Nghiên cứu ảnh hưởng của phân đoạn dịch chiết lá bằng lăng nước (lagerstroemia speciosa (l ) pers ,lythraceae) lên hoạt tính của enzym glucose 6 phosphatase của gan chuột thực nghiệm

Nghiên cứu ảnh hưởng của phân đoạn dịch chiết lá bằng lăng nước (lagerstroemia speciosa (l ) pers ,lythraceae) lên hoạt tính của enzym glucose 6 phosphatase của gan chuột thực nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng của phân đoạn dịch chiết lá bằng lăng nước (lagerstroemia speciosa (l ) pers ,lythraceae) lên hoạt tính của enzym glucose 6 phosphatase của gan chuột thực nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng của phân đoạn dịch chiết lá bằng lăng nước (lagerstroemia speciosa (l ) pers ,lythraceae) lên hoạt tính của enzym glucose 6 phosphatase của gan chuột thực nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng của phân đoạn dịch chiết lá bằng lăng nước (lagerstroemia speciosa (l ) pers ,lythraceae) lên hoạt tính của enzym glucose 6 phosphatase của gan chuột thực nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng của phân đoạn dịch chiết lá bằng lăng nước (lagerstroemia speciosa (l ) pers ,lythraceae) lên hoạt tính của enzym glucose 6 phosphatase của gan chuột thực nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng của phân đoạn dịch chiết lá bằng lăng nước (lagerstroemia speciosa (l ) pers ,lythraceae) lên hoạt tính của enzym glucose 6 phosphatase của gan chuột thực nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng của phân đoạn dịch chiết lá bằng lăng nước (lagerstroemia speciosa (l ) pers ,lythraceae) lên hoạt tính của enzym glucose 6 phosphatase của gan chuột thực nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng của phân đoạn dịch chiết lá bằng lăng nước (lagerstroemia speciosa (l ) pers ,lythraceae) lên hoạt tính của enzym glucose 6 phosphatase của gan chuột thực nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng của phân đoạn dịch chiết lá bằng lăng nước (lagerstroemia speciosa (l ) pers ,lythraceae) lên hoạt tính của enzym glucose 6 phosphatase của gan chuột thực nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng của phân đoạn dịch chiết lá bằng lăng nước (lagerstroemia speciosa (l ) pers ,lythraceae) lên hoạt tính của enzym glucose 6 phosphatase của gan chuột thực nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng của phân đoạn dịch chiết lá bằng lăng nước (lagerstroemia speciosa (l ) pers ,lythraceae) lên hoạt tính của enzym glucose 6 phosphatase của gan chuột thực nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng của phân đoạn dịch chiết lá bằng lăng nước (lagerstroemia speciosa (l ) pers ,lythraceae) lên hoạt tính của enzym glucose 6 phosphatase của gan chuột thực nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng của phân đoạn dịch chiết lá bằng lăng nước (lagerstroemia speciosa (l ) pers ,lythraceae) lên hoạt tính của enzym glucose 6 phosphatase của gan chuột thực nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng của phân đoạn dịch chiết lá bằng lăng nước (lagerstroemia speciosa (l ) pers ,lythraceae) lên hoạt tính của enzym glucose 6 phosphatase của gan chuột thực nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng của phân đoạn dịch chiết lá bằng lăng nước (lagerstroemia speciosa (l ) pers ,lythraceae) lên hoạt tính của enzym glucose 6 phosphatase của gan chuột thực nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng của phân đoạn dịch chiết lá bằng lăng nước (lagerstroemia speciosa (l ) pers ,lythraceae) lên hoạt tính của enzym glucose 6 phosphatase của gan chuột thực nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng của phân đoạn dịch chiết lá bằng lăng nước (lagerstroemia speciosa (l ) pers ,lythraceae) lên hoạt tính của enzym glucose 6 phosphatase của gan chuột thực nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng của phân đoạn dịch chiết lá bằng lăng nước (lagerstroemia speciosa (l ) pers ,lythraceae) lên hoạt tính của enzym glucose 6 phosphatase của gan chuột thực nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng của phân đoạn dịch chiết lá bằng lăng nước (lagerstroemia speciosa (l ) pers ,lythraceae) lên hoạt tính của enzym glucose 6 phosphatase của gan chuột thực nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng của phân đoạn dịch chiết lá bằng lăng nước (lagerstroemia speciosa (l ) pers ,lythraceae) lên hoạt tính của enzym glucose 6 phosphatase của gan chuột thực nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng của phân đoạn dịch chiết lá bằng lăng nước (lagerstroemia speciosa (l ) pers ,lythraceae) lên hoạt tính của enzym glucose 6 phosphatase của gan chuột thực nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng của phân đoạn dịch chiết lá bằng lăng nước (lagerstroemia speciosa (l ) pers ,lythraceae) lên hoạt tính của enzym glucose 6 phosphatase của gan chuột thực nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng của phân đoạn dịch chiết lá bằng lăng nước (lagerstroemia speciosa (l ) pers ,lythraceae) lên hoạt tính của enzym glucose 6 phosphatase của gan chuột thực nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng của phân đoạn dịch chiết lá bằng lăng nước (lagerstroemia speciosa (l ) pers ,lythraceae) lên hoạt tính của enzym glucose 6 phosphatase của gan chuột thực nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng của phân đoạn dịch chiết lá bằng lăng nước (lagerstroemia speciosa (l ) pers ,lythraceae) lên hoạt tính của enzym glucose 6 phosphatase của gan chuột thực nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng của phân đoạn dịch chiết lá bằng lăng nước (lagerstroemia speciosa (l ) pers ,lythraceae) lên hoạt tính của enzym glucose 6 phosphatase của gan chuột thực nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng của phân đoạn dịch chiết lá bằng lăng nước (lagerstroemia speciosa (l ) pers ,lythraceae) lên hoạt tính của enzym glucose 6 phosphatase của gan chuột thực nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng của phân đoạn dịch chiết lá bằng lăng nước (lagerstroemia speciosa (l ) pers ,lythraceae) lên hoạt tính của enzym glucose 6 phosphatase của gan chuột thực nghiệm

Trang 1

BO Y TE

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

KEKE KEKE ES

HO THI THANH XUAN

NGHIEN CUU ANH HUONG CUA PHAN DOAN DICH CHIET LA BANG LANG NUOC

(Lagerstroemia speciosa (L.), Pers., Lythraceae) LEN

HOAT TINH ENZYM GLUCOSE-6-PHOSPHATASE

CUA GAN CHUOT THUC NGHIEM

(KHOA LUAN TOT NGHIEP DƯỢC SĨ KHÓA 2004-2009)

- Người hướng dẫn: GS-TS Nguyễn Xuân Thắng

- Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa sinh

Trường Đại học Dược Hà Nội - Thời gian thực hiện: 3/2009-5/200" >

Trang 2

MUC LUC Trang

LOI CAM ON

DANH MUC CHU VIET TAT

DAT VAN DE

PHAN 1 TONG QUAN

Ld Quá trình tân tạo đường

1.2 Enzym glucose-6-phosphatase

1.2.1 Vi tri

1.2.2 Câu tạo SDI

DW] WwW — 1.2.3 Co ché

1.2.4 Dong hoc enzym

1.2.5 Vai trò của enzym G6Pase trong một số bệnh lý 12

1.2.6 Các phương pháp xác định hoạt độ G6Pase 13

1.3 Thuốc tác dụng trên hoạt tính enzym G6Pase 15

1.3.1 Tân dược 15

1.3.2 Dược liệu ló

1.4 Băng lăng nước I7

1.4.1 Đặc điểm thực vật 17 1.4.2 Công dụng và tác dụng dược lý 17 1.4.3 Thành phân hóa học l§

PHAN 2 THUC NGHIEM VA KET QUA 20

Zi Đôi tượng và nguyên liệu nghiên cứu 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Phương pháp điêu chê các phân đoạn dịch chiết 21

