b. Nhận xét về nội dung của LVTN ( Đề nghị ghi chi tiết đầy đủ):
4.4 Phƣơng pháp nghiên cứu
4.4.1 Phƣơng pháp chiết tách
Lá Bằng lăng sau khi thu hái, được xử lý, rửa sạch, phơi khô tự nhiên, xay nhuyễn, sau đó ngâm với dung môi methanol khoảng 24 giờ. Thu dịch chiếc đem cô quay thu hồi dung môi thu được cao tổng methanol.
Từ cao tổng methanol ban đầu, dùng phễu chiết lỏng – lỏng với các dung môi chloroform, ethyl acetate, cô quay thu hồi dung môi thu được các cao chloroform và cao ethyl acetate.
Chương 4:Địa điểm,thời gian, phương tiện và phương pháp nghiên cứu
SVTH: Lê Thành Việt Tân 25
4.4.2 Phân lập các hợp chất hữu cơ
Để phân lập được các hợp chất hữu cơ tinh khiết từ cây cỏ thì phương pháp chủ yếu là dùng sắc ký cột song song với sắc ký lớp mỏng để theo dõi. Sắc ký lớp mỏng sẽ cho dự đoán chất được tách đã tinh khiết hay chưa.
Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất cô lập được. Ghi phổ 1
H-NMR, 13C-NMR, DEPT-NMR, tại phòng máy NMR, viện Hóa học, Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia, Hà Nội với tần số 500 MHz cho phổ 1H và 125 MHz cho phổ 13C.
Xác định điểm nóng chảy của hợp chất thu được. Ghi phổ IR.
CHƯƠNG 5: THỰC NGHIỆM
5.1 Nguyên liệu
Mẫu lá Bằng lăng nước Lagerstroemia speciosa được thu hái tại huyện Cù Lao Dung, tỉnh Sóc Trăng. Tổng khối lượng lá thu được là 6,9 kg.
Lá sau khi thu hái đem về được xử lý, loại bỏ những phần sâu bệnh, héo úa, rửa sạch, được phơi khô tự nhiên và xay nhuyễn.
5.2. Điều chế các loại cao
5.2.1 Điều chế cao tổng methanol:
Lá Bằng lăng được xay nhuyễn, bỏ vào túi vải buộc kín miệng và được ngâm vào dung môi methanol trong bình thủy tinh 5 lít, ở nhiệt độ phòng. Tổng cộng quá trình chiết với methanol đã sử dụng hết 9 lít methanol. Khối luợng mẫu lá khô xay nhuyễn là 1,7 kg. Đem dịch chiết thu được cô quay thu hồi dung môi thu được cao tổng methanol. Khối luợng cao tổng methanol thu được là 98 g.
Chương 5: Thực nghiệm
SVTH: Lê Thành Việt Tân 27
Thu suất cao methanol tổng so với khối luợng bột lá:
Lá xay nhuyễn cho vào túi vải buộc kín miệng
Cô quay thu hồi dung môi
Cho túi vào bình thủy tinh ngâm với methanol khoảng 24 giờ Bằng lăng 1,7 kg bột Cao tổng Methanol 98 g
Hình 5.2: Điều chế cao tổng methanol 5,77 %
Chương 5: Thực nghiệm
SVTH: Lê Thành Việt Tân 28
5.2.2 Điều chế cao chloroform
Từ cao tổng methanol đem pha với nuớc, cất lọc qua giấy lọc để loại cặn. Dịch cao tổng methanol được chiết lỏng – lỏng với dung môi chloroform thu phần dung dịch lớp dưới (trích nhiều lần bằng bình chiết, cho tới lúc phần lớp dung dịch phía dưới trong thì ngưng). Phần dung dịch lớp dưới được đem cô quay thu hồi dung môi, thu đuợc cao chloroform. Khối luợng cao chloroform thu được là 21,65 g.
Thu suất cao chloroform so với cao methanol tổng.
Hình 5.3: Điều chế cao chloroform Pha nước, lọc cặn,
chiết với chloroform Cao tổng
methanol 98g
Cao chloroform 21,65 g
Lớp dưới, cô quay thu hồi dung môi
Chương 5: Thực nghiệm
SVTH: Lê Thành Việt Tân 29
5.2.3 Điều chế cao ethyl acetate
Lấy phần lớp trên dịch chiết trong bình lóng sau khi chiết với dung môi chloroform đem chiết tiếp với dung môi ethyl acetate bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng thu lấy phần trên. Phần dung dịch lớp trên đem cô quay thu hồi dung môi thu được cao ethyl acetate. Khối lương cao ethyl acetate thu được là 13 g.
