phân lập và tuyển chọn vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt từ trái cây

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ACID ACET

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ACID ACETIC CHỊU NHIỆT TỪ TRÁI CÂY

MSSV: 3113710 LỚP: VI SINH VẬT HỌC K37

Cần Thơ, Tháng 12/2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ACID ACETIC CHỊU NHIỆT TỪ TRÁI CÂY

MSSV: 3113710 LỚP: VI SINH VẬT HỌC K37

Cần Thơ, Tháng 12/2014

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

XÉT DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

Xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban Giám đốc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện

đề tài này

Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ cán bộ

và sinh viên trong Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực phẩm Tôi chân thành cám ơn cô Ngô Thị Phương Dung, thầy Phạm Hồng Quang và thầy Huỳnh Xuân Phong đã tận tình truyền đạt kiến thức cùng với anh Nguyễn Ngọc Thạnh, anh Bùi Hoàng Đăng Long đã tận tình giúp đỡ hướng dẫn và đóng góp ý kiến cho tôi trong suốt quá trình thực hiện thí nghiệm để tôi hoàn thành tốt đề tài luận văn

Tôi xin chân thành cám ơn những người bạn đã luôn bên cạnh, động viên tôi trong những lúc khó khăn và giúp đỡ xuyên suốt quá trình thực hiện thí nghiệm và hoàn thành luận văn

Cám ơn các anh chị cao học cũng đã giúp đỡ và chỉ dạy tận tình cho tôi

Nguyễn Thị Ngọc Giao

Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học i Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học

TÓM TẮT

Vi sinh vật chịu nhiệt bao gồm vi khuẩn lên men acid acetic là những nguồn giống chủng đang được quan tâm nghiên cứu trong những năm gần đây Acid acetic là một acid hữu cơ được sử dụng rất phổ biến trong điều vị và chế biến thực phẩm Mục tiêu của đề tài là phân lập, tuyển chọn và thử khả năng lên men của các chủng vi khuẩn acid acetic ở các nhiệt độ khác nhau Đề tài đã phân lập được 30 chủng vi khuẩn acid acetic từ 15 loại trái cây Phân loại các chủng AAB thông qua khả năng oxy hóa acetate cho thấy có 18 chủng Acetobacter và 12 chủng thuộc giống Gluconobacter Thử nghiệm khả năng sinh acid trên môi trường có 0,01% bromocresol green đã sơ tuyển được 15 chủng có khả năng sinh acid nhanh và mạnh thông qua khả năng hình thành vùng phân giải sau 36-48 giờ ủ ở 30 o C với đường kính vùng phân giải >20 mm Tuyển chọn được 4 chủng có khả năng phát triển tốt đến

41 o C, riêng chủng C2 có khả năng phát triển đến 43 o C, khả năng chịu acid acetic lên đến 2,5% Thử nghiệm khả năng lên men acetic ở 30 o C, 37 o C, 38 o C và 39 o C trên môi trường YPGD bổ sung 4% v/v ethanol trong điều kiện ủ lắc 150 vòng/phút trong 7 ngày đã tuyển chọn được 2 chủng vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt lên men acid acetic

là C2 và NH2 với nồng độ acid acetic lần lượt đạt 3,56 và 3,44% (w/v) ở 38 o C

Từ khóa: acid acetic, chịu acid, chịu nhiệt, lên men acid acetic, vi khuẩn acid acetic

Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học ii Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học

MỤC LỤC

Trang PHẦN KÝ DUYỆT

LỜI CẢM TẠ

TÓM TẮT i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG v

DANH SÁCH HÌNH vi

CÁC TỪ VIẾT TẮT vii

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 3

2.1.1 Nghiên cứu ngoài nước 3

2.1.2 Nghiên cứu trong nước 3

2.2 Vi khuẩn acid acetic 4

2.2.1 Giới thiệu vi khuẩn acid acetic 4

2.2.2 Phân loại 4

2.2.3 Vai trò quan trọng của vi khuẩn acid acetic 6

2.3 Giới thiệu về acid acetic 8

2.3.1 Giới thiệu chung acid acetic 8

2.3.2 Phương pháp sản xuất 9

2.3.3 Ứng dụng 10

2.4 Tổng quan về quá trình lên men của vi sinh vật 12

Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học iii Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học

2.4.1 Bản chất của quá trình lên men 12

2.4.2 Quá trình lên men acid acetic 12

2.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 13

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

3.1 Phương tiện nghiên cứu 15

3.1.1 Thời gian và địa điểm 15

3.1.2 Nguyên liệu 15

3.1.3 Thiết bị - dụng cụ và hóa chất 15

3.1.4 Phương pháp theo dõi các chỉ tiêu 16

3.1.5 Phương pháp thống kê và xử lý số liệu 16

3.2 Phương pháp nghiên cứu 17

3.2.1 Phân lập các chủng vi khuẩn acid acetic 17

3.2.2 Đặc tính hình thái, sinh lý và sinh hóa 17

3.2.3 Sơ tuyển các chủng vi khuẩn có khả năng sinh acid acetic 18

3.2.4 Khảo sát khả năng chịu acid ở các nồng độ acid khác nhau 18

3.2.5 Khảo sát khả năng chịu nhiệt của vi khuẩn acid acetic 18

3.2.6 Tuyển chọn chủng vi khuẩn AAB chịu nhiệt 19

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 20

4.1 Phân lập và xác định đặc tính của các chủng vi khuẩn acid acetic 20

4.2 Đặc tính hình thái, sinh lý và sinh hóa của các chủng AAB 22

4.3 Kết quả thử nghiệm khả năng sinh acid acetic 25

4.4 Khả năng chịu acid của vi khuẩn acid acetic 27

4.5 Khả năng chịu nhiệt của vi khuẩn acid acetic 28

4.6 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn acid acetic 30

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36

Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học iv Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học

5.1 Kết luận 36 5.2 Đề nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1: HÌNH ẢNH THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG THÍ NGHIỆM

PHỤ LỤC 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

PHỤ LỤC 3: BẢNG KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM

PHỤ LỤC 4: KẾT QUẢ THỐNG KÊ

Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học v Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1: Kết quả phân lập các chủng AAB 22