2.2.2 phương pháp xác định ảnh hưởng của các phân đoạn dich chiét

lên hoạt tính enzym G6Pase

21

2.2.3 Phương pháp định lượng đường huyết 22

2.2.4 Phương pháp xác định họat độ enzym G6Pase 22

2.2.5 Phương pháp xử lý sô liệu 23

23 Két qua 24

2.3.1 Ảnh hưởng của phân đoạn dich chiét lá BLN khi dùng liêu đơn

đôi với hoat d6 enzyme G6Pase 6 gan chuột bình thường 24

2.3.2 Ảnh hưởng của phân đoạn dịch chiệt lá BLN khi dùng liêu lặp

lại đôi với hoạt độ enzym G6Pase ở gan chuột bình thường

26

2.3.3 Ảnh hưởng của phân đoạn dịch chiết lá BLN đi với hoạt độ

enzyme G6Pase 6 gan chuột gây tăng đường huyệt bởi STZ

28

2.4 Bàn luận 30

2.4.1 Phương pháp xác định hoạt độ enzym G6Pase 30

2.4.2.Ảnh hưởng của các phân đoạn dịch chiệt lên hoạt độ enzym

G6Pase 31

Trang 3

PHAN 3 KET LUAN VA DE XUAT 35

3.1 Kết luận 35

3.2 Đê xuât 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Trang 4

Loi cam on

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến người thầy kính quí GS-TS Nguyễn Xuân Thắng đã hướng dẫn em hoàn thành đề tài, luôn cho em những lời khuyên quí giá trong suốt thời gian làm khóa luận

Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành cùng tình cảm yêu thương đến cô giáo: Ths Phùng Thanh Hương, người luôn chỉ bảo, hướng dẫn tận tình cho em

khơng những trong suốt thời gian làm khóa luận mà cịn trong cuộc sống, chỉ bảo những điều hay, giúp em trưởng thành lên rất nhiều

Em xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo, các chị kỹ thuật viên —

bộ mơn Hóa sinh, trường đại học Dược Hà Nội- đã tạo mọi điều kiện thuận lợi

giúp em hoàn thành khóa luận Bộ mơn Hóa sinh như ngơi nhà thứ hai, là nơi ghi lại những dấu ấn khó quên trong quãng thời gian sinh viên của em

Em cũng xin bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới các Thầy, Cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình giảng dạy, giúp chúng em chuẩn bị hành trang bước vào đời Cảm ơn bố mẹ, người thân, bạn bè - những người luôn

đứng bên em, động viên, khích lệ để em có được như ngày hôm nay

Trang 5

DANH MUC CHU VIET TAT AMP BLN DTD EDTA Eikonogen F-2,6-BP F-1,6-BPase G6P G6Pase GLUT2 GLUT4 GOD GSD NADPH OA PEP PEPCK PGG Pi STZ TCA Adenosin monophosphat

Bang lang nude

Đái tháo đường

Ethylendiamin tetraacetic acid I-naphtol-4-sulfunic acid Fructose-2,6-biphosphat Fructose-1,6-biphosphatase Glucose-6-phosphat Glucose-6-phosphatase Glucose transporter 2 Glucose transporter 4 Glucose oxidase

Glycogen storage disease (bénh tich liy glycogen)

Nicotinamid adenin dinucleotid phosphat

Oxalo acetat

Phosphoenolpyruvat

Phosphoenolpyruvat Carboxykinase Penta-O-Galloyl-D-Glucopyranose Phospho vô cơ

Trang 6

DAT VAN DE

Đái tháo đường (ĐTĐ) là một bệnh do rối loạn chuyên hóa với đặc trưng

là nồng độ glucose huyết cao gây ra do giảm insulin hoặc do kháng insulin ở các mô DTD là một bệnh mang tính thời sự, với tốc độ phát triển chóng mặt

Theo tổ chức y tế thế giới (WHO) hiện nay cả thế giới có khoảng 190 triệu người mắc bệnh, con số này ước tính tăng lên đến 350 triệu trong năm 2030 Do đó nghiên cứu tìm ra các thuốc điều trị ĐTĐ có hiệu quả điều trị tốt, hạn

chế tác dụng không mong muốn là vấn đề cần được quan tâm không chỉ của một quốc gia mà cần có sự chung tay của cả nền y học thế giới Theo quan

niệm hiện nay chỉ phí cho điều trị ĐTĐ là một chỉ phí phức tạp, tơng hợp của

nhiều yếu tố, tông chỉ phí cho một bệnh nhân ĐTĐ gấp 2-4 lần người không

bi DTD [1]

Muc tiéu quan trong trong điều trị ĐTĐ là làm hạ glucose huyết, nồng độ

glucose trong mau giam sé giúp hạn chế các biến chứng đồng thời cải thiện

tình trạng các biến chứng hiện tại Một trong các đích tác dụng mới trong điều trị ĐTĐ hiện nay là hoạt hóa các enzym chủ chốt tham gia vào q trình thối hóa glucose và tơng hợp glycogen, cũng như ức chế các enzym chủ chốt của quá trình tân tạo đường (TT) và thối hóa glycogen Glucose-ó-phosphatase (G6Pase) là một trong 3 enzym chủ chốt tham gia vào quá trình TTĐ, kết thúc

q trình TTĐ và thối hóa glycogen, có vai trị quan trọng trong sự tăng đường huyết của bệnh nhân ở thời điểm xa bữa ăn Ức chế G6Pase là một

trong các mục tiêu mà các thuốc điều trị ĐTĐ mới hiện nay hướng tới Bên cạnh các hoạt chất có nguồn gốc tơng hợp, các dược liệu có tác dụng ức chế G6Pase cũng được quan tâm nghiên cứu

Trang 7

speciosa (L.) Pers Lythraceae) từ lâu đã được sử dụng khá phổ biến theo kinh nghiệm dân gian ở nhiều nước Đông A và Đông Nam Á để điều trị ĐTĐ cho

kết quả tốt Ở Việt Nam, BLN là cây trồng khá phô biến, tuy vậy việc nghiên cứu và sử dụng BLN trong điều trị ĐTĐ chưa nhiều Mặt khác, trên thế giới

chưa có nghiên cứu nào về tác dụng của BLN lên hoạt độ enzym G6Pase ở gan Do đó, chúng tơi tiền hành nghiên cứu này với các mục tiêu sau:

Nghiên cứu ảnh hưởng của các phân đoạn dịch chiết lá cây BLN trên hoạt độ enzym G6Pase của gan chuột nhắt trắng bình thường

Trang 8

PHAN 1 TONG QUAN

1.1 Quá trình tân tạo đường

Tân tạo đường là quá trình tạo ra glucose từ những tiền chất không phải

là đường như lactat, glycerol, acid amin, pyruvat cùng với các con đường

khác như đường phân, thối hóa glycogen nhằm điều hòa đường huyết trong

*

A

co thé

Glycerot-3-

phosphat Phosphoenolipyruval

sản Oxaloa-ctai = <= <= <&—Succiny(- <= Methymaionyi-

4 CoA CoA

om -m => = TH amin

acta

Hình 1.1 Quá trình tân tạo đường

Nồng độ glucose ổn định là điều kiện cần thiết cho mọi hoạt động bình

thường của cơ thể đặc biệt là não, vì 90% năng lượng cho hoạt động của não la tir glucose Lugng glucose can thiết cho não người lớn là 120g trong tổng

Trang 9

lugng 160g glucose ma co thé str dung trong mot ngay [16] Glucose cung cap năng lượng cho hầu hết mọi cơ quan trong cơ thể Trong trường hợp khi nhịn

đói lâu, glucose có thể tạo thành bằng quá trình TTĐ

Quá trình tân tạo đường chủ yếu xảy ra ở gan vì chỉ ở gan mới có đủ các

enzym cho quá trình này, một lượng nhỏ của TTĐ xảy ra ở than [16] Các cơ quan khác không xảy ra quá trình TTĐ do sự vắng mặt của enzym G6Pase

TTD không phải là quá trình ngược của con đường đường phân, trong

đường phân có 3 phản ứng bắt thuận nghịch được thay thế bằng 3 đường vòng

voi su tham gia cua 3 enzym G6Pase, FBPase, PEPCK trong TTD

- Đường vịng 1: q trình chuyển từ pyruvat thành

phosphoenolpyruvat phải trải qua 2 phản ứng:

e Phan ứng tạo oxaloacetat từ pyruvat nhờ xúc tác của enzym pyruvat kinase Phản ứng này xảy ra trong ty thể, tạo thành malat, malat đi qua được màng ty thể khi ra ngoài tế bào chất, được khử trở lại thành OA

® Dưới tác dụng của enzym phosphoenolpyruvat carboxykinase, OA được chuyền thành PEP

Oo — s2 aaa | 4 Cc 0 1 + GTP? - bo —b_o- + CO; + GDP CH; \ \ CH, O- Oxaloscetate Phosphoenolpyruvete

- Đường vòng 2: PEP tạo thành ở trên tiếp tục qua chuỗi các phản ứng

Trang 10

boi enzym FBPase

- Duong vong 3: tir glucose-6-phosphat thành glucose tự do được xúc tác bởi enzym G6Pase, kết thúc quá trình TTĐ