Thu suất cao ethyl acetate so với cao tổng methanol:
Lớp trên cao tổng
Cao ethyl acetate
Chiết tiếp với ethyl acetate
Thu lớp trên, cô quay thu hồi DM
Hình5.4: Điều chế cao ethyl acetate 13,27 %
Chương 5: Thực nghiệm
SVTH: Lê Thành Việt Tân 30
5.3 Sắc ký cột cao Chloroform
Cao C được điều chế từ quá trình chiết lỏng – lỏng cao tổng methanol với dung môi chloroform, khối luợng cao thu được là 21,65 g. Tiến hành sắc ký cột cao choloroform theo dõi đồng thời bằng sắc ký lớp mỏng, để gom các lọ có vết giống nhau thành từng phân đoạn.
Chiết lỏng – lỏng với chloroform. Lấy lớp dưới, cô quay thu hồi DM.
Lớp trên
Cao ethyl acetate 13 g
Lớp dưới Rửa sạch, loại bỏ lá sâu bệnh, héo úa. Phơi khô tự nhiên xay nhuyễn bột lá. Cho lá vào túi vải, buộc kín miệng cho vào lọ thủy tinh 5l ngâm với methanol, thu dịch chiết đem cô quay thu hồi dung môi.
Chiết lỏng – lỏng với ethyl acetate. Lấy lớp trên, cô quay thu hồi DM. Cao chloroform 21,65 g Cao tổng methanol 98 g Lá Băng lăng 1,7 kg (bột lá)
Chương 5: Thực nghiệm
SVTH: Lê Thành Việt Tân 31
Kích thước cột: chiều dài: 85 cm, đường kính: 5 cm
Nạp chất hấp phụ là silica gel Merck, khối luợng silica gel được nạp vào cột là 150 g.
Silica gel truớc khi nhồi cột được sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ khoảng 110o
C trong 15 phút, lấy ra để nguội, cho trương nở trong petroleum ether 60 – 90 khoảng 30 phút và nạp vào cột theo phương pháp nạp cột uớt.
Cao C truớc khi nạp vào cột được chấm lên lớp mỏng và giải ly với nhiều hệ dung môi khác nhau. Sau đó, cao được tiền hấp phụ với khoảng 10 g silica gel. Dung môi giả ly cột sắc ký cao C đầu tiên được lựa chọn bằng kết quả trên lớp mỏng là PE : EA với tỉ lệ 8:2.
Cột sau khi nạp mẫu hứng mỗi lọ 100 ml, dung môi trong lọ được cô quay thu hồi, chất được hút ra lọ bi riêng. Dùng sắc ký lớp mỏng theo dõi, những lọ nào có vết giống nhau thì gom chung với nhau thành một phân đoạn.
Thuốc hiện hình sử dụng là H2SO4 đậm đặc trong methanol (với tỉ lệ 2:8). Lớp mỏng sau khi nhúng thuốc hiện hình được gia nhiệt trên bếp điện.
Các hệ dung môi đã sử dụng để giải ly cột là: PE : EA (8:2), PE : EA (1:1), EA 100 %.