Bảng 2: Kết quả phân loại các chủng AAB 24

Bảng 3: Tỷ lệ vi khuẩn Acetobacter và Gluconobacter 25

Bảng 4: Hình dạng khuẩn lạc và đặc điểm hình thái của các chủng AAB 26

Bảng 5: Kết quả thử nghiệm khả năng chịu acid cao của 15 chủng AAB 28

Bảng 6: Kết quả thử nghiệm khả năng chịu nhiệt cao của 15 chủng AAB 30

Bảng 7: Kết quả thí nghiệm khả năng sinh acid và chọn 15 chủng tốt nhất 4

Bảng 8: Bảng thống kê sự phát triển của 4 chủng AAB 5

Bảng 9: Số liệu về hàm lượng acid của 4 chủng AAB 6

-Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học vi Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1: Vi khuẩn Acetobacter aceti 5

Hình 2: Cấu trúc hóa học của acid acetic 9

Hình 3: Đặc điểm khuẩn lạc AAB trên môi trường có chứa CaCO3 20

Hình 4: Hình hình dạng vi khuẩn và nhuộm Gram của một số chủng AAB 21

Hình 5 : Sự biến đổi màu môi trường chỉ thị sau 72 giờ 23

Hình 6: Sự biến đổi màu chỉ thị của một số chủng AAB 25

Hình 7: Khả năng chịu acid của các chủng AAB ở 0,5%; 1,0%; 1,5%; 2,0%, 2,5% 27

Hình 8: Khuẩn lạc của các chủng AAB ở: 30o C, 37oC, 39oC, 41oC và 43oC 29

Hình 9: Sự phát triển của 4 chủng vi khuẩn AAB ở 30oC 31

Hình 10: Hàm lượng acid của 4 chủng AAB ở 30o C 31

Hình 11: Sự phát triển của 4 chủng vi khuẩn AAB ở 37o C 32

Hình 12: Hàm lượng acid của 4 chủng AAB ở 37o C 32

Hình 13: Sự phát triển của 4 chủng vi khuẩn AAB ở 38oC 33

Hình 14: Hàm lượng acid của 4 chủng AAB ở 38o C 33

Hình 15: Sự phát triển của 4 chủng vi khuẩn AAB ở 39o C 34

Hình 16: Hàm lượng acid của 4 chủng AAB ở 39oC 34

Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học vii Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học

Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 1 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Hiện nay, acid hữu cơ không chỉ ứng dụng trong công nghệ thực phẩm mà còn ứng dụng nhiều trong công nghiệp như: công nghiệp tổng hợp hữu cơ, công nghiệp thực phẩm, công nghiệp chế biến mủ cao su,… cho nên nhu cầu ngày càng tăng, đặc biệt là acid acetic Acid acetic được dùng nhiều trong sản xuất các sản phẩm như: giấm, L-sorbose, dihydroxyacetone, D-gluconate, keto-D-gluconates (Matsushita, 2009),… Ở nước ta việc sản xuất acid acetic chủ yếu chỉ bằng phương pháp truyền thống với quy mô nhỏ phục vụ cho công nghiệp thực phẩm Với quy mô này thì không thể đáp ứng được nhu cầu ngày càng tăng ở nước ta trong các ngành công nghiệp, nhất

là công nghiệp chế biến mủ cao su

Acid acetic có thể dùng trực tiếp trong các bữa ăn gọi là giấm ăn Trong những nghiên cứu gần đây của nhiều nhà khoa học, giấm có chứa như acid amin, glycerin có tác dụng làm mềm da, loại bỏ gàu, giảm cân, chữa lành da khô nức nẻ, làm dịu cổ họng, giảm cháy nắng và ong đốt, tốt cho người bị viêm khớp, giảm nhức do bị sứa cắn, đau do viêm xoang,… Mới đây, các nhà khoa học Venezuela đã phát hiện thấy acid acetic có khả năng chống lại vi trùng lao và các vi khẩn kháng thuốc khác (Jim Sliwa, 2014) Để có được các sản phẩm lên men acid acetic này nhờ vào một nhóm vi khuẩn gọi chung là vi khuẩn acid acetic (Acetic Acid Bacteria, AAB)

Trong những năm gần đây, việc gia tăng nhiệt độ toàn cầu làm xã hội có một số thách thức nghiêm trọng trong việc lên men với quy mô công nghiệp vì những hệ thống làm lạnh lớn tiêu tốn nhiều năng lượng để giữ ở nhiệt độ tối ưu Vì vậy, việc phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn chịu nhiệt lên men acid acetic thu hút nhiều sự quan tâm vì nó mang lại lợi nhuận rất lớn cho xã hội Qua đó có thể tiến tới quy trình sản xuất giấm và các sản phẩm lên men từ AAB ở quy mô công nghiệp mang lại hiệu quả kinh tế cao cho nhà sản xuất, an toàn cho sức khỏe đồng thời giảm giá thành cho người tiêu dùng Bên cạnh đó, việc phân lập và định danh các chủng AAB cũng góp phần làm phong phú thêm nguồn đa dạng sinh học đặc biệt là nguồn vi sinh vật

Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 2 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học

Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, điều kiện tự nhiên và khí hậu phù hợp để phát triển nhiều loại cây ăn quả thuộc các dạng từ quả ôn đới như mận, đào đến quả cận nhiệt đới như vải thiều hay quả nhiệt đới như măng cụt, sầu riêng,… Tính đến năm 2004, diện tích cây ăn quả nước ta đạt 747,8 nghìn ha Trong đó, Đồng bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) là vùng cây ăn quả quan trọng nhất của Việt Nam với diện tích khoảng 253 nghìn ha, chiếm hơn 35% diện tích cây ăn quả cả nước (theo Tổng cục Thống kê Việt Nam) Trong các loại cây ăn quả của Việt Nam thì có 5 nhóm chính: vải, chôm chôm, nhãn; chuối; xoài; quả có múi và dứa, chiếm hơn 73% tổng diện tích trồng cây ăn quả cả nước Từ những lý do trên với nguồn nguyên liệu trái cây

dồi dào, sẵn có quanh năm Dựa vào đó mà đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn

acid acetic chịu nhiệt từ trái cây” được thực hiện nhằm mục đích đa dạng hơn về

nguồn nguyên liệu: mẫu và địa danh, mong muốn phân lập được nhiều chủng vi khuẩn acid acetic có khả năng chịu nhiệt cao và sinh acid mạnh Từ đó có thể phân loại các chủng AAB có đặt tính tốt và tiến tới việc sản xuất giống thuần chủng cung cấp cho các cơ sở sản xuất

