b. Nhận xét về nội dung của LVTN ( Đề nghị ghi chi tiết đầy đủ):
3.3 Các phƣơng pháp sắc ký
Sắc ký cột hở được tiến hành ở áp suất khí quyển. Pha tĩnh là chất hấp phụ, mẫu chất cần phân tích được nạp lên đầu cột, phía trên pha tĩnh. Pha động là các dung môi giải ly cột. Tùy theo tính chất của chất được sử dụng nhồi cột mà sự tách trong cột sẽ xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ (cột hấp phụ), cơ chế phân bố (cột phân bố), trao đổi ion (cột trao đổi ion),... Trong luận văn chỉ trình bày sắc ký cột hấp phụ vì đây là phương pháp sắc ký cột chủ yếu chúng tôi sử dụng trong đề tài.
3.3.1.1 Nguyên tắc
Sắc ký hấp phụ được tiến hành trên một cột thủy tinh thẳng đứng gọi là “cột” với chất hấp phụ đóng vai trò pha tĩnh, dung môi rửa cột là pha động chảy qua chất hấp phụ.
Đối với mỗi chất riêng biệt trong hỗn hợp cần tách, tùy theo khả năng hấp phụ và khả năng hòa tan của nó đối với dung môi rửa cột để lấy ra được lần luợt trước hoặc sau.
Chương 3: Cơ sở lý thuyết và một số phương pháp thực nghiệm
SVTH: Lê Thành Việt Tân 16
3.3.1.2 Lựa chọn chất hấp phụ, dung môi giải ly cột, cột sắc ký
Lựa chọn ch t h p phụ: chất hấp phụ dùng trong sắc ký cột thuờng dùng là oxyt nhôm, silica gel, CaCO3, polyamid,… Các chất này phải được tiêu chuẩn hóa. Silica gel là pha tĩnh được sử dụng rộng rãi nhất để tách các hợp chất tự nhiên. Tùy thuộc vào tính phân cực của mẫu chất cần tách mà ta lựa chọn chất hấp phụ cho phù hợp. Trong bài luận văn này tôi chọn chất hấp phụ là silica gel.
Lựa chọn dung môi giải ly cột: trước khi tiến hành sắc ký cột phải tiến hành sắc ký lớp mỏng để chọn ra dung môi giải ly cột cho phù hợp. Thứ tự dung môi giải ly sẽ bắt đầu từ dung môi không phân cực, dung môi ít phân cực và sau cùng là dung môi có độ phân cực cao. Dung môi sử dụng phải có tính trung tính, không độc, không quá dễ cháy, hòa tan được hợp chất cần khảo sát. Trong sắc ký cột có thể dùng từng loại dung môi hoặc hỗn hợp nhiều dung môi với tỷ lệ thích hợp.
Lựa chọn cột sắc k : cột là những ống hình trụ bằng thủy tinh, đầu duới có khóa, đầu trên có nút mài để nối với một phễu chứa dung môi, loại này thuờng bán sẵn trên thị truờng với nhiều kích cỡ khác nhau. Ngoài ra, cột cũng có thể tự lắp bằng một ống thủy tinh thuờng, đầu dưới nhỏ nối với một ống cao su, dùng một khóa kim loại để điều chỉnh tốc độ chảy của dung môi. Trước khi tiến hành sắc ký cột cần phải tìm ra cột có kích thước phù hợp. Điều này là rất quan trọng bởi vì hiệu quả của việc tách chất phụ thuộc nhiều vào lượng chất cần tách, chất hấp phụ và kích thước cột. Ta có các mối tương quan:
Tỷ lệ giữa lượng mẫu cần tách và lượng chất hấp phụ sử dụng: các khảo sát thực nghiệm cho thấy muốn tách chất tốt thì trọng lượng của chất hấp phụ phải lớn hơn 25 – 50 lần trọng lượng của mẫu sắc ký. Tuy nhiên, đối với những hỗn hợp mẫu chất khó tách riêng thì cần sử dụng lượng chất hấp phụ nhiều hơn và ngược lại.