Chương 5: Thực nghiệm
SVTH: Lê Thành Việt Tân 32
Bảng 5.1: Kết quả sắc ký cột cao C PĐ STT lọ SKC SKLM Kết quả SKLM Dạng chất KL (g) BL.C01 P01–P02 PE : EA 8:2 PE : EA
1:1 Nhiều vết Màu đen 0,9
BL.C02 P03–P17 " " Nhiều vết Màu xanh 1,3
BL.C03 P18–P20 " " Nhiều vết Màu xanh 0,6
BL.C04 T01– T07 PE : EA 1:1
PE : EA 3:2
Nhiều vết Xanh nhạt 0,4
BL.C05 T08 – T10 " " Nhiều vết Màu xanh 5,8
BL.C06 T11 – T35 " PE : EA 3:2 Nhiều vết, có 3 vết chính:tím, xanh, xám Trắng xanh 4 BL.C07 T37 – T42 " EA 100% Nhiều vết Vàng nhạt 1,2 BL.C08 E01 – E02 100% EA C : ME 9:1 Nhiều vết Vàng nhạt 0,1 BL.C09 E03 – E41 " " Nhiều vết Vàng nâu 0,8 BL.C10 E42 – E58 " " Nhiều vết Vàng nâu 0,5
Tổng cộng khối luợng của các phân đoạn là: 15,6 g Thu suất quá trình sắc ký cột cao C:
Chương 5: Thực nghiệm
SVTH: Lê Thành Việt Tân 33
Nhận xét: sắc ký cột cao chloroform thu đuợc tổng cộng 10 phân đoạn, các phân đoạn có vết đặc trưng và rõ ràng được chúng tôi chọn khảo sát tiếp. Các phân đoạn còn lại do vấn đề về thời gian nên tạm thời chưa khảo sát. Qua quá trình sắc ký cột cao chloroform chúng tôi chọn phân đoạn BL.C06 để xử lý tiếp.
5.4 Sắc ký cột phân đoạn BL.C06
Phân đoạn BL.C06 thu được từ lọ T11 – T35 khi sắc ký cột cao chloroform. Phân đoạn có dạng tinh thể màu trắng xanh có khối luợng 4 g. Sắc ký lớp mỏng phân đoạn BL.C06 với hệ giải ly PE : EA (3:2) thấy có 3 vết chính: 1 vết màu tím Rf
=0,58, 1 vết màu xanh Rf= 0,41 và một vết màu xám Rf = 0,2. Phân đoạn được xử lý trên cột nhỏ dài 51 cm, đường kính 3 cm, khối luợng silica gel dùng là 40 g. Dung môi giải ly cột đầu tiên là PE : EA (9:1). Chất chạy ra khỏi cột được hứng vào các lọ bi riêng biệt, kiểm tra vết bằng sắc ký lớp mỏng. Các lọ bi cho vết giống nhau được gom chung lại để tiếp tục xử lý. Tổng cộng khối luợng của các phân đoạn là: 3,356 g. Kết quả được trình bày ở bảng 5.2:
Chương 5: Thực nghiệm
SVTH: Lê Thành Việt Tân 34
Bảng 5.2: Kết quả sắc ký cột phân đoạn BL.C06
PĐ STT lọ SKC SKLM Kết quả SKLM Dạng chất KL (g) I1C6 I1 PE : EA 9:1 C 100% Nhiều vết Xanh lá 0,003 I2C6 I2 – I4 " " Nhiều vết Vàng nâu 0,18 I3C6 I5 – I6 " " Nhiều vết Vàng nâu 0,226 I4C6 I7 – I17 " " Nhiều vết Vàng nhạt 1,098 I5C6 I18 – I28 " C 100% Nhiều vết, 3 vết chính: tím nhạt, nâu, tím Trắng xanh 1,073 I6C6 I29 – I44 PE:EA 7:3 " Nhiều vết Vàng nhạt 0,425 I7C6 I45 – I57 " " Nhiều vết Vàng nhạt 0,026 I8C6 I58 – I59 EA 100% " Nhiều vết Vàng nhạt 0,011 I9C6 I60 – I79 " " Nhiều vết Vàng nâu 0,241 I10C6 I80 – I95 " " Nhiều vết Nâu 0,063
Chương 5: Thực nghiệm
SVTH: Lê Thành Việt Tân 35
Từ kết quả sắc ký lớp mỏng chúng tôi quyết định khảo sát tiếp phân đoạn I5C6. Sử dụng cột sắc ký có kích thước: Đường kính 1,5 cm, dài 33,5 cm.
Lượng silica gel dùng: 10 g.
Qua quá trình làm sạch nhiều lần bằng sắc ký cột song song với sắc ký lớp mỏng để kiểm tra độ tinh sạch của các phân đoạn thu được bằng các dung môi PE : EA (9:1), PE : EA (8:2), PE : EA (7:3), thu được kết quả của phân đoạn thu được chất sạch phía sau phân đoạn I5C6 được trình bày ở bảng 5.3.