1.2 Mục tiêu đề tài

Đề tài nhằm phân lập và tuyển chọn được vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt từ trái cây để lên men acetic

Nội dung thực hiện:

- Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn acid acetic

- Khảo sát các đặc tính hình thái, sinh lý và sinh hóa của các chủng phân lập

- Khảo sát khả năng chịu nhiệt và chịu acid acetic của các chủng phân lập

- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển và lên men acetic

- Tuyển chọn các chủng AAB chịu nhiệt lên men tốt nhất

Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 3 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.1.1 Nghiên cứu ngoài nước

Theo nghiên cứu tại Châu Phi, nhiều nhà nghiên cứu về công nghệ vi sinh đã phân lập được một số chủng chịu nhiệt cao lên men tốt Ndoye (2006) đã dựa vào đặc tính chịu nhiệt của AAB, chọn lọc ra 2 chủng AAB chịu nhiệt: CWBI-B418 thuộc loài

Acetobacter senegalensis và CWBI-B419 thuộc loài Acetobacter pasteurinus phân lập

từ trái xoài ở Burkina Faso, có khả năng phát triển và lên men acid acetic tối ưu ở

35oC và có thể phát triển đến 42oC trong 17 chủng AAB phân lập từ trái cây và ngũ

cốc Gần đây các nhà khoa học đã phân loại các vi khuẩn AAB trong họ

Acetobacteraceae thành 9 giống: Acetobacter, Gluconobacter, Acidomonas,

Gluconacetobacter, Asaia, Kozakia, Swaminathania, Saccharibacter, Neoasaia và Granulibacter (Cleenwerck et al., 2002; Loganathan và Nair, 2004; Jojima et al.,

2004; Yukphan et al., 2005; Greeberg et al., 2006) Ở Thái Lan, Amornrut Moryadee

và Wasu Pathom-Aree, 2008 đã phân lập được 43 giống Acetobacter, 13 giống

Gluconobacter từ 13 loại trái cây như: táo, anh đào Jamaica, nhãn, xoài, dứa và chôm

chôm,…

2.1.2 Nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về vi khuẩn acid acetic điển hình như:

Nghiên cứu điều kiện lên men của các chủng vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt (Đặng Thụy Thùy Vân 2010) đã phân lập được hơn 20 chủng từ 10 loại trái cây khác nhau Trong đó, Acetobacter và Gluconobacter được sử dụng lên men acid acetic phổ biến

nhất vì chúng có khả năng oxy hóa rượu tốt tạo acid acetic với nồng độ cao và hiểu được cơ chế lên men chịu nhiệt của AAB Chọn giống vi khuẩn và khảo sát một số điều kiện lên men acetic để làm giấm trái cây; Đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lên men acid acetic chịu nhiệt” của Huỳnh Xuân Phong (2011) đã phân lập được 132 chủng từ 27 loại mẫu bao gồm các sản phẩm lên men, hoa và trái cây của một số loại cây ăn quả sơ tuyển được 13 chủng chịu nhiệt và sinh acid mạnh Gần đây, Võ Thị Ngọc Bích (2012), với đề tài “Ảnh hưởng của ethanol và acid acetic đến khả năng lên

men của Acetobacter tropicalis” đã khảo sát và so sánh các đặc tính sinh lý,sinh hóa,

nhưng nhìn chung, nguồn nguyên liệu trái cây để phân lập tìm ra vi khuẩn acid acetic

Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 4 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học

có khả năng lên men tốt chưa được đa dạng Vì thế, đề tài “ Phân lập và tuyển chọn vi

khuẩn acid acetic chịu nhiệt từ trái cây” nhằm mục đích đa dạng nguồn nguyên liệu

cũng như đa dạng về loài của chủng vi khuẩn này

2.2 Vi khuẩn acid acetic

2.2.1 Giới thiệu vi khuẩn acid acetic

Hiện nay, người ta đã biết tới hơn 20 loài AAB, những vi khuẩn này dễ tìm thấy trong không khí, đất và nước Vì vậy, các dịch nước quả, bia, rượu thấp, dịch đường,… để hở tiếp xúc với không khí dễ bị vẫn đục nhẹ, trên mặt tạo thành 1 lớp màng mỏng, mịn, màu trắng xám hoặc vàng xám Đó là do các vi khuẩn acid acetic phát triển Trước đây, Pasteur cho rằng quá trình lên men giấm là do một loại vi sinh

vật gây ra và được gọi là Mycoderma aceti Sau này, người ta biết đó là nhiều loài vi khuẩn thuộc nhóm Acetobacter hoặc Bacterium

Vi khuẩn acid acetic là vi khuẩn Gram âm, có thể xếp thành chuỗi dài hay chuỗi ngắn, có khi đứng riêng lẻ Là các trực khuẩn, không sinh bào tử (Lương Đức Phẩm, 2001)

Ngoài ra, A’ngel et al (2005) còn phát hiện thêm chủng vi khuẩn Acetobacter có

dạng hình elip, từ đó cho thấy sự đa dạng về hình dạng của loài vi khuẩn này

Trong môi trường đủ rượu etylic (5-13%) thì sản phẩm chủ yếu là acid acetic, nếu nồng độ rượu thấp hơn các vi khuẩn acetic oxy hóa triệt để rượu tạo thành CO2 và nước

Vi khuẩn acid acetic rất hiếu khí Tốc độ sinh trưởng của chúng rất nhanh, từ 1 tế bào sau 12 giờ có thể phát triển thành 17 triệu tế bào Trong quá trình sinh trưởng và phát triển chúng tạo thành acid acetic và nồng độ acid thấp lại kích thích sự sinh trưởng của chúng Vì vậy, trong sản xuất giấm có thể dùng rượu không cần thanh trùng được bổ sung một ít acetic để acid hóa môi trường (Lương Đức Phẩm, 1998)

2.2.2 Phân loại

Vi khuẩn AAB thuộc Acetobacteraceae và được phân loại thành 9 giống:

Acetobacter, Gluconobacter, Acidomonas, Gluconacetobacter, Asaia, Kozakia, Swaminathania, Saccharibacter, Neoasaia và Granulibacter (Cleenwerch et al., 2002;

Loganathan và Nair, 2004; Jojima et al., 2004; Greeberg et al., 2006) Tuy nhiên trong

Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 5 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học

tài liệu phân loại học Bergey (Holt et al., 1994) chỉ phân loại vi khuẩn AAB thành 3

nhóm chính là Gluconobacter, Acetobacter và Frateuria

Phân loại vi khuẩn AAB dựa trên các đặc điểm hình thái học và các đặc điểm sinh lý, sinh hóa được mô tả trong tài liệu phân loại học Bergey: Gram âm biến đổi và khi biến đổi, tế bào hình elip thành hình cầu, xuất hiện đơn lẻ, thành từng cặp hay kết hợp thành chuỗi.Các dạng biến đổi có thể xuất hiện như hình cầu, thon dài, phình bầu, hình gậy, cong hoặc dạng sợi Có thể di động nhờ các chiên mao hoặc không di động Không hình thành nội bào tử, hiếu khí Sinh vật tự dưỡng, catalase dương tính (ngoại

trừ A pasteurianus subsp paradoxus và A peroxydans) Oxydase âm tính Nhiệt độ

tối thích 25-30oC pH tối thích 5-6 Không phân hủy nitrate, không tạo indole Oxy hóa ethanol tạo acid acetic ở môi trường có pH trung tính và acid (pH 4,5) Mol% G+C của DNA trong khoảng 51-65%

 Một số loài vi khuẩn acetic có nhiều ý nghĩa thực tế

Acetobacter aceti: hình que ngắn, không sinh bào tử, thường kết dính nhau thành

chuỗi dài Tế bào chất được nhuộm bằng iod cho màu vàng Giống này có thể phát triển ở nồng độ rượu 11% và tích tụ trong môi trường tới 6% acid acetic Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng là 34o

C

Hình 1: Vi khuẩn Acetobacter aceti

(*Nguồn: Becca,2012) Acetobacter pasteurianum: Hình que ngắn, tế bào chất nhuộm bằng iod có màu

xanh

Acetobacter orleaneuse: hình que nhỏ, hai đầu hơi nhọn, phát triển thành màng

mỏng nhưng chắc trên bề mặt dịch nuôi cấy Tế bào chất nhuộm iod cho màu vàng

Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 6 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học

Giống này có thể phát triển ở dung dịch 9-12% rượu và tạo thành được 9,5% acid acetic

Acetobacter xylinum: có khả năng tạo thành màng mạnh và đôi khi màng khá

dày Màng nhuộm bằng iod và acid sulfuric cho màu xanh Giống này tích tụ được 4,5% acid acetic Đôi khi loài này được dùng với nấm men để sản xuất đồ uống có độ rượu thấp

Acetobacter schiitzenbachii: hình que, tương đối dài kết hợp thành chuỗi, không

sinh bào tử, không chuyển động, Gram âm Các tế bào giả tạo thành màng chặt nhưng không chắc Vì vậy, giống này có thể dùng để sản xuất theo phương pháp chìm và có thể tạo thành 11,5-12% acid acetic trong dịch nuôi cấy

Acetobacter curvum: có đặc tính tương tự như Acetobacter schiitzenbachii tạo

thành màng chắc, không làm bẩn vỏ bào và làm đục giấm Nhiệt độ tối thích sinh trưởng là 35-37oC, còn Acetobacter schiitzenbachii là 28oC

Acetobacter suboxydans: vi khuẩn này được dùng nhiều trong công nghiệp

vitamin để sản xuất acid ascorbic Trong lên men nhờ các chủng vi khuẩn suboxydans

acid acetic được tích tụ lại trong môi trường mà không bị oxy hóa tiếp Các loài có khả

năng oxy hóa cao tiếp tục chuyển hóa acid acetic được xếp vào nhóm peroxydans, như

Acetobacter suboxydans, Acetobacter pasteurianum (Lương Đức Phẩm, 1998)

Các loài của Acetobacter chứa 5 đặc điểm: có mặt catalase, oxy hóa ethanol qua

acid acetic tới CO2 và nước, oxy hóa lactate thành carbonate, oxy hóa glycerol thành DHP và sự sản sinh acid gluconic từ glucose (Kiều Hữu Ảnh, 1999)

2.2.3 Vai trò quan trọng của vi khuẩn acid acetic

Sản xuất giấm ăn: Trong lên men acetic, cơ chất chủ yếu là ethanol với nồng

độ trên dưới 10% trong môi trường Có 2 phương pháp lên men acetic:

- Phương pháp nhanh: còn gọi là phương pháp Đức, hiện nay được sử dụng để

sản xuất giấm ăn trên thế giới Giống được sử dụng là Acetobacter schiitzenbachii và

Acetobacter curvum Cho dịch lên men và oxy hóa rượu thành acid Như vậy, nhờ phoi

bào chủng môi trường chảy chậm, quanh co, diện tích tiếp xúc với vi khuẩn rất lớn Hơn nữa, để tăng hiệu quả oxy hóa người ta phun môi trường thành bụi và thổi không khí vào thùng lên men qua các lớp phoi bào từ dưới lên trên Mỗi lần môi trường qua lớp phoi bào bị nóng lên vì phản ứng oxy hóa và vi khuẩn hô hấp tỏa nhiệt VÌ vậy

Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 7 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học

trước khi co môi trường phun thành bụi lần sau cần phải làm lạnh Môi trường có thể cho qua lớp phoi bào nhiều lần để cho vi khuẩn tiếp xúc và oxy hóa hầu hết rượu trong

đó để biến thành giấm (rượu etylic dư khoảng 0,1-0,2% g/L) Nhiệt độ lên men trong khoảng 8-10 ngày.Với phương pháp này người ta có thể lên men các thùng gỗ tới 10

m3

- Phương pháp chậm: còn gọi là phương pháp Orlean hoặc phương pháp Pháp,

giống ở đây được sử dụng là Acetobacter orleaneuse Phương pháp này hiệu suất thấp

nhưng thích hợp cho công việc làm giấm ở gia đình hoặc sản xuất ở quy mô nhỏ dùng rượu lại, dịch đường, nước quả hoặc bia hỏng, rượu vang kém chất lượng cho lên men

Ngoài ra còn phương pháp lên men chìm với chủng vi khẩn Acetobacter

suboxydans Các nồi lên men đặc biệt được thông khí mạnh (acetator), khi thay thế

từng phần dịch dinh dưỡng cũng được thông khí đầy đủ Sau khi ethanol được chuyển thành acid acetic thì cũng rút bớt phần lớn và đưa dịch mới vào nồi lên men tiếp tục Với phương pháp lên men như vậy gần như là lên men bán liên tục Lên men ở 28-