ĐTĐ đặc trưng bởi sự tăng đường huyết thông qua hai con đường là tăng thối hóa gÌycogen và tăng quá trình TTĐ trong đó TTĐÐ đóng vai trò quan trọng trong sự tăng đường huyết này Nghiên cứu của I.Magnusson cho thấy

tông lượng glucose tạo thành ở nhóm chuột DTD 1a 11,1 umol/kg/phút so với 8,9 umol/kg/phút (p<0,05) ở nhóm chứng, trong đó glucose tạo thành do

TTĐ là 98 umol/kg/phút ở chuột ĐT so với 6,1 umol/kg/phút (p< 0,01) ở nhóm chứng, lần lượt chiếm 88% và 70 % (p<0,05) tông lượng glucose tạo thành [3§] Như vậy sự tăng glucose nội sinh là một trong những nguyên nhân

quan trọng dẫn đến tình trạng tăng đường huyết ở bệnh nhân ĐTĐ

Do đó, một trong những hướng mới trong điều trị ĐTĐ hiện nay là phát triển các chất có tác dụng ức chế lên quá trình TTĐ Đã có nhiều thuốc trong

đó có cả thuốc tân dược và thuốc có nguồn gốc từ dược liệu có tác dụng hạ đường huyết theo cơ chế ức chế quá trình TTĐ Các thuốc này ức chế quá trình TTĐ bằng cách ức chế một hoặc một vài enzym trong số 3 enzym chủ

chốt của quá trình TTĐ Một số các chất điên hình trong số đó là:

> CS-917 là thuốc có tác dụng ức chế enzym FBPase Đây là tiền chất của MB05032, một thuốc có tác dụng ức chế hoạt tính

FBPase với cơ chế tương tự AMP [21] CS-917 đã được thử lâm sàng

giai đoạn 2 trên người tình nguyện và bước đầu cho thấy thuốc an toàn và cho kết quả tốt [46]

> Acid 3-mercaptopicolinie là chất ức chế TTĐ thông qua ức chế enzym phosphoenolpyruvat carboxykinase [25], [14]

Trang 11

cơ chế ức chế TTD bang cach tre chế hầu hết các enzym chủ chốt của quá trình TFĐ Trong số dé c6: Momordica charantia [49], Aegle marimelos [50], Annona squamosa [36], Coccinia indica [45]

1.2 Enzym glucose-6-phosphatase

Glucose-6-phosphatase (G6Pase) có tên đầy đủ là D-glucose-6-phosphat phosphohydrolase, là enzym xúc tác cho phản ứng thủy phân GóP để tạo thành glucose và phospho vô cơ, bước cuối cùng của quá trình tân tạo đường và thối hóa glycogen G6Pase là một trong 3 enzym chủ chốt tham gia vào quá trình tân tạo đường, do đó có vai trị rất quan trọng trong điều hòa đường huyết

1.2.1 Vi tri

G6Pase dugc tim thay trong té bao gan, tế bào thận, tế bào ruột và tế bao B của tiêu đảo Langerhans [55], [22], xương [32], noron thần kinh [15], trong

tế bào máu, tuyến thượng thận, khí quản, thực quản và tinh hoàn của bào thai

[19] [ŠŠ] Hoạt tính của GóPase đo được trong nhau thai người từ sau 28 tuần

[40] Ngoài ra, người ta tìm thấy G6Pase có ở trong tế bào bạch cầu và tiểu cầu [42] G6Pase được tìm thấy ở nhiều vị trí nhưng về tỷ lệ lại có sự khác

nhau rõ rệt Trên chuột cống trắng, nếu coi lượng G6Pase ở gan là 100% thì

phân bô của enzym này ở các cơ quan khác được thê hiện trong bảng sau

Bảng 1.1 Bảng phân bố của G6Pase trong các cơ quan của chuột

A <

cong trang

Gan Than Ruột Lách Cơ Não Tim Phéi Da day mau

100 31 18 l 0,8 0,8 0,8 0,4 0.4 0,1

Trang 12

tâm trong quá trình tân tạo đường, phần nhỏ xảy ra ở thận, các cơ quan còn lại chỉ mang tính chất hỗ trợ

1.2.2 Cầu tạo

Trong 20 năm trở lại đây có nhiều giả thuyết khác nhau về cấu tạo của G6Pase, trong đó có 2 giả thuyết đáng được chú ý:

s% Giả thuyết của Arion: G6óPase là một hệ gồm nhiều thành phần trong

đó vị trí xúc tác là tập hợp các acidamin xuyên qua màng lưới nội chất Với mô hình này Arion cũng cho rằng G6Pase chỉ tác dụng đối với các cơ chất đặc hiệu là một phosphatase có vị trí hoạt động hướng về phía trước lớp nhung

mao của màng lưới nội chất [12], [48]

s* Giả thuyết của Terbeloot: ngược lại, GóPase là một phức hợp linh hoạt có khả năng tác dụng trên nhiều cơ chất khác nhau Theo mơ hình này

G6Pase khơng có những đoạn peptid nằm ngoài màng lưới nội chất, toàn bộ vị trí hoạt động có dạng như một túi thân nước [23], [17]

Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng G6Pase là một hệ đa thành phần với 1 cơ chất đặc hiệu giống như giả thuyết thứ nhất đã đưa ra Có thê đưa ra

một bằng chứng đó là: Mannose-6-phosphat là một epimer ở vị trí C-2 của G-

6-P nhưng chỉ bị thủy phân với tốc độ bằng 5% tốc độ của G-6-P, cơ chất đặc

hiệu của G6Pase [48]

Đi sâu vào nghiên cứu, các nhà khoa học đã tìm ra được câu trúc đây đủ của G6Pase như sau:

G6Pase bao gồm một tiểu đơn vị xúc tác liên kết glucose là một đoạn peptid có 357 aa với khối lượng xấp xỉ 36kDa hay còn gọi là P36 Day 1a mot

đoạn peptid có 9 chuỗi xoắn, có đầu tận quay ra phía ngoài màng lưới nội chất

Trang 13

(jluecose

Hình 1.2 Mơ hình của G6Pase theo giả thuyết thứ nhất [48] Phân thứ hai là một protein có 429 aa với M ~ 46kDa ky hiéu 1a P46 gồm 10 chuỗi xoắn Khi so sánh cấu trúc của protein này ở chuột nhắt và

chuột cống thấy sự tương đồng 98% [55] P46 hay được gọi là kênh vận

chuyển cơ chất qua màng lưới nội chất (T1) Ngoài ra cịn có kênh vận

chun phospho vô cơ (T2) và kênh vận chuyển glucose (T3) ra ngồi [48]

Theo mơ hình này, khi G6Pase ở trong microsom nguyên vẹn, GóPase hoạt động đặc hiệu trên cơ chất nhưng khi xử lý với chất tẩy thì ngồi G6P,

G6Pase cịn có khả năng thủy phân các cơ chất khác như Mannose-6-P, Carbamoyl-P Giải thích về hiện tượng này, W.Arion đã đưa ra giả thuyết: bình thường khi G6Pase nằm trong tế bào nguyên vẹn thì tiểu đơn vị xúc tác (P36) nằm hướng vào phía trong màng lưới nội chất và công T1 đặc hiệu với

Trang 14

không được tiếp xúc với enzym Khi xử lý microsom với chất tây anion,

cation hay trung tính có thể do chúng làm thay đổi tính nguyên vẹn của microsom do đó tạo điều kiện cho enzym tiếp xúc với các cơ chất khác [48] Trong thực tế, các chất tây này kích thích hoạt tính của enzym trên cơ chất

G6Pase đồng thời làm tăng hoạt tính của nó trên các cơ chất khác (mannose-

6-P, glucosamine-6-P ) [48]

1.2.3 Cơ chế hoạt động

Chuỗi acid amin xuyên màng của GóPase gồm có 357 đơn vị trong đó trung tâm hoạt động của enzym này gồm có Lys76, Arg83, His119, Arg170,

và His 176

Trong cơ chế hoạt động của G6Pase, có vai trị quan trọng của His176 là

một tác nhân ái nhân có khả năng tạo liên kết cộng hóa trị với gốc phosphate, lúc này cơ chất G6P được gắn vào vị trí hoạt động của enzym tạo thành dạng

phosphoenzym trung gian Các vị trí cịn lại là Lys76, Arg83, Hisl 19, Argl70

do cịn có 1 orbital trống (chứa N”) hút các O' mang điện tích âm (của gốc

phosphat) tạo điều kiện cho phân tử glucose dễ dàng tách ra khỏi hợp chất phosphate [44],[24]

