribunda Jack 2

Hình 1.5: Lá và hoa Bằng lăng nước Lagerstromia speciosa 2

Hình 1.6: Quả Bằng lăng nước Lagerstromia speciosa 2

Hình 1.7: Thân và cây Bằng lăng nước Lagerstromia speciosa 2

Hình 2.1: Khung cơ bản của Steroid 6

Hình 2.2: Cholesterol 7

Hình 2.3: Ergosterol 7

Hình 2.4: Stigmasterol 8

Hình 2.5: Quy trình tách chiếc riêng các sterol ra khỏi cao PE chứa nhiều chất béo 9

Hình 2.6: Một số đại diện thiên nhiên của Steroid 10

Hình 3.1: Kỹ thuật chiết ngấm kiệt 12

Hình 3.2: Kỹ thuật chiết ngâm dầm 13

Hình 3.3: Cách tính giá trị Rf 20

Hình 4.1: Một số dụng cụ dùng trong luận văn 23

Hình 4.2: Một số hóa chất dùng trong luận văn 24

Hình 5.1: Bột lá Bằng lăng xay nhuyễn 26

Hình 5.2: Điều chế cao tổng methanol 27

Hình 5.3: Điều chế cao chloroform 28

Hình 5.4: Điều chế cao ethyl acetate 29

Hình 5.5: Sơ đồ điều chế các loại cao 30

Hình 5.6: Sắc ký cột cao C 31

viii

Hình 5.7: Sắc ký cột phân đoạn BL.C06 33 Hình 5.8: Tinh thể chất LBL.C1 35 Hình 5.9: SKLM chất LBL.C1 trong ba hệ dung môi giải ly PE : EA (8:2),

C 100%, PE : EA (6:4) 36 Hình 5.10: SKLM so sánh chất LBL.C1 với cao C 36

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT

1.1 Giới thiệu chung về các cây thuộc chi Lagerstroemia

Chi Lagerstroemia là một chi lớn của họ Lythracea.Chi này có khoảng 50 loài

cây, có đặc tính rụng lá sớm, thân gỗ hay cây bụi lớn, có nguồn gốc ở vùng Đông Á

và Australia

Chúng có thân cây hàng năm đều lột vỏ; mỗi năm có phần vỏ bị lột nằm giữa các phần đã bị lột từ năm trước, hoặc ở những nơi bị các loài động vật cào rách, tạo

ra bề mặt ngoài loang lổ Lá mọc đối, đơn, mép lá có răng cưa và dao động từ 5 –

20 cm theo chiều dài Hoa có 6 hoặc 7 cánh, mép cánh có ngấn nhăn nhỏ trên các cuống hoa, phình ra giữa các đài hoa Hoa mọc thành các cụm dài (20 – 40 cm) dạng bông, có màu trắng, hồng, tía hay tím giống màu hoa oải hương; nở hoa từ giữa đến cuối mùa hè Quả là dạng quả nang, ban đầu có màu xanh lục, sau đó khi chín chuyển thành màu đen, được mở dọc theo 6 hoặc 7 đường, tạo ra các răng giống như của đài hoa và giải phóng nhiều hạt nhỏ

Một số loài cây thuộc chi Lagerstroemia: Lagerstroemia crispa (Bằng lăng ổi), Lagerstroemia lecomtei Gagn (Bằng lăng lá nhỏ), Lagerstroemia indica L (Tường vi), Lagerstroemia floribunda Jack (Bằng lăng nhiều hoa),…

Hình 1.2 Bằng lăng lá nhỏ

Lagerstroemia lecomtei Gagn

Hình 1.1 Bằng lăng ổi

Lagerstroemia crispa

Chương 1: Tổng quan về thực vật

SVTH: Lê Thành Việt Tân 2

1.2 Giới thiệu về cây Bằng lăng nước Lagerstroemia speciosa

Hình 1.3: Tường vi

Lagerstroemia indica L

Hình 1.4: Bằng lăng nhiều hoa

Lagerstroemia floribunda Jack

Chương 1: Tổng quan về thực vật

SVTH: Lê Thành Việt Tân 3

1.2.1 Tên gọi, phân loại

Tên gọi:

Tên khoa học: Lagertroemia speciosa

Tên khác: Bằng lăng nước, Queen's flower, Giant Crape-myrtle, Queen's, Crape-myrtle, Entravel,…

Loài: Lagertroemia speciosa

1.2.2 Đặc điểm, xuất xứ và phân bố

Đặc điểm [2] :

Bằng lăng nước thuộc loại đại mộc, lá có phiếng hình bầu dục, cứng, không lông, dài từ 8 đến 20 cm, rộng 3 đến 8 cm, cuốn to, gân phụ 10 – 12 đôi, rụng theo mùa Chùm tụ tán đứng ở ngọn nhánh, có lông; nụ tròn đo đỏ; hoa to, màu đỏ tím, đẹp mọc thành chùm dài từ 20 đến 40 cm Mỗi bông hoa có 6 cánh nhăn nheo, mỗi cánh dài chừng 2 đến 3,5 cm; đài có lông sát, tiểu nhị nhiều; quả nang tròn dài 2×1,8 cm, bên ngoài hơi nhám, nứt làm 6 mảnh Trên lá đài xụ Quả lúc tươi màu tím nhạt pha xanh lục, mềm, quả già có màu đen Đường kính quả từ 1,2 đến 1,5

cm, khô trên cây, trên lá đài xụ, nở làm 6 mảnh; hột 12 – 15 mm

Xuất xứ: có nguồn gốc từ Ấn Độ

Phân bố: Trên thế giới, cây sinh trưởng tốt ở nhưng nơi khí hậu ấm áp, tiêu

biểu như ở khu vực Đông Á, Ý, miền nam Pháp và bán đảo Iberia Ngoài ra, chúng cũng phát triển mạnh ở những vùng khí hậu ôn đới nhưng độ ẩm tương đối thấp như nam Texas và California Riêng ở Việt Nam: mọc hoang dại hầu như ở khắp nước

ta, tập trung nhiều nhất ở khu vực miền Đông Nam Bộ và Tây Nguyên

Bảng 1.1: Kết quả định tính thành phần hóa học của lá Bằng lăng nước

Alkaloids (Dragendorff’s, Mayer’s test) -

Steroids/Triterpenoids (Liebermann-Burchard test) +

Tannin (Ferric chloride TS; Gelatine precipitation) +

(+)có, (-) không có

Ngiên cứu của Wenli Hou, Yanfang Li, Qiang Zhang, Xin Wei, Aihua Peng, Lịuan Chen và Yuquan Wei đã nghiên cứu phân lập được từ trong cao chiết ethyl acetate lá Bằng lăng 6 hợp chất triterpenoid: oleanolic acid, arjunolic acid, maslinic acid, asiatic acid, corosolic acid và 23-hydroxyurosolic

oleanolic acid H CH3 asiatic acid OH CH2OH arjunolic acid OH CH2OH corosolic acid OH CH3 maslinic acid OH CH3 23-hydroxyurosolic OH CH2OH

HO

H H

H COOH

R 2 '

R 1 '

Chương 1: Tổng quan về thực vật

SVTH: Lê Thành Việt Tân 5

β-sitosterol-3-glucopyranosid

β-sitosterol 3,7,8-tri-O-methylellagic acid

Nghiên cứu của Nguyễn Quyết Tiến, Phạm Thị Hồng Minh, Nguyễn Quảng An,Trương Thị Thanh Nga, Nguyễn Ngọc Tuấn, Ðoàn Văn Tuấn, Phạm Hữu Ðiển

đã phân tách được các hợp chất: β-sitosterol-3-yl-lucopyranosid, β-sitosterol và 3,7,8-tri-O-methylellagic acid

1.2.4 Công dụng

Bằng lăng nước có một số công dụng như rễ, vỏ trị sốt Lá trị đái đường Trái

đắp trị lỡ miệng Hột gây ngủ In vitro, chống siêu khuẩn R.D [2]