32oC khoảng 2 ngày (Lương Đức Phẩm, 1998)

Sản xuất thạch dừa: thạch dừa là món ăn thú vị dùng để tráng miệng và được

dùng chung với sirô thêm hương Thạch dừa được tạo thành bởi sự lên men của vi

khuẩn Acetobacter xylinum trong môi trường nước dừa già và nước cốt dừa loại béo Khi vi khuẩn Acetobacter xylinum sống trong môi trường nước dừa thì glucose sẽ kết

hợp với acid béo để tạo thành một chất mầm ở màng tế bào cùng với enzyme Enzyme này có thể polymer hóa glucose thành cellulose

Sản xuất vitamin C: Trong sản xuất vitamin C cần nguyên liệu đầu là

L-sorbose Muốn có sorbose cần phải chuyển hóa từ D-sorbit là một sản phẩm hóa học được biến đổi từ glucose, sự chuyển hóa sorbit thành sorbose phải nhờ vi khuẩn

Acetobacter suboxydans với enzyme xúc tác là sorbit-dehydrogenase Quá trình

chuyển hóa kéo dài 1-3 ngày và có thể bổ sung sorbit một lần nữa để tổng nồng độ đạt tới 30% Hiệu suất chuyển hóa sorbit thành sorbose có thể đạt tới 90% (Lương Đức Phẩm, 1998)

Một số ứng dụng khác: Màng BC (bacteria cellulose) thu nhận bằng phương

pháp lên men bề mặt sau 1 ngày Sau khi xử lý màng thực phẩm BC đạt giá trị cảm

Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 8 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học

quan, có độ chịu lực cao và không bị biến tính khi xử lý nhiệt Sử dụng màng BC làm màng bao xúc xích được đánh giá tốt Dùng BC làm màng bảo quản dừa tươi giữ nguyên chất lượng sau 2 tuần bảo quản ở nhiệt độ phòng và 4 tuần bảo quản ở nhiệt độ mát

Sử dụng màng BC hấp phụ Bacterionic 200 AU/mL có thể bảo quản 3 ngày thịt tươi sơ chế tối thiểu ở nhiệt độ mát Sản phẩm sữa chua uống với nồng độ bột BC 0,5% đạt chất lượng về chỉ tiêu cảm quan, không tách lớp, dung dịch đồng nhất trong thời gian bảo quản (Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Như Huỳnh 2012.Tạp chí Công nghệ Sinh học, số 50)

Ngoài ra vi khuẩn Acetobacter còn được ứng dụng trong sản xuất nước giải khát,

bánh mì đen,… (Bùi Thị Quỳnh Hoa và Nguyễn Bảo Lộc, 2008)

2.3 Giới thiệu về acid acetic

2.3.1 Giới thiệu chung acid acetic

Acid acetic (hay còn gọi là acid ethanoic) là một acid hữu cơ, công thức hóa học

là CH3COOH, khối lượng phân tử của acid acetic là 60 g/mol Acid acetic là một acid yếu, thuộc nhóm acid monoprotic

Acid acetic tan tốt trong nước, ethanol, eter, benzene, acetone và chloroform; không tan trong CS2 Acid acetic rất bền với các chất oxy hóa như acid chromic và permanganate Có khả năng hòa tan cellulose, các hợp chất tương tự cellulose, phân hủy da, gây bỏng da, ăn mòn nhiều kim loại Nó có thể hòa tan không chỉ trong các hợp chất phân cực như các muối vô cơ và các loại đường mà còn có khả năng hòa tan trong các hợp chất không phân cực, các nguyên tố như lưu huỳnh và iod Acid acetic

có thể ăn mòn các kim loại như sắt, mangan và kẽm sinh ra khí hydro và các muối kim loại tương ứng gọi là các muối acetate

Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 9 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học

Hình 2: Cấu trúc hóa học của acid acetic

(* Nguồn: Ben Mills,2009)

là một

Năm 1847, nhà hóa học người Đức, Hermann Kolbe lần đầu tiên tổng hợp acid acetic từ các vật liệu vô cơ Chuỗi phản ứng này gồm quá trình clo hóa carbon disulfua (CS2) thành carbon tetraclorua (CCl4), sau đó là quá trình nhiệt phân thành tetracloruethylen và clo hóa trong nước tạo thành acid tricloracetic (C2HCl3O2) và cuối cùng là phản ứng oxy hóa khử vô cơ bằng cách điện phân tạo thành acid acetic

Năm 1910, phần lớn các acid acetic được sản xuất từ sản phẩm trung gian là rượu chưng cất từ gỗ Loại rượu này cho tác dụng với canxi hydroxyde tạo ra canxi acetate, sau đó cho canxi acetate tác dụng với acid sulfuric thu được acid acetic

Acid acetic chủ yếu được sản xuất theo 2 phương pháp sinh học và tổng hợp, acid sản xuất theo phương pháp sinh học chỉ chiếm khoảng 9% sản lượng thế giới, khoảng 75% sản xuất ở quy mô công nghiệp theo phương pháp carbonyl hóa methanol, 15% còn lại sản xuất theo phương pháp khác

Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 10 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học

Tổng sản lượng acid acetic ước tính khoảng 5 triệu tấn/năm, khoảng nửa trong số

đó được sản xuất ở Hoa Kỳ Sản lượng ở châu Âu khoảng 1 triệu tấn/năm và đang giảm, trong khi đó Nhật Bản sản xuất khoảng 0,7 triệu tấn/năm Khoảng 1,5 triệu tấn được tái chế hàng năm, nâng tổng sản lượng trên thị trường thế giới lên 6,5 triệu tấn/năm

2.3.3 Ứng dụng

Acid acetic là một chất phản ứng được dùng để sản xuất các hợp chất hóa học Lượng sử dụng riêng lẻ lớn nhất là để sản xuất monomer vinyl acetate, tiếp theo là sản xuất acetic anhydryde và ester Lượng acid acetic dùng để sản xuất giấm là rất nhỏ so với lượng sử dụng trên

 Ứng dụng trong sản xuất monomer vinyl acetate

Ứng dụng chủ yếu của acid acetic là sản xuất monome vinyl acetate Ứng dụng này tiêu thụ khoảng 40% đến 45% sản lượng acid acetic trên thế giới Phản ứng có sự tham gia của etylen với oxy và chất xúc tác là palladi