Tỷ lệ giữa chiều cao chất hấp phụ trong cột và đường kính trong của cột sắc ký: thực nghiệm cho thấy, một mẫu chất muốn tách tốt thì chiều cao chất hấp phụ nạp trong cột cần đạt tỷ lệ: chiều cao chất hấp thu/đường kính trong của cột vào khoảng (10/1).
3.3.1.3 Chuẩn bị cột
Rửa cột thật sạch, sấy khô, sau đó tráng cột vài lần với acetone. Cho bông gòn vào đáy cột (có thể cho thêm một lớp cát mịn sạch). Kẹp cột thẳng đứng trên giá sắt.
Chương 3: Cơ sở lý thuyết và một số phương pháp thực nghiệm
SVTH: Lê Thành Việt Tân 17
Tỉ lệ trọng lượng chất phân tích/trọng lượng chất hấp phụ được tính:
Tùy thuộc vào khả năng tách của chất hấp phụ mà tỷ lệ này thay đổi thông thường từ 1/20, 1/30, 1/50, 1/100,…
Có hai cách nhồi cột: nhồi cột ướt và nhồi cột khô.
Nhồi cột ƣớt:
Sử dụng cho các chất hấp phụ có khả năng trương nở như silica gel, sephadex. Phải ngâm trong dung môi một thời gian trước khi cho vào cột để tránh bị nứt cột. Khuấy, trộn đều chất hấp phụ với dung môi tạo thành một hỗn dịch, rót vào cột, chất hấp phụ sẽ lắng tự nhiên xuống đáy cột. Hỗn dịch dung môi và chất hấp phụ không nên quá sệt (nếu hỗn dịch này quá sệt sẽ khiến bọt khí bị giữ trong cột) và cũng không được quá lỏng (nếu quá lỏng thì phải rót nhiều lần vào cột). Chú ý, trong quá trình nhồi cột không được để khô dung môi trong cột. Sau khi nhồi hết chất hấp phụ vào cột tiếp tục rót dung môivào cột và cho chảy liên tục một thời gian để cột hấp phụ được hoàn toàn ổn định. Mặt thoáng trên đầu cột phải nằm ngang, người ta thường cho thêm một lớp cát hoặc bông để không làm xáo trộn mặt.
Nhồi cột khô:
Dùng cho các chất hấp phụ không có khả năng trương nở như Al2O3, CaCO3. Chất hấp phụ được nhồi từ từ vào cột ở dạng khô bởi một phễu có cuống dài. Dùng một que bằng gỗ hoặc cao su gõ nhẹ và đều chung quanh cột theo chiều từ dưới lên để bột xuống đều đặn. Khi chất hấp phụ được cho hết vào cột mới rót dung môi vào và cho chảy liên tục một thời gian để cột được ổn định, từ lúc này trở đi không được để khô dung môi trong cột.
3.3.1.4 Đưa mẫu chất cần phân tách vào cột
Yêu cầu của việc đưa mẫu chất vào cột là phải phân tán mẫu chất thành một lớp mỏng đồng đều trên mặt cột bằng phẳng. Có nhiều phương pháp đưa mẫu chất vào cột:
Cho thẳng dung dịch mẫu chất lên cột:
Hòa tan mẫu chất vào một lượng dung môi vừa đủ (càng ít càng tốt nhưng phải bảo đảm hòa tan hoàn toàn). Dung dịch mẫu chất có nồng độ đậm đặc mới nằm thành một lớp mỏng trên đầu cột. Cột đã ổn định, mở khóa cho dung môi chảy cho đến khi mặt cột hấp phụ vừa khô thì đóng lại. Dùng ống hút cho dung dịch mẫu chất
Trọng luợng chất phân tích Trọng luợng chất hấp phụ Tỷ lệ =
Chương 3: Cơ sở lý thuyết và một số phương pháp thực nghiệm
SVTH: Lê Thành Việt Tân 18
chảy dọc thành cột. Mở khóa bên dưới cho dung dịch mẫu chất ngấm vào cột (không được để chất hấp phụ ở đầu cột bị khô). Khi toàn bộ lớp dung dịch mẫu chất đã ngấm hết vào cột, dùng ống hút lấy một ít dung môi rửa thành cột và cũng cho ngấm hết vào cột. Tiếp tục cho dung môi để bắt đầu quá trình giải ly.