Trang 15

1.2.4 Dong hoc enzym

Rất nhiều nghiên cứu về động học enzym G6Pase đã được thực hiện

Trên cùng cơ chất G6P, trong những điều kiện khác nhau, thông số về động

học cũng thay đôi rất nhiều

Bảng 1.4 Các giá trị Km của G6Pase [26], [48]

Giá trị Km

Đối tượng nghiên cứu Điều kiện nghiên cứu

(mM)

0,3 Ratfs norvegieus (chuột cống) |_ pH 6,5-enzym đã phân lập

0,5 Rattus norvegicus (chuét céng) | pH 5,5-enzym da phan lap

1,3 Raftus norvegieus (chuột cống) | pH 6,5-mơ hình nguyên vẹn

l Homo sapiens (người) pH 5,5- enzym da phan lap 2-3 Homo sapiens (người) pH 6,5-enzym da phan lập

4,1 Homo sapiens (người) pH 5,Š5-mô hình nguyên vẹn

4,3 Homo sapiens (người) pH ó,Š mơ hình ngun vẹn

Có thê thấy tuy giá trị Km của G6Pase khác nhau nhưng đều có một đặc điểm chung là đều cao hơn so với giá trị nồng d6 G6P nội bào (0,05- ImM) Trong khi đó, hoạt động của enzym được điều hòa bởi nồng độ cơ chất Điều này giải thích tại sao khi lượng glucose trong máu tăng hay giảm

rất ít ảnh hưởng đến hoạt độ enzym này Km của enzym luôn lớn hơn nồng độ G6P nội bào điều đó có nghĩa là: bình thường khả năng hoạt động của cơ chất

Trang 16

Trong tình trạng đói, q trình thối hóa glycogen va TTD tang lén tao ra nhiều cơ chất GóP, do đó hoạt tính của enzym khơng cần bị kích thích mà vẫn đủ để đáp ứng nhu cầu cơ thể Trong trường hợp nồng độ glucose máu tăng

cao hơn bình thường, ølucose lại có tác dụng ức chế gián tiếp thông qua tăng

téng hop glycogen do đó làm giảm nồng độ G6P [48] Hoạt tính của G6Pase bị ức chế bởi nhiều tác nhân:

> Glucose được biết đến như một tác nhân ức chế không cạnh

tranh với G6Pase với Ki 50-200mM [48]

> Pi cũng là một tác nhân ức chế không cạnh tranh trong microsom nguyên vẹn, nhưng ức chế cạnh tranh khi có mặt chat tay [11] > Các muối vanadat là tác nhân ức chế được biết đến nhiều nhất

của các phosphatase hoạt động thông qua dạng phosphoenzym trung gian Các hợp chất muối của vanadat ức chế cả hai hoạt tính là thủy phân liên kết esterphosphat và vận chuyển gốc phosphat Khả năng ức chế trên mierosom đã xử lý với chất tẩy mạnh hơn so với ở microsom nguyên vẹn, với Ki tương ứng là 2,2 va 5,6uM

Ngược lại EDFA lại là chất làm mất tác dụng của vanadat do kha

năng tạo phức chelat Ngoài ra tungstat cũng ức chế G6Pase theo cơ chế này với Ki là 10-25 ở microsom nguyên vẹn và 1-7 wM ở

microsom đã qua xử lý với chất tây [48]

> Một số chất có tác dụng ức chế ở nồng độ thấp nhưng lại có tác

dụng hoạt hóa khi ở nồng độ cao hơn Nguyên nhân có thê do chúng làm thay đổi tính nguyên vẹn của mierosom, đó là các chất diphosphatidylinositol-3,4,5-triphosphat, phosphatidylinositol-4,5- biphosphat va phosphatidylinositol-3 ,4-biphosphat [48]

Trang 17

chất lưỡng cực như các acid béo và các acyl CoA [48] 1.2.5 Vai trò của enzym G6Pase trong một số bệnh lý

Với vai trò thủy phân glucose-6-phosphat, G6Pase kết thúc quá trình

TTD va thối hóa glycogen, do đó đóng vai trò quan trọng trong điều hòa

đường huyết

Hội chứng Gierke hay còn gọi là hội chứng tích lũy glycogen ở gan (GSD I-glycogen storage disease) có nguyên nhân là sự bất thường của enzym

G6Pase Hội chứng này được biểu hiện bởi các triệu chứng như tăng đường huyết, tăng lipid, tích lũy glycogen ở gan, chậm lớn, tăng uric GSD I được

chia ra làm 4 type khác nhau dựa trên nguyên nhân khác nhau gây ra:

- GSD type la do sự mất hoạt tính của G6Pase, trong trường hợp này người ta sẽ không đo được hoạt tính của enzym trong microsom gan Sự thiếu hụt enzym này là do sự đột biến gene mã hóa enzym [48] Loại này chiếm khoảng 80% trong tổng số các trường hợp GSD

- GSD type Ib, Ic, Id (hay GSD non Ia) cac trường hợp này được phát hiện ra vào cuối thập kỷ 60 thế kỷ XX Các bệnh nhân có cùng triệu chứng như trên nhưng hoạt tính enzym G6Pase đo được tại gan bình thường, nguyên nhân tìm ra là do sự thiếu hụt tương ứng của kênh vận chuyên GÓP, kênh vận chuyén Pi, kénh van chuyén glucose [48],[27]

Bên cạnh đó các nhà khoa học cũng nhận thấy hoạt tính G6Pase tăng lên rất cao ở gan chuột công mới sinh đề đáp ứng đủ nhu cầu năng lượng cần thiết cho giai đoạn đầu đời, khi mà nguồn dinh dưỡng dự trữ khơng cịn nữa, cơ thể phải tự cung cấp bằng việc tăng tao glucose théng qua TTD [43] G than, hoat tính G6Pase cũng tăng cao trong thời kì này và duy trì trong 2-3 tuần sau khi

sinh Đói và ĐTĐ cũng làm tăng từ 2-3 lần hoạt tính G6Pase ở gan [48] Trong nghiên cứu của Hurst, chuột sau khi nhịn đói 3 ngày hoạt tính G6Pase

Trang 18

đã tăng 71,47% Cũng theo nghiên cứu này, ở chuột ĐT thực nghiệm do STZ, hoat tinh G6Pase da tang 246,6%, va trén chudt DTD thuc nghiệm do alloxan hoat tinh tang 148,3% so với chuột bình thường [34] Theo nghiên cứu của B.Ragavan, hoạt tính G6Pase ở chuột bình thường là 39,46 tăng lên 109,89 ở chuột ĐT thực nghiệm bởi alloxan (don vi hoat d6 mmol Pi giai

phong/phut/mg protein) [47] Viéc tang tao glucose thông qua tăng hoạt tính của G6Pase tại các thời điểm xa bữa ăn giúp dam bảo cho đường huyết ôn

định, cung cấp năng lượng hoạt động cho các cơ quan, đặc biệt là não, nhưng

lại là nguyên nhân làm nặng thêm tình trạng ĐT ở người bệnh

1.2.6 Các phương pháp xác định hoạt độ G6Pase

Hiện nay trên thế giới có nhiều phương pháp xác định hoạt độ G6Pase,

nhưng về cơ bản các phương pháp đó đều dựa trên 2 nhóm phương pháp chủ yếu sau

1.2.6.1 Các phương pháp dựa trên định lượng phospho vô cơ

Các phương pháp này đều dựa trên nguyên tắc: G6Pase xúc tác cho phản

ứng thủy phân GÓP tạo ra glucose va phospho vô cơ, do đó thơng qua định

lượng phospho vô cơ có thể tính được hoạt độ của enzym G6Pase Sự khác

nhau của các phương pháp này là việc sử dụng các chất dừng phản ứng hoặc

sử dụng thêm một số chất làm tăng độ nhạy cho quá trình định lượng Trong đó có 2 phương pháp hay được sử dụng là phương pháp cua Majorie va Bangiski

s* Phương pháp của MaJorie

Dịch nghiền gan được cho thêm cơ chất GóP trong môi trường đệm citrat

pH 6,5, ủ trong thời gian 10 phút ở nhiệt độ 37°C Phản ứng được ngừng bằng

TCA, lúc này enzym hoàn toàn bị mất hoạt tính Hoạt độ G6Pase được xác

định thông qua định lượng phospho vơ cơ có trong dịch sau phản ứng Thông

Trang 19

thường định lượng phospho vô cơ thường sử dụng là kỹ thuật của Fisk va

Subbarow [51]

s* Phương pháp của Bagiski

Về nguyên tắc của phương pháp hoàn toàn giống như phương pháp của Majorie nhưng khác ở dung dịch đệm Bagiski sử dụng đệm natri cacodylate

pH 6,5, mơi trường có thêm EDTA, thêm cơ chất GóP và ủ ở 37°C Việc định

lượng phospho v6 co theo kỹ thuật của Bagiski [13]