Bằng lăng nước dùng trong y học cổ truyền ở Châu Mỹ, Châu Á, Ấn Độ, Philipphines, để trị bệnh đau bao tử, tiểu đường, béo phì và đặc biệt có tính kháng khuẩn tốt nên được dùng làm thuốc để trị bỏng Các chất trích ly được thương mại hóa đôi khi cũng được dùng làm thuốc giảm béo phì

Lá chứa corosolic acid ở mức cao nên được dùng làm thuốc trị bệnh tiểu đường Cao lỏng vỏ Bằng lăng có tác dụng làm se khô, giảm nhiễm khuẩn và tạo màng che phủ vết thương nên được áp dụng để làm thuốc trị bỏng

Hoa chứa tinh dầu có mùi thơm dịu nên có thể dùng chế nước hoa

Gỗ Bằng lăng cứng và bền nên được dùng để xây nhà, làm đồ gỗ gia dụng, khung cửa và dùng làm nguyên liệu cho ngành công nghệ bột giấy

HO

O

O O

O O

HO

o

OH H

HO HO

H H OH H H o

CHƯƠNG 2: STEROID

2.1 Đại cương[1], [4]

Steroid là những hợp chất thiên nhiên có chung đặc điểm cấu tạo phân tử có chứa hệ vòng cyclopentanoperhyphenantren hoặc trong truờng hợp rất hiếm là sự biến đổi của hệ vòng đó

Hình 2.1: Khung cơ bản của steroid Steroid có nhiều trong thiên nhiên như: các sterol, các nội tiết tố (hormone như nội tiết tố sinh dục, acid mật, hormon tuyến thượng thận), các glycoside (đặc biệt là glycoside trợ tim), các sapogenin,…

Steroid được phân bố rộng rãi trong thiên nhiên, các steroid nguồn gốc thực vật gọi là phytosterol, nguồn gốc động vật gọi là zoosterol Người ta thấy chúng ở thể tự do hoặc ở thể hóa hợp như esther, glycoside Các thành phần chiết xuất từ tự nhiên này khá phức tạp vì vậy có những phương pháp phân tách thích hợp để phân lập từng chất

Các hormon trong cơ thể người và trong các động vật khác cũng đã được nghiên cứu Sinh tố D cũng là một hợp chất steroid

Các steroid có tác dụng đặc biệt đối với cơ tim thường tồn tại dưới dạng glycoside trong tự nhiên gọi là các glycoside trợ tim

Các sapogenin steroid phân lập chủ yếu từ sự thủy phân glycoside thực vật còn gọi là saponin

2.2 Sterol [1]

Sterol là những ancol thể rắn có nguồn gốc động vật hoặc thực vật, có cấu trúc

tù 27 đến 29 nguyên tử cacbon và đều có chung khung sườn cơ bản là hệ vòng cyclopentanoperhyphenantren và một nhóm thế ankyl mạch nhánh ở vị trí C17

Sterol phân bố rộng Chúng thường có mặt song song với ankaloid hoặc saponinsteroid Chúng được tìm thấy trong động vật có xương sống, không xương sống và cả thực vật

1 2 3

8

9 10

12 13

16 11

17

Chương 2: Steroid

SVTH: Lê Thành Việt Tân 7

Nhóm sterol động vật (zoosterol): Cholesterol, Coprostanol, Desoterol, Cholestan-3β-ol, Coprostan-β-ol, Cerebrosterol, Lathosterol …

Nhóm sterol động vật biển không xương sống: Spongesterol, Clionasterol, Methyllencholesterol, Fucostreol …

24-Nhóm sterol thực vật (phytosterol): Sistosterol (có các đồng phân α, β, γ), Stigmasterol, α-Spinasterol, Brassicasterol …Các sterol thực vật có trong tất cả các

bộ phận của cây nhưng nhiều nhất ở các hạt có dầu, dưới dạng tự do hoặc ester Một

số ít ở dạng glycoside

Nhóm sterol nấm men: Ergosterol, Zymosterol; Acosterol, Fecosterol

Cholesterol: là chất béo có phân tử lượng lớn, được cô lập từ phần không bị

xà phòng hóa của chất béo, dầu mỡ Cholesterol tìm thấy trong cơ thể động vật có xương sống,có ở tế bào não, tủy sống, thường ở dạng tự do hoặc ester; Có công thức phân tử: C27H46O: có 1 nhóm –OH tại C3, 1 nối đôi giữa C5 và C6, 2 nhóm –CH3 tại gốc C10 và C13, 1 dây hydrocarbon –C8H17 tại C17 Trong phân tử có 8 C* Điểm nóng chảy: 149oC (điều kiện thường)