Trộn mẫu chất cần phân tách với một lượng chất hấp phụ:
Trộn dung dịch mẫu chất với một lượng nhỏ chất hấp phụ cho thật đều, sấy khô rồi cho vào cột bằng cách rải thành một lớp đều đặn trên mặt cột.
Trong hai cách trên, cách cho thẳng dung dịch vào cột là đơn giản và nhanh hơn. Tuy nhiên, nếu dùng phương pháp này phải bảo đảm các yêu cầu kỹ thuật sau:
Chất thử hòa tan hoàn toàn.
Dung dịch chất thử phải nạp vào cột đều.
Khi toàn bộ chất thử ngấm hết vào cột, mới cho tiếp dung môi mới. Cho dung môi nhẹ nhàng, không làm xáo động mặt cột.
Nếu chất thử ngấm vào cột tạo thành lớp có bề dày đều nhau là chứng tỏ kỹ thuật đảm bảo.
3.3.1.5 Giải ly cột
Tùy theo chất hấp phụ dùng và yêu cầu tốc độ chảy của cột mà người ta có thể tiến hành giải ly cột bằng áp suất thường hoặc áp suất nén.
Giải ly cột bằng áp suất thường: dung môi chảy ra nhờ vào trọng lực. Cột áp suất thường có nhược điểm là chảy chậm, chỉ dùng cho các chất hấp phụ có kích thước hạt lớn.
Giải ly cột bằng áp suất nén: Người ta thường cho một dòng khí nén (khí nitrogen hoặc không khí) vào đầu cột. Tốc độ dòng khí có thể được kiểm soát nhờ vào một van điều chỉnh. Cột dùng áp suất nén phải có nút bảo đảm kín ở miệng, và có khóa hoặc dây buộc chặt vào miệng cột.
Việc lựa chọn phương pháp giải ly cột tùy thuộc vào việc sử dụng kích thước hạt gel làm pha tĩnh và việc sử dụng áp lực để giải ly dung môi ra khỏi cột. Một hợp chất có thể bị chất hấp phụ giữ lại mạnh hay yếu còn tùy thuộc vào độ phân cực của dung môi giải ly.
Ở sắc ký cột cổ điển, dung môi rửa cột được dùng với độ phân cực tăng dần. Dung môi phải tinh khiết, nếu có những tạp chất lẫn vào dung môi sẽ làm thay đổi
Chương 3: Cơ sở lý thuyết và một số phương pháp thực nghiệm
SVTH: Lê Thành Việt Tân 19
độ phân cực của dung môi đó, vì thế người ta thường chưng cất dung môi trước khi sử dụng.
Hiện nay, trên thị trường có bán loại silica gel đảo pha. Khi sử dụng silica gel này làm pha tĩnh, thì pha tĩnh có tính hấp thu tỷ lệ với tính thân dầu của hợp chất được sắc ký, cho nên pha động sử dụng thường là nước hoặc các hỗn hợp dung môi có chứa nước. Như vậy các thành phần phân cực trong hỗn hợp chất cần sắc ký sẽ được giải ly ra khỏi cột trước, còn các chất không phân cực sẽ ra sau. Phương pháp này được ứng dụng rất có hiệu quả đối với các hợp chất phân cực mạnh trong thực vật như saponin.