Đánh giá hai phương pháp định lượng:

Trong phương pháp của Bagiski: ngoài tac dung én định màu, Arsenit citrat cịn có tác dụng hạn chế sai số cho phản ứng vì nó tác dụng với lượng dư Amoni molypdat, ngăn không cho phản ứng với phospho nêu có bị thủy

phân sau thời gian ủ Việc sử dụng EDTA là do khả năng tạo phức chelat với

các ion kim loại, giúp ồn định hoạt tính enzym trong quá trình định lượng Do đó sai số của phương pháp này thấp hơn so với phương pháp của Majorie

Nhưng phương pháp của Majorie là phương pháp được sử dụng rộng rãi vì nó tiến hành đơn giản, hóa chất dễ kiếm, không độc

1.2.6.2 Phương pháp sử dụng glucose dehydrogenase

Theo M.Alergre, hoạt độ enzym G6Pase được xác định bằng cách đo tốc độ giải phóng glucose Glucose dưới tác dụng của enzym glucose

dehydrogenase với sự có mặt của NADP+ tạo ra glucono-1,5-lacton, NADPH và H+ Dựa vào khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh của NADPH ở bước sóng 340nm có thể định lượng được glucose giải phóng Đơn vị hoạt độ enzym G6Pase tinh bang s6 pg G6P thuy phan trong 1 phút trén 1g protein [10]

Ưu điểm: nhanh, không cần qua bước ly tâm, loại tủa, và trung hòa

Trang 20

do glucose dehydrogenase chi tac dung trén co chat B-D-glucose do d6 phai sử dụng thêm một enzym là mutarotase (aldose -l-epimerase) thực hiện phản

ứng:

a-D-glucose mutarotase B-D-glucose 1.3 Thuốc tác dụng trên hoạt tính enzym G6Pase

1.3.1 Tân dược

Mục tiêu quan trọng nhất trong điều trị ĐTĐ là hạ glucose huyết Trong

các nhóm thuốc sử dụng trong ĐTĐ hiện nay chỉ có nhóm biguanide có tác

dụng hạ glucose huyết dựa trên cơ chế ức chế tổng hợp và giải phóng glucose huyết từ gan, trong đó ức chế quá trình biểu thị gen của enzym G6Pase Trong nhóm này, metformin là thuốc được sử dụng nhiều nhất, tính trong năm 2006, trên thế giới có 35 triệu đơn thuốc kê metformin [57] Trên thị trường có

nhiều biệt dược chứa metformin như: Glucophage, Riomet, Fortamet, Glumetza, Obimet, Dianben, Diabex, Diaformin

Đi từ tác dụng ức chế G6Pase của acid chlorogenic, các nhà khoa học

Đức đã nghiên cứu mối quan hệ cấu trúc-tác dụng của các chất tông hợp, xuất phát từ tiền chất ban đầu này Trong số các chất tổng hợp được, S-3483 là

chất có tác dụng tốt nhất S-3483 tác dụng trên G6Pase do uc ché kénh van

chuyển GóP (kênh TI) Chuột sau khi nhịn đói có mức đường huyết 4-5

mmol được tiêm S-3483 với liều 50mg/kg/h, nồng độ glucose giảm sau 90 phút Chuột sau khi ăn có mức đường huyết 6-7 mmol được tiêm S-3483 với liều tương tự, làm nồng độ glucose giảm nhanh mặc dù q trình thối hóa ølycogen đã được kích thích bằng việc tiêm glucagon trước đó

Do ức chế kênh vận chuyên TI, ở chuột sau khi tiêm S-3483 có sự tăng rõ rệt của nồng độ GóP và glycogen S-3483 đã qua giai đoạn thử trên động

vật và bước đầu đã cho kết quả tốt trên người [31]

Trang 21

OH

Hinh 1.5 Cong thire cia S — 3483

Một số các thuốc có nguồn géc steroid nhu dehyroepiandrosterone sulfat [56], estron sulfat đã được sử dụng nhiều năm với mục đích khác, nay mới được phát hiện ra tác dụng ức chế G6Pase thông qua ức chế kênh vận chuyên glucose-6-phosphatase (T1) [18]

1.3.2 Được liệu

Nhiều dược liệu dùng điều trị DTD đã được chứng minh có tác dụng ức chế hoạt tính G6Pase

Trước hết phải kể đến một dược liệu rất quen thuộc với người Việt Nam là Mướp dang (Momordica charantia) Da co nhiéu nghién ctru ching minh về tác dụng hạ đường huyết của Mướp đắng D Sathish đã xác định cơ chế tác dụng của Mướp đắng là: ức chế G6Pase (giảm 44%), FBPase (giảm 33%), kích thích hoạt tính enzym hexokinase (tăng 98%) [49]

Gần day, La Na (Annona squamosa) được chứng minh có tác dụng hạ

đường huyết Trên mơ hình ĐTĐ thực nghiệm gây bởi alloxan, đường huyết

Trang 22

nước lá Annona squamosa làm tăng nồng dé insulin huyết thanh (27.6%), kích thích glucose gia nhập tô chức (57%), ức chế glucose hấp thu qua ruột (18,1%), giảm glycosylate hemoglobin (30%) và ức chế G6Pase (34,3%) [36]

Nghiên cứu của C.Mallick cho thấy sự phối hợp 2 dược liệu là hạt của

cây Eugenia jambolana và rễ cây Musa paradisiaea cho kết quả hạ đường huyết đáng kể Dịch chiết metanol của hai dược liệu này làm giảm đường

huyết trên mô hình ĐTĐ thực nghiệm gây bởi STZ, kích thích hoạt tính enzym hexokinase, catalase, ức chế các enzym của quá trình TTĐ như

FBPase, G6Pase trong d6 G6Pase bị ức chế 35% [39]

Ngồi ra cịn có một số các được liệu có tác dụng hạ đường huyết do ức

chế G6Pase như 4egle marimelos [50], Cardiospermum halieaeabum [S3], Coccinia indica [45]

1.4 Bằng lăng nước

1.4.1 Đặc điểm thực vật

- Cây gỗ có kích thước trung bình, thân cây thắng và khá nhẫn nhụi

- Lá bầu dục, tròn ở gốc, nhọn ngắn ở chóp, dài 10-20 em, rộng 5-9 cm,

dai, rất nhẫn, cả 2 mặt lá đều có màu nhạt

- Chùy hoa đứng ở ngọn, nhánh có lơng, nụ hoa đỏ Hoa to, rộng 3 em

hay hơn, màu đỏ tím; đài có lơng sát; 6 cánh hoa có cuống 5mm; nhị nhiều Ra hoa vào tháng 4

- Quả nang tròn dài dạng trứng (20xI§ mm) mang lá đài xòe ra, no lam 6 mảnh

- Hạt có đường kính 12-15 mm

1.4.2 Công dụng và tác dụng được lý

- Vỏ cây có tác dụng kích thích và giảm sốt Nước sắc từ vỏ thường được

dùng để chữa đau bụng, tiêu chảy [3] [2]

Trang 23

- Rễ có tác dụng săn se, kích thích và hạ nhiệt [3] - Hạt có chất gây ngủ [3], [6]

- Quả dùng đề đắp ngoài trị lở miệng [3], [6]

- Lá già và quả chín của cay co kha nang ha glucose huyết, tác dụng này tương đương với 6 — 7,7 đơn vị Insulin [2]

1.4.3 Thành phần hóa học

Theo nghiên cứu của Phạm Thúy Hà, trong các phân đoạn dịch chiết,

phân đoạn n-hexan và phân đoạn nước là 2 phân đoạn có tác dụng hạ đường

huyết tốt nhất [4] Tìm hiểu về cơ chế hạ đường huyết của 2 phân đoạn này, nghiên cứu của Phạm Quang Hiệp và Phương Thu đã ghi nhận tác dụng ức chế lên hoạt tính của 2 enzym là FBPase và a-amylase [5],[9] Điều này phù hợp với các thành phần hóa học được tìm ra trong lá BLN

s* Các triterpenoid

Acid corosolie (acid 2ơ-hydroxyursolic) là một trong những hợp chất đầu tiên được phát hiện và nghiên cứu nhiều nhất trong lá BLN, cơ chế hạ đường huyết của chất này là do:

Tăng GLUT4-protein ở cơ và tế bào mỡ do đó tăng đáp ứng với kích thích của insulin [41]

Ức chế ơ-glucosidase do đó làm giảm sự thủy phân tỉnh bột, dẫn

đến hạn chế tăng glucose huyết sau khi ăn [33]