Hình 2.2: Cholesterol

Ergosterol: tìm thấy trong men Công thức phân tử C28H44O, có 1 nhóm –OH tại C3, 2 nối đôi giữa C5 và C6, C7 và C8, 2 nhóm –CH3 tại gốc C10 và C13, 1 dây hydrocarbon –C9H17 tại C17 So với cholesterol thì hợp chất này có thêm một nhóm methyl ở C24 của dây nhánh ngoài vòng, các hợp chất có cùng đặc điểm cấu trúc với nhánh như vậy gọi là những hợp chất ergostan Điểm nóng chảy: 103oC (điều kiện thường)

Hình 2.3: Ergosterol

1 2 3

7 8

9 10

13

16 17 18

27

1 2 3

8

9 10

13

16 17 18

Chương 2: Steroid

SVTH: Lê Thành Việt Tân 8

Stigmasterol: là sterol thực vật, cô lập từ dầu đậu nành và nhiều loại thực vật

khác Công thức phân tử C29H48O, có 1 nhóm –OH tại C3, 2 nối đôi giữa C5 và C6,

C22 và C23, 2 nhóm –CH3 tại gốc C10 và C13, 1 dây hydrocarbon –C10H19 tại C17 So với cholesterol, hợp chất này có thêm 1 nối đôi ở C22 và một nhóm methyl ở C24 Điểm nóng chảy: 170oC (điều kiện thường)

Hình 2.4: Stigmasterol

2 3 Một số loại Steroid khác [1]

Hormon steroid: hormon là những chất do những tuyến đặc hiệu tiết ra, chúng điều khiển các quá trình trong cơ thể, dù với lượng rất nhỏ vẫn gây ra những phản ứng sinh lý Trong cơ thể người có các hormon sinh dục:

Hormon sinh dục nữ: Estrogen: estradiot, estron, estriol, equilenin…

1 2 3

8

9 10

13

16 17 18

Chương 2: Steroid

SVTH: Lê Thành Việt Tân 9

Không có phương pháp nào đặc trưng để chỉ tách steroid ra khỏi bột cây Sử dụng các dung môi hữu cơ nêu trên để chiết tách chúng ra khỏi cây cỏ và tiếp theo

sử dụng các kỹ thuật sắc ký cột để tách riêng các hợp chất

Các steroid thường kết hợp với lipid, caroten, lecithin Do các sterol sẽ hòa tan tốt trong dung môi petroleum ether 60 – 90, nên sterol sẽ ở chung với cao chiết này Muốn loại bỏ các chất béo, tách riêng sterol ra khỏi cao PE có thể thực hiện việc xà phòng hóa theo sơ đồ hình 2.5

Hình 2.5: Quy trình tách chiết riêng các sterol ra khỏi cao PE chứa nhiều chất béo

Dung dịch nước kiềm

Tận chiết với PE trong máy Soxhlet Thu hồi dung môi

Bột cây

Cao PE KOH/ancol đun hoàng lưu cách thủy 3 giờ Rót hỗn hợp phản ứng vào becher có sẵn nước

Cao PE đã loại bỏ phần xà phòng hóa

Sắc ký cột

Tách riêng các hợp chất sterol, các chất hữu cơ

Chương 2: Steroid

SVTH: Lê Thành Việt Tân 10

2.5 Một số đại diện thiên nhiên

a Cholic acid b Litocolic acid

c Cortison d Progesteron

e Aldosteron f Estron

Hình 2.6: Một số đại diện thiên nhiên của Steroid

1 2 3

8 9 10

13

16 17

HO

1 2

3

8

9 10

11 12 13

16 17 18

8

9 10

13

16 17 18

8

9 10

12 13

16 17 18

12 13

16 17 18

12 13

16 17 18

CHƯƠNG 3: CƠ SỞ LÝ THUYẾT VÀ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