2 H3C-COOH + 2 C2H4 + O2 → 2 H3C-CO-O-CH=CH2 + 2 H2O Vinyl acetate có thể được polyme hóa tạo thành polyvinyl acetate hoặc thành các polyme khác ứng dụng trong sơn và chất kết dính

 Ứng dụng trong sản xuất ester

Các ester chính sản xuất từ acid acetic được sử dụng chủ yếu làm dung môi cho mực, sơn và chất phủ Các ester như ethyl acetate, n-butyl acetate, và propyl acetate, chúng được sản xuất một cách đặc biệt bằng phản ứng có xúc tác từ acid acetic và rượu tương ứng: H3C-COOH + HO-R → H3C-CO-O-R + H2O (R = nhóm ankyl) Tuy nhiên, hầu hết ester acetate được sản xuất từ acetaldehyde bằng phản ứng Tishchenko Thêm vào đó, các eter acetate được sử dụng làm các dung môi để loại bỏ nitrocellulose, sơn acrylic, véc-ni, và chất tẩy gỗ Đầu tiên, glycol monoete được tạo ra

từ etylene oxit hoặc propylen oxit với rượu, sau đó chúng được ester hóa với acid acetic Ba sản phẩm chính là etylen glycol monoetyl eter acetate (EEA), etylen glycol mono-butyl eter acetate (EBA) và propylen glycol mono-metyl eter acetate (PMA) Ứng dụng này tiêu thụ khoảng 15% đến 20% sản lượng acid acetic thế giới Các eter acetate, ví dụ như EEA được cho là có hại đối với sức khỏe sinh sản con người

Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 11 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học

 Ứng dụng trong sản xuất acetic anhydryde

Sản phẩm tách phân tử nước từ hai phân tử acid acetic tạo thành một phân tử gọi

là acetic anhydryde Sản xuất acetic anhydryde trên thế giới là một ứng dụng chính chiếm khoảng 25% đến 30% sản lượng acid acetic toàn cầu Acetic anhydryde có thể được sản xuất trực tiếp bằng carbonyl hóa methanol từ acid và các nhà máy sản xuất theo công nghệ Cativa có thể được điều chỉnh để sản xuất anhydryde Acetic anhydryde là một chất acetyl hóa mạnh Vì vậy, ứng dụng chính của nó là tạo cellulose acetate, một chất dệt tổng hợp cũng được dùng trong phim chụp ảnh Acetic anhydryde cũng là một chất phản ứng dùng để sản xuất aspirin, heroin, và các hợp chất khác

 Giấm

Ở dạng giấm, các dung dịch acid acetic (nồng độ khối lượng của acid 4% đến 18%) được dùng trực tiếp làm gia vị, và cũng làm chất trộn rau và trong các thực phẩm khác Giấm ăn (table vinegar) thì loãng hơn (4% đến 8%), trong khi loại giấm trộn thương mại thì nồng độ cao hơn Lượng acid acetic dùng làm giấm không chiếm tỷ lệ lớn trên thế giới, nhưng là một ứng dụng nổi tiếng và được dùng từ rất lâu

 Làm dung môi

Acid acetic băng là một dung môi protic phân cực tốt như đề cập ở trên Nó thường được dùng làm dung môi tái kết tinh cho các hợp chất hữu cơ tinh khiết Acid acetic tinh khiết được dùng làm dung môi trong việc sản xuất acid terephthalic (TPA), một nguyên liệu thô để sản xuất polyetylen terephthalate (PET) Năm 2006, khoảng 20% acid acetic được dùng để sản xuất TPA

Acid acetic thường được dùng làm dung môi cho các phản ứng liên quan đến carbocation, như Friedel-Crafts alkylation Ví dụ, một giai đoạn trong sản xuất long não tổng hợp thương mại liên quan đến sự tái sắp xếp Wagner-Meerwein của tạo amfen isobornyl acetate; ở đây acid acetic đóng vai trò vừa là dung môi, vừa là chất ái nhân để giữ carbocation tái sắp xếp Acid acetic là dung môi tự chọn khi giảm một nhóm nitơ aryl tạo anilin bằng cách sử dụng carbon mang palladi

Acid acetic băng được sử dụng trong hóa phân tích để ước tính các chất có tính bazơ yếu như các amid hữu cơ Acid acetic băng có tính bazơ yếu hơn nước, vì vậy amid được xem như một bazơ mạnh trong dung dịch acid trung bình này Sau đó nó có

Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 12 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học

thể được chuẩn độ bằng cách sử dụng một dung dịch acid acetic băng của một acid rất mạnh như acid percloric

 Ứng dụng trong chế biến mủ cao su

Để chống đông mủ cao su, thường dùng NH3 3% Sau khi pha loãng và khuấy trộn mủ với NH3, thường cho thêm vào dung dịch acid acetic 2,5% với lượng là 3,5-9 kg/tấn dung dịch mủ cao su

2.4 Tổng quan về quá trình lên men của vi sinh vật

2.4.1 Bản chất của quá trình lên men

Công nghệ lên men từ vi sinh vật là công nghệ vi sinh và cũng chính là một trong các ngành quan trọng của công nghệ sinh học Công nghệ lên men vi sinh là một quá trình được ứng dụng nhiều trong sản xuất tạo ra các sản phẩm bằng kỹ thuật lên men với sự tham gia của các chủng vi sinh vật khác nhau

Quá trình lên men là một quá trình sinh học diễn ra liên tục, bắt đầu từ khâu tạo giống nhân giống sinh khối, lên men và thu nhận sản phẩm cuối cùng và các giai đoạn này có liên quan mật thiết với nhau, ảnh hưởng qua lại lẫn nhau và hàng loạt các sản phản ứng sinh hóa diễn ra với sự tham gia xúc tác của các hệ enzyme vốn được sinh ra

từ các chủng vi sinh vật tham gia trong quá trình

Bản chất của công nghệ lên men là những phản ứng oxy hóa khử sinh học, oxy hóa các hợp chất hữu cơ ở cơ thể sinh vật do các hệ enzyme oxy hóa khử cung cấp Các quá trình này diễn ra trong điều kiện yếm khí hoặc hiếu khí

Tùy theo hệ enzyme tham gia vào quá trình lên men và tùy thuộc vào chủng vi sinh mà người ta chia quá trình lên men thành ba nhóm chính:

- Lên men nhờ vi khuẩn như lên men acetic, lactic, butylic,…

- Lên men nhờ nấm mốc như lên men acid citric, gluconic,…

- Lên men nhờ nấm men như lên men bia, rượu, men bánh mì,…

2.4.2 Quá trình lên men acid acetic

Acid acetic (CH3COOH) có thể thu được bằng phương pháp tổng hợp hóa học và lên men sinh học Acid này dùng trong sản xuất chất màu, chất thơm, dung môi hữu

cơ, ướp chua rau củ, chế biến thực phẩm,… Acid acetic dùng trong trực tiếp trong các bữa ăn gọi là giấm ăn Đó là sản phẩm lên men acid acetic Quá trình lên men nhờ một

Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 13 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học

nhóm vi khuẩn gọi chung là vi khuẩn acid acetic, chúng oxy hóa ethanol thành acid acetic

Thực chất của quá trình này là sự lên men oxy hóa (oxydative fermentation) gồm hai phản ứng của 2 enzyme nằm trên màng tế bào của AAB xúc tác là Alcohol-dehydrogenase (ADH) và Aldehyde-dehydrogenase (ALDH)

Hydrogen được nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP) nhận và qua các cytochrome của chuỗi hô hấp được chuyển cho O2 (chấp nhận) từ trước đến nay, quá trình lên men acid acetic thuộc lên men hiếu khí nhưng thực chất đây là một quá trình chuyển hóa: vi sinh vật sử dụng cơ chất ethanol và chuyển thành acid acetic Methylenetetrahydrofolate reductase (NADPH2) xuất hiện trong quá trình này có lẽ được chuyển hóa qua chuỗi hô hấp để thu năng lượng Quá trình này cũng được coi là oxy hóa không hoàn toàn Cơ chất được phân giải không hoàn toàn, trong khi oxy là chất nhận hydro (Lương Đức Phẩm, 1998)

2.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men

Từ dịch đường bằng phương pháp lên men ta có thể thu được nhiều sản phẩm khác nhau Mỗi loại vi sinh vật có thể cho một hoặc nhiều sản phẩm khác nhau tùy theo điều kiện môi trường hoặc một loại sản phẩm có thể thu được từ nhiều loại vi sinh vật khác nhau

Nhìn chung các quá các quá trình lên men dù khác nhau về cơ chế, về điều kiện lên men nhưng đều có thể bị ảnh hưởng nhất định bởi môi trường

 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Mỗi vi sinh vật đều có nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của chúng Đối với chủng

ưu nhiệt trung bình, thì nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển sinh khối và lên men là

30-32oC Ở những nhiệt độ không thích hợp, hoạt tính enzyme giảm hẳn và đôi khi xảy ra hiện tượng lên men phức tạp

Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 14 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học

giảm mức độ thẩm thấu các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên men Đối với vi khuẩn lactic, khi pH nhỏ hơn 4 thì vi khuẩn ngừng hoạt động trong khi nấm men vẫn hoạt động bình thường và phát triển mạnh

 Ảnh hưởng nồng độ dịch lên men

Nồng độ dịch lên men là cơ chất của quá trình lên men Nếu nồng độ đường quá cao sẽ dẫn đến làm tăng áp suất thẩm thấu và làm mất cân bằng trạng thái sinh lý của

vi sinh vật Bình thường dịch lên men có nồng độ chất tan từ 16-18% tương đương với khoảng 15% đường đối với quá trình lên men rượu và khoảng 9% đường đối với quá trình lên men lactic

Ngoài các yếu tố trên, lượng oxy cũng ảnh hưởng rất lớn đến các quá trình lên men, nó quyết định chiều hướng lên men diễn ra theo kiểu yếm khí hay hiếu khí và do

đó dẫn đến sự tạo thành sản phẩm là khác nhau

Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 15 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Thời gian và địa điểm

Thời gian: từ 6/2014 đến 12/2014

Địa điểm: Phòng Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Viện Nghiên cứu và Phát triển

Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ

3.1.2 Nguyên liệu

Trái cây chín: nhãn (Tiền Giang), thanh long (Sóc Trăng), khóm (Sóc Trăng), vải (Vĩnh Long), khế (Tiền Giang), chuối (Cần Thơ), Cóc (Vĩnh Long), đào (Vĩnh Long), dưa hấu (Vĩnh Long), xoay (Vĩnh Long), mãng cầu (Cần Thơ), nho (Hậu Giang), sa pô (Vĩnh Long), bòn bon (Vĩnh Long), lựu (Bến Tre)

3.1.3 Thiết bị - dụng cụ và hóa chất

 Thiết bị - dụng cụ

Các thiết bị và dụng cụ thuộc phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm Máy đo OD (Hitachi, Nhật), máy lắc ủ Eppendorf (Đức), lò vi sóng (Sanyo, Hàn Quốc), máy ly tâm lạnh (Hettich, Đức), tủ lạnh để trữ mẫu (Sanyo, Nhật), tủ ủ vi sinh vật (Incucell 111, Đức), tủ cấy vi sinh vật (Pháp), cân điện tử (Sartorius, Đức), nồi khử trùng nhiệt ướt (Pbi- international, Đức), bộ micropipette P9, P20, P90, P900 (Bio-Rad, USA), pH kế (Schott, Đức), máy vortex (Đức)

Ngoài ra còn có các dụng cụ khác như: đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, ống đong, cốc đựng dung dịch, chai lọ thủy tinh (Merck), eppendorf, đèn cồn,

Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 16 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học

- Môi trường YPGD agar

Lấy 2 mL vi khuẩn nuôi trong mỗi bình tam giác

Đo OD 550 nm, ghi nhận và so sánh số liệu phản ánh độ đục của dịch nuôi vi khuẩn tỷ lệ thuận với mật số vi khuẩn do khi vi khuẩn phát triển làm đục môi trường

Hàm lượng acid aetic

Lấy 1 mL dung dịch nuôi vi khuẩn trong mỗi bình tam giác cho vào ống nghiệm Nhỏ 1 giọt phenolphtalein vào ống nghiệm chứa mẫu màu vàng nhạt của môi trường có độ đục theo mật số vi khuẩn

Tiến hành chuẩn độ bằng cách cho mỗi lần 25 µL NaOH 0,8N đã chuẩn bị, đếm

số lần cho vào đến khi mẫu trong ống nghiệm chuyển sang hồng

Dùng số lần (x) cho vào mỗi ống nghiệm thay vào công thức để tính được hàm lượng acid: Acid = 0,12 (x-1), %w/v