Bảng 5.3: Kết quả sắc ký cột phân đoạn thu được chất sạch phía sau I5C6
PĐ STT lọ SKC Kết quả
SKLM Dạng chất (mg) KL
LBL.C0 M0 – M5 PE : EA
(9:1) Vết tạp Vàng nhạt 6
LBL.C1 M6 – M15 PE : EA
(8:2) Vết tròn tím kim, màu trắng Tinh thể hình 15
LBL.C2 M16 – M20
PE : EA
(7:3) Tím kéo vệt Tinh thể vàng nhạt 8 Từ phân đoạn LBL.C1 ta thu được một hợp chất tinh khiết có tinh thể hình kim, màu trắng, tạm gọi tên hợp chất là LBL.C1
5.5 Xác định cấu trúc hợp chất thu được
Chương 5: Thực nghiệm
SVTH: Lê Thành Việt Tân 36
5.5.1 Đặc điểm của hợp chất
Vết tròn màu tím nhạt, dung môi giải ly bản mỏng PE : EA (8:2), Rf= 0,27 Tinh thể dạng hình kim, màu trắng.
Tan tốt trong chloroform.
Nhiệt độ nóng chảy: 169 – 170C
5.5.2 Xác định cấu trúc của hợp chất LBL.C1
Một số thông tin nhận được từ phổ 1
H–NMR (bảng 5.4): phổ 1H–NMR cho thấy ở: 5,35 ppm (1H ,m, có chứa H – olefin, –CH=, H–6), 5,15 ppm (1H, dd, J1’= 15 Hz, J2’ = 8,5 Hz, có chứa H – olefin, –CH= , H–22), 5,02 ppm (1H, dd, J1” = 15 Hz, J2” = 9 Hz, có chứa H – olefin, –CH=, H–23), 3,52 ppm (1H, m, có thể là liên kết >CH–OH, H–3). Phần lớn tín hiệu xuất hiện ở vùng từ trường cao 0,6 – 2,31 ppm là những liên kết của hydro bão hòa (>CH–, >CH
2, –CH
3). Một số thông tin từ phổ 13
C–NMR và phổ DEPT–NMR (bảng 5.4 ): Có 29 C trong đó có: 3C tứ cấp, 11C methin, 9C methylene, 6C methyl. Có tín hiệu ở 140,8 ppm ( >C=, C–5), 138,3 ppm (–CH=, C–22), 129,3 ppm (–CH=, C–23) và 121,7 ppm (–CH=, C–6), Có tín hiệu ở 71,8 ppm là của C gắn với nhóm rút điện tử mạnh, có thể là >CH–OH.
Từ những thông tin trên, chúng tôi dự đoán LBL.C1 là một sterol có hai nối đôi nên chúng tôi tiến hành so sánh với phổ chuẩn của stigmasterol (bảng 5.4).
Hình 5.9: SKLM chất LBL.C1 Hình 5.10: SKLM so sánh trong ba hệ dung môi giải ly PE : EA chất LBL.C1 với cao C (8:2), C 100%, PE : EA (6:4)
Chương 5: Thực nghiệm
SVTH: Lê Thành Việt Tân 37
Bảng 5.4: So sánh số liệu phổ của hợp chất LBL.C1 với tài liệu [8]
Vị trí C Loại cacbon LBL.C1 13 C-NMR [8] Stigmasterol 1 H-NMR DEPT 90 DEPT 135 13C-NMR
1 –CH2– Biến mất Mũi âm 37,28 37,28
2 –CH2– Biến mất Mũi âm 28,92 28,93
3 –CH< 3,52 m Mũi dương Mũi dương 71,82 71,83
4 –CH2– Biến mất Mũi âm 39,70 39,71
5 >C= Biến mất Biến mất 140,8 140,78
6 –CH= 5,35 m Mũi dương Mũi dương 121,7 121,73
7 –CH2– Biến mất Mũi âm 31,68 31,69
8 –CH< Mũi dương Mũi dương 31,89 31,90
9 –CH< Mũi dương Mũi dương 50,18 50,19
10 >C< Biến mất Biến mất 36,53 36,53
11 –CH2– Biến mất Mũi âm 21,09 21,12
12 –CH2– Biến mất Mũi âm 42,32 42,35
13 >C< Biến mất Biến mất 42,23 42,33
14 –CH< Mũi dương Mũi dương 56,89 56,89
15 –CH2– Biến mất Mũi âm 24,38 24,38
16 –CH2– Biến mất Peak âm 28,92 28,96
17 –CH< Mũi dương Mũi dương 55,98 55,99
Chương 5: Thực nghiệm
SVTH: Lê Thành Việt Tân 38
19 –CH3 Biến mất Mũi dương 12,06 12,07
20 –CH< Mũi dương Mũi dương 40,50 40,49
21 –CH3 Biến mất Mũi dương 21,23 21,20
22 –CH= 5,15 dd
J = 15; 8,5 Hz
Mũi dương Mũi dương 138,3 138,33
23 –CH= 5,02 dd
J = 15; 9 Hz
Mũi dương Mũi dương 129,3 129,32
24 –CH< Mũi dương Mũi dương 51,25 51,26
25 –CH< Mũi dương Mũi dương 31,92 31,90
26 –CH3 Biến mất Mũi dương 18,99 21,23
27 –CH3 Biến mất Mũi dương 18,99 18,80
28 –CH2– Biến mất Mũi âm 25,41 25,42
29 –CH3 Biến mất Mũi dương 12,26 12,25
Các số liệu so sánh đều trùng khớp với độ dịch chuyển của phổ 1H-NMR và phổ 13
C-NMR của hợp chất stigmasterol, theo tài liệu [8] công bố, nên chúng tôi dự đoán hợp chất LBL.C1 là Stigmasterol, có công thức C29H48O.