Sự thay đổi từ dung môi này sang dung môi khác phải chuyển từ từ bằng cách pha tỷ lệ tăng dần hoặc giảm dần. Nếu tăng tính phân cực nhanh và đột ngột thì sẽ làm “gãy” cột. Nguyên nhân là do các chất hấp phụ như Al2O3 hoặc silica gel khi được trộn với bất kỳ một loại dung môi nào cũng sẽ sinh ra nhiệt, nhiệt này làm cho dung môi bốc hơi một cách cục bộ, hơi sinh ra tạo nên bọt khí làm “gãy” cột, hiệu quả tách không tốt.
Vận tốc chảy của dung môi rửa cột phải được điều chỉnh cho phù hợp: không được quá nhanh (mẫu chất thử sẽ không kịp cân bằng với chất hấp phụ), cũng không được quá chậm hoặc cho ngưng lại một thời gian (vì sẽ làm cho chất tan bị khuyếch tán, ảnh hưởng đến hiệu quả tách).
Trên thực tế nhiều khi dùng những dung môi thông thường không tách được nên người ta thường dùng hỗn hợp nhiều dung môi.
Theo dõi quá trình giải ly cột:
Với các chất cần phân tích có màu, quá trình giải ly bằng sắc ký cột có thể được theo dõi bằng mắt thường. Tuy nhiên, đa số các hợp chất hữu cơ thiên nhiên đều không có màu nên việc hứng và kiểm tra các phân đoạn được giải ly ra khỏi cột thường bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng.
Thông thường trước khi tiến hành sắc ký cột, người ta dựa vào tài liệu tham khảo để chọn chất hấp phụ và dung môi thích hợp hoặc tiến hành thăm dò bằng sắc ký lớp mỏng để tìm ra hệ dung môi tách tốt nhất. Khi đã chọn được chất hấp phụ và hệ dung môi thích hợp, việc ấn định thể tích của mỗi phân đoạn hay thể tích của mỗi loại dung môi giải ly cột tùy thuộc vào thực nghiệm và kinh nghiệm của người thực hành.
Chương 3: Cơ sở lý thuyết và một số phương pháp thực nghiệm
SVTH: Lê Thành Việt Tân 20
3.3.2 Sắc k lớp m ng
3.3.2.1 Nguyên tắc
Sắc ký lớp mỏng còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography), là kỹ thuật phân bố rắn – lỏng: Trong đó pha động là chất lỏng được cho đi ngang qua một lớp chất hấp phụ trơ như silica gel hoặc alumin oxid. Chât hấp phụ này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic. Do chất hấp phụ được tráng thành lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng.
Muốn thực hiện việc sắc ký, người ta cho mẫu cần phân tích hòa tan vào một dung môi dễ bay hơi, dùng ống mao quản để chấm một ít dung dịch mẫu chất này, thành một vết nhỏ gọn lên tấm lớp mỏng. Sấy nhẹ để đuổi phần dung môi hòa tan mẫu, như vậy mẫu chất chỉ còn là dạng bột khô ở trên tấm lớp mỏng. Đặt tấm lớp mỏng này theo chiều thẳng đứng trong một bình có chứa sẵn dung môi phù hợp. Dung môi sẽ bị lực mao quản hút di chuyển lên cao trong tấm bảng, mẫu chất sẽ bị phân chia thành những vết riêng biệt. Các vết sẽ được xác định bằng những phương pháp vật lý (nhìn trực tiếp bằng mắt, soi dưới đèn tử ngoại,…) hoặc bằng những phương pháp hóa học (phun lên bản mỏng các loại dung dịch thuốc thử).
Một chất tinh khiết sẽ chỉ cho một vết tròn, có giá trị Rf không đổi trong một hệ dung môi xác định: trị số Rf được tính như sau:
Hình 3.6: Cách tính giá trị Rf
Khoảng cách từ điểm chấm đến trung tâm vết Khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi
Chương 3: Cơ sở lý thuyết và một số phương pháp thực nghiệm
SVTH: Lê Thành Việt Tân 21
Rf luôn nhỏ hơn 1 và thay đổi phụ thuộc vào các điều kiện tiến hành như: Tính chất của chất hấp phụ.