Trong đó: x là số giọt cho vào đến khi mẫu trong thí nghiệm chuyển sang hồng

3.1.5 Phương pháp thống kê và xử lý số liệu

Xử lý số liệu: Kết quả nhận được là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại và vẽ biểu

đồ bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2007 và Minitab 16

Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 17 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Phân lập các chủng vi khuẩn acid acetic

Mục đích: Phân lập các chủng AAB thuần từ các loại trái cây

+ Môi trường YPGD: cho 50 mL môi trường vào bình tam giác

+ Môi trường YPGD agar: rót vào đĩa petri (10-20 mL/đĩa)

- Cân 5 g mẫu cho vào bình tam giác có sẵn 50 mL môi trường YPGD vô trùng có bổ sung 4% v/v ethanol

- Tiếp tục cấy phân lập nhiều lần để thu được chủng thuần Quan sát dưới kính hiển vi

để xác định độ đồng nhất của tế bào vi khuẩn, chụp hình để lưu trữ

3.2.2 Đặc tính hình thái, sinh lý và sinh hóa

- Quan sát hình dạng, đo kích thước tế bào và khuẩn lạc

- Nhuộm Gram, thử catalase và oxydase

- Khả năng oxy hóa acetate: phân biệt các chủng AAB thuộc hai giống Acetobacter

và Gluconobacter bằng phản ứng oxy hóa acetic tạo CO2 và H2O (Watchara et al., 2009) Cấy các chủng AAB trên môi trường YPGD + Bromocresol green 0,01% g/L ủ

Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 18 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học

 Sau 48-72 giờ, đối với giống Gluconobacter môi trường vẫn giữ màu vàng, giống Acetobacter làm môi trường chuyển từ màu vàng thành màu xanh lục Chú ý

một số chủng mạnh có thể làm mất màu môi trường

3.2.3 Sơ tuyển các chủng vi khuẩn có khả năng sinh acid acetic

Mục đích: Sơ tuyển các chủng vi khuẩn có khả năng lên men acid acetic dựa

trên khả năng oxy hoá acetate trên môi trường có chỉ thị bromocresol green

- Đo và so sánh vòng màu vàng sinh ra xung quanh AAB sau 24 và 48 giờ

- Các nghiệm thức được thực hiện 3 lần để lấy giá trị trung bình Các chủng có khả năng sinh acid mạnh sẽ được lựa chọn để thử khả năng chịu nhiệt

3.2.4 Khảo sát khả năng chịu acid ở các nồng độ acid khác nhau

Mục đích: Đánh giá khả năng phát triển và lên men của vi khuẩn AAB ở các

nồng độ acid khác nhau

Phương pháp thực hiện

- Thí nghiệm được thực hiện trên đĩa petri với 3 lần lặp lại

- Cấy các chủng AAB đã được phân lập và tuyển chọn ở 3.2.3 lên đĩa chứa môi trường YPGD (agar 2%) bổ sung acid acetic ở các nồng độ ban đầu khác nhau: 0,5%; 1,0%; 1,5%; 2,0%; 2,5% và 3%

- Ủ ở 30oC

- Theo dõi và đánh giá khả năng phát triển trên đĩa sau 48-72 giờ

3.2.5 Khảo sát khả năng chịu nhiệt của vi khuẩn acid acetic

Mục đích: Tuyển chọn các chủng AAB có khả năng phát triển tốt ở nhiệt độ cao Phương pháp thực hiện

Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 19 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học

- Cấy các chủng AAB vừa tuyển chọn vào môi trường YPGD chứa 4% v/v ethanol, 2% agar

- Ủ ở các nhiệt độ khác nhau: 30oC, 37oC, 39oC, 41oC, 43oC và 45oC

- Theo dõi sự phát triển của AAB sau 2 và 3 ngày

- Thí nghiệm lặp lại 3 lần ở mỗi nhiệt độ

3.2.6 Tuyển chọn chủng vi khuẩn AAB chịu nhiệt

Mục đích: Tuyển chọn các chủng AAB lên men mạnh có khả năng phát triển ở

- Mỗi ngày tiến hành đo mật số vi khuẩn bằng máy đo OD và theo dõi nồng độ acid trong 7 ngày bằng phương pháp chuẩn độ bằng NaOH 0,8 N

So sánh và tuyển chọn được các chủng AAB có khả năng lên men acid acetic tốt nhất

Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 20 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN

4.1 Phân lập và xác định đặc tính của các chủng vi khuẩn acid acetic

Với mục đích có thể thu nhập được các chủng vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt từ nhiều nguồn khác nhau, tổng cộng có 15 loại trái cây chín được thu từ các tỉnh Đồng bằng Sông Cửu Long để phân lập Mẫu được cho vào môi trường YPGD (yeast extract

5 g/L, polypeptone 5 g/L, glycerol 5 g/L và D-glucose 5 g/L) có bổ sung 4% v/v ethanol và ủ qua đêm, cấy chuyển trên môi trường YPGD có chứa 4% v/v ethanol, 2% agar và 0,5% CaCO3 (ủ 30oC trong 2-3 ngày) để chọn các khuẩn lạc xuất hiện vòng halo trên môi trường

Hình 3: Đặc điểm khuẩn lạc AAB trên môi trường có chứa CaCO 3

Ghi chú: (a) Môi trường đối chứng có CaCO 3 ,(b)(c)(d) Khuẩn lạc tạo vòng halo trên môi trường

Các chủng vi khuẩn được lựa chọn là vi khuẩn acid acetic khi chúng tạo được vòng sáng trên môi trường YPGD có chứa ethanol và CaCO3 Kết quả nhuộm Gram khuẩn lạc có màu hồng đỏ là Gram âm Trong 30 chủng phân lập có sự đa dạng và đặc điểm, hình thái khuẩn lạc và tế bào cũng như sự xuất hiện của enzyme catalase, cụ thể:

- Catalase: âm tính, dương tính

Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 21 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học

- Hình dạng khuẩn lạc: phần lớn các khuẩn lạc đều có hình tròn, một số khuẩn lạc không đều Nhiều khuẩn lạc có dạng bìa nguyên, số ít khuẩn lạc có bìa răng cưa

- Màu sắc khuẩn lạc: có màu trắng đục và màu vàng

- Hình dạng tế bào: hình cầu, hình elip, hình que ngắn, hình que kết đôi hoặc kết chuỗi

Hình 4: Hình hình dạng vi khuẩn và nhuộm Gram của một số chủng AAB