Trên đây là cấu trúc của Stigmasterol (LBL.C1). Stigmasterol là một trong những thành phần chính của phytosterol, có tác dụng giảm luợng cholesterol trong máu, kháng viêm, dùng trong tổng hợp progesterone, và là tiền chất của vitamin D3.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 HO 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 H H
CHƯƠNG 6: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
6.1 Kết luận
Từ lượng bột lá Bằng lăng nước (1,7 kg bột lá) chúng tôi điều chế được cao tổng methanol có khối lượng là 98 g.
Điều chế được cao chloroform có khối lượng 21,65 g, cao ethyl acetate 13 g. Từ cao C chúng tôi thu được 10 phân đoạn nhỏ. Sau đó xử lý tiếp phân đoạn BL.C06 thu được từ lọ T11 – T35 trong quá trình sắc ký cột cao chloroform. Phân đoạn có dạng tinh thể màu trắng xanh có khối luợng 4 g. Sắc ký lớp mỏng phân đoạn BL.C06 với hệ giải ly PE : EA (3:2) thấy có 3 vết chính: 1 vết màu tím Rf
=0,58, 1 vết màu xanh Rf = 0,41 và một vết màu xám Rf = 0,2. Tiếp tục xử lý phân đoạn I5C6 thu được từ việc sắc ký ccột phân đoạn BL.C06 và các phân đoạn nhỏ hơn của I5C6 chúng tôi thu được một hợp chất tinh khiết có tinh thể hình kim, màu trắng, tạm gọi tên hợp chất là LBL.C1
Ghi phổ 1
H-NMR, 13C-NMR, DEPT-NMR hợp chất thu được, tại phòng máy NMR, viện Hóa học, Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia, Hà Nội với tần số 500 MHz cho phổ 1
H và 125 MHz cho phổ 13C. Dựa vào các thông tin có được từ phổ 1
H-NMR, 13C-NMR, DEPT-NMR, đem so sánh các số liệu với phổ chuẩn của stigmasterol trong tài liệu [8], chúng tôi đã định danh được hợp chất tạm gọi là LBL.C1 chính là stigmasterol.
Phân lập được hợp chất stigmasterol từ cao chloroform của lá Bằng lăng nước
Lagerstroemia speciosa. Stigmasterol là một trong những thành phần chính của phytosterol, có tác dụng giảm luợng cholesterol trong máu, kháng viêm, dùng trong tổng hợp progesterone và là tiền chất của vitamin D3.
6.2 Kiến nghị
Hợp chất trong lá Bằng lăng nước rất phong phú và đa dạng. Do hạn chế về thời gian nên chỉ khảo sát được một phân đoạn trên cao chloroform. Do vậy, cần tiếp tục khảo sát các phân đoạn khác của cao C và các cao còn lại.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Tôn Nữ Liên Hương, Bài giảng Hóa học hợp chất thiên nhiên, 2008, Trường Đại học Cần Thơ.
2. Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam tập II, 2000, NXB trẻ.
3. Nguyễn Kim Phi Phụng, Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ , 2007, NXB