3.1 Các kỹ thuật chi t tách ch t ra kh i cây [3]

Có nhiều cách để chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi cây cỏ Song các kỹ thuật này đều xoay quanh hai phương pháp chính là chiết lỏng – lỏng và chiết rắn – lỏng

3.1.1 Kỹ thuật chi t l ng – l ng

Nguyên tắc của sự chiết lỏng – lỏng là dung môi không phân cực sẽ hòa tan tốt các hợp chất không phân cực, dung môi phân cực trung bình sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình và dung môi phân cực mạnh sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực mạnh

Việc chiết lỏng – lỏng được thực hiện bằng bình lóng, trong đó cao alcol thô ban đầu được hoà tan vào pha nước Sử dụng lần lượt các dung môi hữu cơ, loại không hoà tan với nước hoặc loại có thể hỗn hợp được với nước để chiết ra khỏi pha nước các hợp chất có tính phân cực khác nhau (tuỳ vào độ phân cực của dung môi) Tùy vào tỷ trọng so sánh giữa dung môi và nước mà pha hữu cơ có thể nằm ở lớp trên hoặc ở dưới so với pha nước

Việc chiết được thực hiện lần lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung môi phân cực như: etroleum ether 60 – 90, hexane, chloroform, ethyl acetate, buthanol… Với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết được thực hiện nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung môi, chiết đến khi không còn chất hòa tan vào dung môi thì đổi sang chiết với dung môi có tính phân cực hơn Dung dịch của các lần chiết được gom chung lại, làm khan nước với các chất làm khan như Na2SO4, CaSO4…, đuổi dung môi sẽ thu được cao chiết

Sự chiết bởi một dung môi cụ thể nào đó được gọi là hoàn tất khi lần chiết thứ

n trên bản mỏng không còn nhìn thấy vết của chất đó trong pha nước cũng như trong pha hữu cơ Cũng có thể kiểm tra bằng cách nhỏ một giọt dung dịch chiết lần thứ n lên trên một tấm kiếng sạch, sau khi bay hơi hết dung môi nếu không còn để lại vết gì trên mặt kiếng chứng tỏ đã chiết kiệt

Điều cần lưu ý là quá trình chiết lỏng – lỏng được thực hiện ở nhiệt độ phòng, nếu gia tăng nhiệt độ cho dung môi thì khả năng hòa tan của dung môi sẽ tăng lên

và nguyên tắc nêu trên sẽ có nhiều thay đổi

Chương 3: Cơ sở lý thuyết và một số phương pháp thực nghiệm

SVTH: Lê Thành Việt Tân 12

Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng có nhược điểm là do phải lắc bình lóng nhiều lần nên ở những lần chiết sau dung môi trong bình lóng tạo nhũ tương, gây khó khăn trong việc tách pha thành hai lớp Khi dung môi trong bình lóng tạo nhũ tương có thể sử dụng một đũa thủy tinh dài đưa vào trong bình lóng, khuấy nhẹ dung dịch hoặc cọ xát nhẹ vào thành bình, chỗ mặt thoáng của dung dịch nhằm phá vỡ các bọt khí để dung dịch nhanh chóng phân thành hai lớp Cũng có thể phá bọt bằng cách ly tâm dung dịch…

3.1.2 Kỹ thuật chi t rắn – l ng

Kỹ thuật chi t ng m kiệt

Hình 3.1: Kỹ thuật chiết ngấm kiệt Phương pháp này được sử dụng khá phổ biến vì không đòi hỏi thiết bị tốn kém, phức tạp

Dụng cụ: gồm một bình ngấm kiệt bằng thủy tinh, hình trụ đứng, dưới đáy bình là một van khóa để điều chỉnh vận tốc của dung dịch chảy ra, một bình chứa đặt bên dưới để hứng dung dịch chiết Phía trên cao của bình ngấm kiệt là bình lóng