Ức chế TTĐ thông qua việc tăng sản xuất F-2,6-BP [35]

Tăng hoạt tính của enzym glucokinase [3Š]

Y Uc ché hoat tinh enzym glycogen phosphorylase 6 gan chudét [54]

Từ đó có thể thấy acid corosolic tác dụng hạ đường huyết thông qua

nhiều cơ chế, chính vì vậy trên thị trường đã xuất hiện một số các chế phẩm

Trang 24

——— - = — = — —— = —————

Ngoài ra, trong lá BLN cịn có các triterpenoid khác như: acid oleanolic,

acid arjunolic, acid asiatic, acid maslinic [33] Gần đây nhất, Phùng Thanh Hương đã tim ra | triterpenoid 1a acid ursolic c6 trong can chiét phan doan n- hexan [7]

** Cac tannin

Y Lagerstroemin 1a 1 chat thudc nhom ellagitannin - có trong dich chiết nước, tác dụng hạ đường huyết thông qua cơ chế: làm tăng

vận chuyển và hấp thu glucose, ngồi ra lagerstroemin cịn kích

thích sự phosphoryl hóa tiêu phân B của receptor insulin ở nồng độ 150uM [28] Nếu so sánh với insulin trên sự kích thích vận chuyển glucose thì hoạt tính của lagerstroemin bằng 54% [29]

Y Cac gallotanin:

Trong đó hợp chất quan trọng là PGG (penta-O-galloyl-D-

glucopyranose), PGG co 2 dang la a va B, trong do dang a có tác dụng tốt hơn Cơ chế của nhóm này chủ yếu là kích thích glucose gia nhập vào tô chức [37]

Trang 25

PHAN 2 THUC NGHIEM VA KET QUA 2.1 Đối tượng và nguyên liệu nghiên cứu

La BLN (Lagerstroemia speciosa (L.)) đã được xác định tên khoa học và

lưu mẫu tại bộ môn Thực vật trường ĐH Dược Hà Nội

Động vật: chuột nhat trang, chung Swiss (Mumus culus), giống đực, trọng lượng trung bình 25g do Viện vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp

Co chat Glucose-6-phosphat (Fluka biochemie Gmbh CH 9471) Eikonogen (Sigma Aldrich)

Streptozotocin (STZ) (Pharmacia & Upjohn)

Dụng cụ nghiên đồng thê

Máy ly tâm lạnh (Heraeus Sepatech)

May đo quang phô UV-VIS (U1800-HITACHI)

Bộ kit và máy đo đường huyết Johnson & Johnson Dung dich dém citrat pH 6,5

Các hóa chất khác đạt độ tinh khiết hóa học

Trang 26

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp điều chế các phân đoạn dịch chiết

Lá BLN tươi, rửa sạch, phơi, sấy ở 50°C, nghiền thành bột thô Chiết

ngắm kiệt 1,l kg bột dược liệu khô với ethanol 70° Dịch chiết đem cất thu

hồi dung môi dưới áp suất giảm đề thu được dịch cô đặc Tiếp tục lắc với n-

hexan trong bình gạn, phân đoạn n-hexan thu được đem cất thu hồi dung môi

đến cắn (28,2g) Cắn này pha thành hỗn dịch (hỗn dịch A) trong nước cất đề

thử nghiệm trên chuột với liều tương đương 18§,2g dược liệu khơ/kg Phần

dịch nước còn lại sau khi tách phân đoạn n-hexan được phân đoạn tiếp với

chloroform, ethylacetat, butanol cho đến khi thu được phần dịch nước cuối

cùng Thêm nước cất vào khuấy đều để thu được hỗn dịch phân đoạn nước

(hỗn dịch B) theo tỉ lệ 1g dược liệu khô/ml dùng thử nghiệm cho chuột với

liều tương đương 18,2g dược liệu khô/kg

2.2.2 Phương pháp xác định ảnh hưởng của dịch chiết lên hoạt độ enzym G6Pase

2.2.2.1 Trên chuột bình thường

Chuột chia thành 3 lô, mỗi lô 10 con Chuột trước khi thử nghiệm được

nhịn đói 12h Để đánh giá tác dụng của dịch chiết khi dùng liều đơn, cho

chuột uống các phân đoạn dịch chiết, sau 3h mồ lấy gan để xác định hoạt độ

enzym Để đánh giá tác dụng của các phân đoạn dịch chiết khi dùng liều lặp

lại, cho chuột uống dịch chiết trong I0 ngày Vào ngày thứ 10, sau khi uống dịch chiết 3h, mỏ lấy gan để xác định hoạt độ enzym

2.2.2.2 Trên mơ hình chuột gây tăng đường huyết bằng STZ

Chuột được tiêm màng bụng dung dịch ŠTZ (150mg/kg) Sau 72h định lượng đường huyết lúc đói, lựa chọn chuột có đường huyết trên 12mmolI

Trang 27

Chia chuột thành 3 lô, mỗi lô 10 con Mỗi lô cho uống thuốc tương ứng trong 10 ngày Vào ngày thứ 10, sau khi uống thuốc 3h, mỗ lấy gan để xác định hoạt độ enzym G6Pase

2.2.3 Phương pháp định lượng đường huyết

Phương pháp glucose oxidase (GOD) với kit và máy đo đường huyết tự

động (Johnson & Johnson) Nguyên tắc:

Glucose được oxi hóa thành acid gluconic nhờ enzym gÌucose oxidase

theo phan tng (1)

Glucose + H,0 +O, ——» acid gluconic + H,O, (1)

Q- dianisidin + HạO; ——* phức hợp màu vàng nâu + H;O (2)

HạO; tạo thành sẽ bị peroxidase phân hủy và giải phóng oxi, oxi hóa o- dianisidin để tạo thành phức chất có màu vàng nâu theo phản ứng (2) Cường

độ màu xác định bằng phương pháp đo quang tương ứng với lượng glucose

trong mẫu cần định lượng

2.2.4 Phương pháp xác định hoạt độ enzym glucose-6-phosphatase

2.2.4.1 Nguyên tắc

Glucose-ó-phosphat + HạO_ G6Pase _ Glucose + phospho v6 co (Pi) Pi sinh ra duge xac dinh theo kỹ thuật của Fiske và Subbarow

Đơn vị hoạt độ của G6Pase được tính bằng số ng Pi sinh ra trong 1 phút trén Img protein gan ở điều kiện nhiệt độ 37°C, pH 6,5 Hàm lượng protein trong gan được định lượng bằng phương pháp Lowry

2.2.4.2 Phương pháp chiết enzym

Trang 28

Cân 1g gan, cắt thành các mảnh nhỏ, sau đó cho vào ống nghiền đồng

thể đã có sẵn Iml dung dịch đệm lạnh (pH = 6,5) Nghiền gan trong điều kiện lạnh (T<4°C) đến khi thu được dịch đồng thể, sau đó thêm đệm lạnh để được

tỷ lệ (gan: đệm) 1a (1:5) Dịch nghiền thu được đem ly tâm lạnh ở 0°C với tốc độ 10000 vòng/phút trong 30 phút Phần dịch trong thu được sau khi ly tâm được dùng để xác định hoạt độ enzym

2.2.4.3 Phản ứng enzym

Phản ứng được tiến hành trong ống nghiệm 5 ml gồm: 0,5 ml đệm citrat

(0,1M, pH 6,5), 0,2 mÌ nước cất, 0,1 ml co chat Dich enzym va co chat duoc

ủ ở 37°C trong 10 phút Thời gian phản ứng được tính từ lúc thém 0,2 ml dich enzym Tiếp tục ủ trong 10 phút Sau đó thêm 2ml tricloacetic (TCA) 10% dé

dừng phản ứng, lắc kỹ, để yên trong 5 phút, ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch trong làm thí nghiệm xác định P!