Thành phần của dung môi khai triển. Chiều dày của bản mỏng.
Luợng mẫu chất đem chấm sắc ký. Nhiệt độ lúc sắc ký.
Sắc ký lớp mỏng có một số ưu điểm sau:
Hiệu ứng tách tốt, nhạy hơn các phương pháp khác (nhạy hơn 20 lần so với sắc ký giấy).
Thời gian tiến hành nhanh. Lượng mẫu phân tích nhanh.
Có thể phân tích đồng thời mẫu chất và chất chuẩn đối chứng trong cùng một điều kiện phân tích.
Dụng cụ đơn giản.
3.3.2.2 Chất hấp phụ dùng trong SKLM
Trong sắc ký lớp mỏng thường dùng các chất hấp phụ: silica gel, kieselguhr, celluloz, Al2O
3… Ngoài ra, người ta còn trộn thêm chất kết dính hoặc chất chỉ thị phát huỳnh quang. Chất kết dính giúp cho chất hấp phụ bám tốt vào tấm kính hoặc tấm plastic, làm cho lớp mỏng bền, không bị trầy xướt..
3.3.2.3 Dung môi triển khai
Dung môi triển khai trong sắc ký lớp mỏng có thể là một dung môi riêng biệt hoặc một hỗn hợp của 2, 3 thậm chí 4 loại dung môi khác nhau với tỷ lệ thích hợp. Ứng với mỗi loại hợp chất phân tích khác nhau sẽ có một số hệ dung môi thích hợp.
Nên chọn dung môi có độ tinh khiết cao, có thể hòa tan được mẫu phân tích. Tuy nhiên, không khuyến khích việc chọn dung môi có thể hòa tan tuyệt đối mẫu chất. Một mẫu chất cần sắc ký có thể chứa nhiều cấu tử khác nhau. Khả năng tách riêng các hợp chất này bằng sắc ký lớp mỏng tùy thuộc vào tỷ lệ phân phối của các hợp chất này chất hấp phụ và dung môi khai triển. Muốn thay đổi khả năng tách, người ta thay đổi thành phần các dung môi hoặc thay đổi tỷ lệ các thành phần đó.
Với mẫu sắc ký mà chưa biết thành phần hợp chất, chưa có tài liệu tham khảo thì phải làm một loạt thử nghiệm với các loại dung môi khác nhau, quan sát các vết.
Chương 3: Cơ sở lý thuyết và một số phương pháp thực nghiệm
SVTH: Lê Thành Việt Tân 22
Một hệ dung môi triển khai phù hợp khi các vết có Rf rõ, cách xa và trong giới hạn
từ 0,3 đến 0,7; nếu Rf thấp quá thì dung môi chưa đủ phân cực, nếu cao quá thì dung môi quá phân cực.
3.3.2.4 Ứng dụng của SKLM
Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng hiện nay vẫn là công cụ rất đắc lực trong ngành hóa hữu cơ, đặc biệt trong hóa học hợp chất thiên nhiên như:
Cho biết đặc điểm của hợp chất vừa trích ly, cô lập được (một chất tinh khiết sẽ có giá trị R
f không đổi trong hệ dung môi xác định).
Có thể tiên đoán sơ bộ là trong hỗn hợp chiết xuất ban đầu có bao nhiêu hợp chất và tính phân cực của hỗn hợp mẫu chiết.
Để định hướng loại dung môi phù hợp cho sắc ký cột. Trước khi dùng sắc ký cột để tách một lượng lớn mẫu chất, các nhà nghiên cứu thường hay sử dụng sắc ký lớp mỏng để thăm dò tìm hệ dung môi thích hợp cho quá trình sắc ký cột.