để chứa dung môi tinh khiết

Bột cây được xay thô đạt kích cỡ thích hợp Mẫu không nên to vì sẽ chiết không kiệt, mẫu xay quá mịn sẽ cản trở dòng chảy Đáy của bình ngấm kiệt được lót

Chương 3: Cơ sở lý thuyết và một số phương pháp thực nghiệm

SVTH: Lê Thành Việt Tân 13

bằng bông thủy tinh và một tờ giấy lọc Bột cây được đặt vào bình, lên trên lớp bông thủy tinh, lên gần đầy bình Đậy bề mặt lớp bột bằng một tờ giấy lọc và chặn lên bằng những viên bi thủy tinh để cho dung môi không làm xáo trộn bề mặt lớp bột Từ từ rót dung môi cần chiết vào bình cho đến khi dung môi phủ xấp xấp phía trên lớp mặt Có thể sử dụng dung môi nóng hoặc nguội

Để yên sau một thời gian, thường là 12 – 24 giờ Mở van bình ngấm kiệt cho dung dịch chiết chảy ra từng giọt và đồng thời mở khóa bình lóng để dung môi tinh khiết chảy xuống bình ngấm kiệt Điều chỉnh sao cho vận tốc dung môi tinh khiết chảy vào bình ngấm kiệt bằng với vận tốc dung dịch chiết chảy ra khỏi bình này Hiệu quả phương pháp: phương pháp này đòi hỏi thiết bị tương đối phức tạp nhưng hiệu suất cao, ít mất công, vì đây là quá trình chiết liên tục, dung môi trong bình ngấm kiệt đã bão hòa mẫu chất sẽ được liên tục thay thế bằng dung môi tinh khiết

Kỹ thuật chi t ngâm dầm

Hình 3.2: Kỹ thuật chiếc ngâm dầm

Kỹ thuật chiết ngâm dầm tương tự như kỹ thuật chiết ngấm kiệt nhưng không đòi hỏi thiết bị phức tạp, vì thế có thể dễ dàng thao tác với một lượng lớn mẫu cây Ngâm bột cây trong một bình chứa bằng thủy tinh, bình có nắp đậy Tránh sử dụng bình bằng nhựa vì dung môi hữu cơ có thể hòa tan một ít nhựa, gây nhầm lẫn

là hợp chất có chứa trong cây

Rót dung môi tinh khiết vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của lớp bột cây Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên Sau đó, dung dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc, thu hồi dung môi sẽ thu được cao chiết

Chương 3: Cơ sở lý thuyết và một số phương pháp thực nghiệm

SVTH: Lê Thành Việt Tân 14

Tiếp theo, rót dung môi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục quá trình chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây

Có thể gia tăng hiệu quả sự chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xốc đều lớp bột cây hoặc có thể gắn vào máy lắc để lắc nhẹ (chú ý nắp bình bị bung ra làm dung dịch chiết bị trào ra ngoài)

Mỗi lần ngâm dung môi chỉ cần 24 giờ là đủ, vì với một lượng dung môi cố định trong bình, mẫu chất chỉ hòa tan vào dung môi đến khi đạt mức bão hòa, không thể thêm được nhiều hơn nên có ngâm thời gian lâu hơn cũng không tăng được hiệu suất quá trình

Dung môi sau khi thu hồi được làm khan nước bằng các chất làm khan và được tiếp tục sử dụng để chiết các lần sau

3.2 Một số thủ thuật khi cô lập các hợp ch t hữu cơ

3.2.1 Làm khô mẫu ch t

Sau khi làm chiết mẫu cây bằng dung môi, lọc, thu hồi dung môi thu được cao

Cao chiết thu được cần phải làm khô vì các lý do sau:

Các hợp chất trong cao sẽ ổn định bền nếu chúng hiện diện ở trạng thái khô hơn là ở trạng thái lỏng

Để tính đúng hiệu suất của cao chiết so với lượng cây thô ban đầu

Để tiếp tục tinh chế cao bằng sắc ký cột: biết lượng cao để lấy lượng silica gel cần thiết cho sắc ký cột

 Nếu mẫu là hợp chất tinh khiết muốn ghi các số liệu phổ thì mẫu cần được sấy khô, nếu còn lẫn vết nước, trên phổ đồ xuất hiện tính hiệu của nước gây khó khăn trong việc giải đoán cấu trúc