Tiến hành tương tự làm mẫu đối chứng thay cơ chất bằng nước cất, mẫu trắng thay cơ chất và dịch enzym bằng nước cất

2.2.5 Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu được biêu diễn bằng x„ + SE, kết quả được xử lý bằng toán thống kê, so sánh 2 giá trị trung bình bằng Test - student trên phần mềm Microsoft Excel 2003

Trang 29

2.3 Két qua

2.3.1 Ảnh hưởng của phân đoạn dịch chiết lá BLN khi ding liều đơn đối với hoạt độ enzym G6Pase ở gan chuột bình thường

Chuột bình thường nhịn đói 12 giờ, được cho uống thuốc với liều đơn, Sau đó, gây mê chuột bằng chloroform, mô lấy gan để xác định hoạt độ

enzym Kết quả được trình bày trong bảng 2.l

Bảng 2.1

đơn lên hoạt độ G6Pase ở chuột bình thường

Ảnh hưởng của phân đoạn dịch chiết khi dùng liều

STT Lơ Hoạt độ GóPase % Hoạt độ | Mức độ chuột (ugPi/phútmg protein) enzym ức chế

l Chứng 100% 0,706 + 0,012 2 Uống 0,727 + 0,022 103% -3% HAD p > 0,05* 3 Uống 0,712 + 0,040 101% -1% HDB p>0,05 *

*: sự thay đôi hoạt độ G6Pase so với lô chứng

(Kết quả cho trên bảng là giá trị trung bình của 10 chuột, mỗi gan được tiền hành lặp lại trong 3 lần)

Trang 30

Hoat d6 enzym G6Pase (1 Pi/phit/ mg protein)

Lô chứng Lô uống Lé uéng

HDA HDB

Biéu d6 2.2 Ảnh hưởng của các phân đoạn dịch

chiết khi dùng liều đơn lên hoạt độ G6Pase ở chuột bình thường Nhận xét : khi cho chuột bình thường uống liều đơn duy nhất: > Lô chuột uống hỗn dịch A có hoạt độ G6Pase thay đổi khơng có

ý nghĩa thống kê với lô chứng

>_ Lô chuột uống hỗn dịch B có hoạt độ G6Pase thay đổi không có

ý nghĩa thống kê với lô chứng

Trang 31

2.3.2 Ảnh hưởng của phân đoạn dịch chiết khi dùng liều lặp lại lên hoạt độ G6Pase ở chuột bình thường

Bảng 2.3 Ảnh hưởng của phân đoạn dịch chiết khi dùng liều lặp lại lên hoạt độ G6Pase ở chuột bình thường

Hoạt độ GóPase % Hoạt độ | Mức độ

STT Lô chuột l (ugPi/phut/mg protein) enzym ức chê

] Chitng 0,703 + 0,020 100% 0,647 + 0,019 2 Uông HDA p >0,05 92% 8% , 0,640 + 0,020 Uông HDB 3 p>0,05 91% 9%

* sự thay đổi hoạt độ G6Pase so với lô chứng

(Kết quả cho trên bảng là giá trị trung bình của 10 chuột, mỗi gan

được tiến hành lặp lại trong 3 lần)

Trang 32

0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 Hoạt d6 enzym G6Pase (1 Pi/phút/ mg protein)

Lochung eee Léuong

, HDE

Biểu đồ 2.4 Ảnh hưởng của phân đoạn dịch chiết khi dùng liều lặp lại

lên hoạt độ G6Pase ở chuột bình thường Nhận xét khi dùng liều lặp lại:

> Lô chuột uống hỗn dịch A có hoạt độ G6Pase khác nhau khơng

có ý nghĩa thống kê với lô chứng

> Lô chuột uống hỗn dịch B có hoạt độ G6Pase khác nhau khơng

có ý nghĩa thống kê với lô chứng

Trang 33

2.3.3 Ảnh hưởng của phân đoạn dịch chiết lá BLN đối với hoạt độ enzym G6Pase ở gan chuột gây tăng đường huyết bởi STZ

Chuột gây tăng đường huyết bởi STZ được cho uống các phân đoạn dịch

chiết trong 10 ngày Sau đó tiến hành xác định hoạt độ G6Pase Kết quả được

thê hiện trong bảng 2.5 và 2.6

Bảng 2.5 Ảnh hưởng của các phân đoạn dịch chiết lên hoạt độ G6Pase ở chuột tiêm STZ

Hoạt độ G6Pase Mức độ ức (ugP1⁄phút/mg % Hoạt độ chế so với STT Lô chuột

protein) enzym lô chứng

bệnh 1 | Chứng thường 0,703 + 0,020 100% 0,981 + 0,051 2 Chứng bệnh 140% p<0.,01* 0,793 + 0,015 3 |Lôuông HDA 113% 27% p < 0,05** : 0,713 + 0,008 4 | L6u6ng HDB 101% 39% p <0,05** *: su thay déi hoạt độ G6Pase so với lô chứng thường

Trang 34

2.4 Ban luan

2.4.1 Phương pháp xác định hoạt độ enzym G6Pase * Lựa chọn phương pháp

Trong các phương pháp xác định hoạt độ enzym, dựa trên cơ sở phân

tích các ưu nhược điểm chúng tôi quyết định sử dụng phương pháp với TCA

làm chất dừng phản ứng và định lượng Pi theo ky thuat cua Fiske & Subbarow

Điểm khác so với phương pháp của Nguyễn Văn Mùi: Nguyễn Văn Mùi

cho TCA vào ống chứng trước thời gian ủ, vào ống thử sau thời gian ủ, trong khi đó chúng tôi cho TCA vào ống chứng sau thời gian ủ hỗn hợp phản ứng 10 phút, tức là T1CA được đồng thời cho vào ống thử và ống chứng ở cùng

một thời điểm Sự thay đỗi này dựa trên cơ sở: trong gan ln có một nồng độ

GóP nhất định — là sản phẩm của quá trình TTĐ và thối hóa glycogen đã xảy

ra trước đó Do đó nếu theo Nguyễn Văn Mùi, ống thử được cho TCA vào sau, lượng enzym có trong gan sẽ xúc tác cho phản ứng thủy phân Gó6P, trong khi ống chứng enzym đã bị mắt hoạt tính, điều này sẽ gây ra sai số dương cho

kết quả định lượng

Điểm thứ hai, theo Nguyễn Văn Mùi, trong kỹ thuật định lượng Pi str dụng dung dịch eikonogen 0,25% còn trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng dung dịch eikonogen 2,5%

Sự thay đôi này dựa trên cơ sở của phản ứng định lượng P!:

Pi+molypdat ———m> phospho-molypdat

Phospho-molypdat + eikonogen —————> phức molypden

Trang 35

Phức molypden có màu xanh, được đem đo quang, từ đó tính được lượng

Pi

Để so sánh được hoạt độ enzym (ug Pi/phútmg protein) đòi hỏi tất cả

lượng PiI phải được tham gia phản ứng hết, tức là lượng thuốc thử màu

(molypdat, eikonogen) phải dư Theo Nguyễn Văn Mùi nếu sử dụng eikonogen 0,25%, với nồng độ thấp như vậy lượng Pi sẽ không được tạo

thành hết ở dạng phức molypden, đồng thời tăng nồng độ eikonogen giúp mở rộng khoảng tuyến tính của đường chuẩn định lượng Pi (theo nghiên cứu của

Phạm Quang Hiép) [5]

Lựa chọn nồng độ cơ chất:

Nông độ cơ chất G6P sử dụng trong nghiên cứu là 0,03M Chúng tôi sử

dụng nồng độ này là do kết quả của một khảo sát về mối tương quan giữa

nồng độ G6Pase với mật độ quang A đo được (được làm độc lập không báo cáo trong khóa luận này) Theo khảo sát đó, khi thời gian phản ứng được có

định trong 10 phút, với nồng độ cơ chất GóP là 0,03M, lượng cơ chất tham gia phản ứng đạt 40% Điều này phù hợp với các mục đích của nghiên cứu:

e Nếu sử dụng nồng độ cao hơn sẽ gây lãng phí, tốn kém

e Nếu sử dụng nồng độ thấp hơn, trên mơ hình chuột gây tăng

đường huyết bởi STZ, hoạt tính G6Pase tăng cao, nồng độ cơ chất thấp sẽ không đủ bão hòa enzym

2.4.2 Ảnh hưởng của các phân đoạn dịch chiết lên hoạt độ enzym G6Pase

Khi sử dụng dịch chiết với liều đơn, trên chuột bình thường hoạt độ

G6Pase thay đổi khơng khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng Điều này có thê do liều đơn chưa đủ để làm thay đôi hoạt tính G6Pase, hoặc

Trang 36

để thay đối hoạt độ G6Pase cần thời gian dài hơn Do đó chúng tôi quyết định

thử tác dụng của 2 phân đoạn dịch chiết trên chuột bình thường với liều lặp lại Sau 10 ngày dùng dịch chiết liên tục, hoạt độ G6Pase thay đổi cũng khơng có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lơ chứng Trong khi đó theo nghiên cứu của Phạm Thị Thúy Hà, trên chuột bình thường, hai phân đoạn BLN đều có tác dụng hạ đường huyết ngay cả khi sử dụng liều đơn lẫn liều lặp lại [4] Điều này có thê giải thích do trong lá BLN có chứa những hoạt chất có tác dụng hạ đường huyết theo những cơ chế gây hạ đường huyết trực tiếp, như:

+ Tăng vận chuyển glucose vào tổ chức

+ Kích thích sự phosphoryl hóa tiêu phân của receptor của

insulin do đó tăng sử dung glucose

Đối với G6Pase khi thử với liều lặp lại lẫn liều đơn, sự thay đổi về hoạt

độ G6Pase khơng có ý nghĩa thống kê, có hai khả năng: hoặc là các phân đoạn dịch chiết không có tác dụng trên hoạt độ G6Pase, hoặc là tác dụng ức chế G6Pase chỉ xuất hiện ở chuột có sự rối loạn chuyền hóa Do đó đề có thể kết luận được tác dụng của các phân đoạn trên hoạt độ G6Pase cần phải thử trên mơ hình ĐT thực nghiệm

Trên thế giới đã có nhiều mơ hình tăng đường huyết thực nghiệm, trong

nghiên cứu này chúng tôi quyết định lựa chọn mơ hình tăng đường huyết bởi STZ do mơ hình này có nhiều ưu điểm:

- Chọn lọc trên tế bào tụy Khi tiêm ST”, STZ co ai lực với protein GLUT2 nên STZ tập trung chủ yếu tại tụy, do đó ít gây ảnh hưởng đến các cơ quan khác trong cơ thể

- _ So với các phương pháp khác, gây mơ hình tăng đường huyết thực nghiệm bằng STZ cho đáp ứng nhanh hơn, và đường huyết duy

trì ở mức cao ơn định trong nhiêu ngày

Trang 37

Mơ hình gây tăng đường huyết thực nghiệm bởi STZ với đặc điểm đặc trưng là nồng độ insulin thấp Bình thường insulin có tác dụng ức chế, kìm

hãm enzym G6Pase do đó làm giảm quá trình TTĐ, trong khi đó ở mơ hình nay do néng dé insulin rat thấp cùng với các rối loạn chuyển hóa khác làm

cho khả năng kiểm soát enzym này khơng cịn nữa nên hoạt độ enzym này tăng cao ở nhóm chứng SŠTZ so với nhóm chứng bình thường (nhóm chứng thường 0,673 so với nhóm chứng bệnh 0,981 ugPi/phúƯmg protein gan, tăng

45,77%)

Trong hai phân đoạn, phân đoạn nước (HDB) có tác dụng tốt hơn so với

phân đoạn n-hexan(HDA) (HDB ức chế 39%, HDA ức chế 27%) Điều này có

mối liên hệ với nghiên cứu về thành phần hóa học trong lá BLN của Phạm

Thị Thúy Hà, trong phân đoạn n-hexan thành phần chủ yếu là các saponin, trong khi đó phân đoạn nước chủ yếu là các tanin ngoài ra cịn có sapponin,

flavonoid Tac dung ức chế G6Pase ở hai phân đoạn có thể có mối liên hệ với

thành phần saponin, ngoài ra do khả năng ức chế G6Pase của phân đoạn nước tốt hơn nên có thể một thành phần nào đó có trong phân đoạn này cũng có tác dụng ức chế G6Pase Theo một nghiên cứu của Heeok Hong, địch chiết toàn

phần lá BLN (chứa 1% acid corosolic) có tác dụng ức chế G6Pase thận (nhóm

chứng 3,23 U/ml, nhóm thử 2,41 U/ml), nhưng cũng theo nghiên cứu này dịch chiết toàn phần lá BLN không làm thay đôi nồng độ insulin huyết thanh [30]

Như vậy BLN ức chế G6Pase với cơ chế độc lập không thông qua làm tăng insulin, cơ chế có thể là:

> Ức chế quá trình biểu thị gen đặc hiệu mã hóa enzym thông qua một chất trung gian chuyển hóa nào đó

> Tăng hoạt tính của protein kinase hoạt hóa AMP (AMPK)- là

một enzym có khả năng ức chế các enzym của quá trình TTĐ, tăng

hoạt tính insulin (cơ chế này tương tự Mướp đắng) [52]

Trang 38

Khi diéu tri liéu lặp lại trên nhóm chuột đã tiêm ST”, cả hai phân đoạn đều có tác dụng làm giảm hoạt độ G6Pase Từ kết quả trên, có thể kết luận: hai phân đoạn dịch chiết BLN chỉ có tác dụng ức chế G6Pase trên chuột có sự rối loạn chuyển hóa Một kết quả tương đồng cũng được ghi nhận trong nghiên cứu của Phạm Quang Hiệp về tác dụng của các phân đoạn dịch chiết trên enzym F-1,6-BPase, hai phân đoạn dịch chiết này cũng chỉ có tác dụng ức chế enzym F-I,6-BPase trên mơ hình tăng đường huyết thực nghiệm Trong nghiên cứu của Kotaro, acid corosolic làm tăng nòng độ của F-2,6-BP

[35], một chất không phải là sản phẩm trung gian của con đường đường phân hay TTĐ, nhưng có vai trò quan trọng trong điều hòa đường huyết, chất này

có tác dụng hoạt hóa PFK-I đồng thời ức chế enzym F-1,6-BPase Tuy nhién cũng trong nghiên cứu izviro này, acid corosolic khơng có tác dụng ức chế enzym G6Pase điều này có thể do acid corosolic chỉ có tác dụng trên mơ hình

invivo Theo nghiên cứu của Chaodong, F-2,6-BP giảm biểu thị gen của

G6Pase đồng thời tăng biểu thị gen của hexokinase, nên F-2,6-BP còn được

gọi là chất có hoạt tính insulin [20] Mặt khác các thuốc điều trị ĐTĐ hiện

nay có một số thuốc là hạ glucose huyết dựa trên cơ chế tăng tạo F-2,6-BP,

dẫn tới kích thích thối hóa glucose đồng thời ức chế quá trình TTĐ Cơ chế

của địch chiết lá BLN trên hoạt tính G6Pase thơng qua chất trung gian F-2,6-

BP mới là giả thuyết được đặt ra, đê khăng định giả thuyết này cần làm thêm

Trang 39

PHAN 3 KET LUAN VA DE XUAT 3.1 Kết luận

Từ các kết quả thu được trong thực nghiệm,chúng tôi rút ra các kết luận sau:

Với liều thử nghiệm

_ Trên chuột bình thường: phân đoạn dịch chiết nước và phân

đoạn dịch chiết n-hexan không làm thay đổi hoạt độ enzym G6Pase

Trên chuột gây tăng đường huyết bởi STZ: phân đoạn dịch

chiết nước và phân đoạn n-hexan có tác dụng làm giảm hoạt độ enzym

G6Pase

3.2 Đề xuất

Để tìm hiểu sâu hơn về tác dụng hạ đường huyết của lá BLN, chúng tôi xin dua ra mot số đề xuất sau:

* Nghiên cứu thành phần hóa học của các phân đoạn dịch chiết lá BLN để tìm ra chất có tác dụng ức chế hoạt tính enzym G6Pase

* Nghiên cứu động học enzym dé tim hiéu co chế ức chế hoạt tính enzym G6Pase của chất tìm được ở trên

Trang 40

TAI LIEU THAM KHAO

TAI LIEU TIENG VIET

1 Ta Van Binh (2006), Bénh dai thao duéng — tang glucose mau, Nha xuat ban Y học tr.31

2 Võ Văn Chỉ (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr.76

3 Võ Văn Chi, Trần Hiệp (2002), Cây cỏ có ích ở Việt Nam, NXB Y học, t2, tr.1025-1026

4 Phạm Thị Thúy Hà (2008), “Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh hoc ha glucose huyét của các phân đoạn dịch chiết lá cây bằng lăng nước (Lagerstroemia speciosa(L.) Pers.)”°, khóa luận dược sĩ, đại học dược Hà Nội, tr.21-28

5, Pham Quang Hiệp (2008), “Nghiên cứu ảnh hưởng của phân đoạn dịch chiết lá bằng lăng nước (Lagerstroemia speciosa(L.) Pers.) lên hoạt tính enzym fructose-I,6-biphosphatase ở gan chuột nhắt?, khóa luận dược sĩ, Đại học được Hà Nội, tr.20-29

6 Phạm Hoàng Hộ (2000), Cáy cỏ Việt Nam, NXB Thống kê, tr.29

7 Phùng Thanh Hương, Nguyễn Xuân Thắng, Đỗ Ngọc Liên, Nguyễn Xuân

Cường, Phạm Văn Kiém (2008), “Cac hop chat flavonoit glycosit va triterpenoit từ lá cây bằng lăng nước (Lagerstroemia speeiosa(L.) Pers.)”, tạp chí hóa học, tr.160 — 165