Các phương pháp làm khô mẫu

Sấy khô bằng khí trơ trong máy cô quay chân không: khi cô quay chân không, đến lúc mẫu đã khô hoàn toàn, cho một luồng khí trơ đi vào máy, đi nhè nhẹ từ đầu trên của máy cô quay (tại đầu trên của máy, chổ đóng – mở áp suất để tạo chân không cho máy, cho khí vào bằng ngõ này)

Sấy khô bằng bình hút ẩm: mẫu cần làm khô được đặt trong một becher, miệng của becher được đậy bằng một tờ giấy lọc, trên bề mặt tờ giấy lọc tạo một số

lỗ nhỏ Đặt becher vào bình hút ẩm, đậy nắp bình lại Cho máy bơm hút hoạt động cho đến khi thấy mẫu chất khô thì ngừng máy

Chương 3: Cơ sở lý thuyết và một số phương pháp thực nghiệm

SVTH: Lê Thành Việt Tân 15

3.2.2 Sự k t tinh lại

Trong hóa học các hợp chất thiên nhiên, một mẫu chất được gọi là tinh khiết

để xác định cấu trúc hóa học thì độ tinh khiết của hợp chất cần phải lớn hơn 95% Hợp chất càng tinh khiết thì việc xác định cấu trúc càng chính xác

Để đạt được hợp chất có độ tinh khiết càng cao, công việc thực hiện càng khó khăn, phức tạp Trước tiên, khởi đầu từ cao chiết thô để loại bỏ những chất không cần thiết; kế đến, từ những phân đoạn nhỏ, muốn cô lập hợp chất có độ tinh khiết 95% phải tốn công sắc ký nhiều lần Nâng cao độ tinh khiết từ 95 lên 99,5% là rất khó Không có hợp chất nào tinh khiết 100%

Các hợp chất cô lập được sau quá trình sắc ký cột, khi quan sát bằng mắt thường ta thấy chúng ở dạng bột trắng, đôi khi là tinh thể không màu, khi sắc ký lớp mỏng với nhiều hệ dung môi khác nhau vẫn cho một vết tròn gọn đẹp nhưng thực ra

độ tinh khiết của chúng cũng chỉ từ 90 đến 95%, nguyên nhân là do một tinh thể của một hợp chất nếu quan sát được bằng mắt thường là gồm nhiều phân tử của các hợp chất đó kết hợp lại với nhau, chúng cũng gom luôn một ít tạp bẩn từ môi trường bên ngoài và lượng này khá ít nên không thể nhìn thấy được

Với độ tinh khiết từ 90 – 95%, việc xác định cấu trúc bằng các phương pháp hóa lý sẽ kém hiệu quả Do vậy, việc kết tinh lại hợp chất là rất cần thiết

3.3 Các phương pháp sắc ký [3]

3.3.1 Sắc k cột

Sắc ký cột hở được tiến hành ở áp suất khí quyển Pha tĩnh là chất hấp phụ, mẫu chất cần phân tích được nạp lên đầu cột, phía trên pha tĩnh Pha động là các dung môi giải ly cột Tùy theo tính chất của chất được sử dụng nhồi cột mà sự tách trong cột sẽ xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ (cột hấp phụ), cơ chế phân bố (cột phân bố), trao đổi ion (cột trao đổi ion), Trong luận văn chỉ trình bày sắc ký cột hấp phụ vì đây là phương pháp sắc ký cột chủ yếu chúng tôi sử dụng trong đề tài

3.3.1.1 Nguyên tắc

Sắc ký hấp phụ được tiến hành trên một cột thủy tinh thẳng đứng gọi là “cột” với chất hấp phụ đóng vai trò pha tĩnh, dung môi rửa cột là pha động chảy qua chất hấp phụ

Đối với mỗi chất riêng biệt trong hỗn hợp cần tách, tùy theo khả năng hấp phụ

và khả năng hòa tan của nó đối với dung môi rửa cột để lấy ra được lần luợt trước hoặc sau