3.1.1. Thời gian và địa điểm
Thời gian: từ 6/2014 đến 12/2014.
Địa điểm: Phòng Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2. Nguyên liệu
Trái cây chín: nhãn (Tiền Giang), thanh long (Sóc Trăng), khóm (Sóc Trăng), vải (Vĩnh Long), khế (Tiền Giang), chuối (Cần Thơ), Cóc (Vĩnh Long), đào (Vĩnh Long), dưa hấu (Vĩnh Long), xoay (Vĩnh Long), mãng cầu (Cần Thơ), nho (Hậu Giang), sa pô (Vĩnh Long), bòn bon (Vĩnh Long), lựu (Bến Tre).
3.1.3. Thiết bị - dụng cụ và hóa chất
Thiết bị - dụng cụ
Các thiết bị và dụng cụ thuộc phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm. Máy đo OD (Hitachi, Nhật), máy lắc ủ Eppendorf (Đức), lò vi sóng (Sanyo, Hàn Quốc), máy ly tâm lạnh (Hettich, Đức), tủ lạnh để trữ mẫu (Sanyo, Nhật), tủ ủ vi sinh vật (Incucell 111, Đức), tủ cấy vi sinh vật (Pháp), cân điện tử (Sartorius, Đức), nồi khử trùng nhiệt ướt (Pbi- international, Đức), bộ micropipette P9, P20, P90, P900 (Bio- Rad, USA), pH kế (Schott, Đức), máy vortex (Đức).
Ngoài ra còn có các dụng cụ khác như: đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, ống đong, cốc đựng dung dịch, chai lọ thủy tinh (Merck), eppendorf, đèn cồn,...
Hóa chất
- Môi trường phân lập vi khuẩn acid acetic YPGD: môi trường tăng sinh Yeast extract 5,0 g/L
Polypeptone 5,0 g/L Glycerol 5,0 g/L D-Glucose 5,0 g/L Nước cất 1.000 mL
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 16 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học
- Môi trường YPGD agar
CaCO3 0,5% g/L Yeast extract 5,0 g/L Polypeptone 5,0 g/L Glycerol 5,0 g/L D-Glucose 5,0g/L Nước cất 1.000 mL Ethanol 4% v/v Agar 2% g/L
- Các hóa chất khác: cồn tuyệt đối, oxitetracyline, bromocresol green, phenolthalein, NaOH,…
3.1.4. Phương pháp theo dõi các chỉ tiêu
Mật số vi khuẩn
Lấy 2 mL vi khuẩn nuôi trong mỗi bình tam giác.
Đo OD 550 nm, ghi nhận và so sánh số liệu phản ánh độ đục của dịch nuôi vi khuẩn tỷ lệ thuận với mật số vi khuẩn do khi vi khuẩn phát triển làm đục môi trường.
Hàm lượng acid aetic
Lấy 1 mL dung dịch nuôi vi khuẩn trong mỗi bình tam giác cho vào ống nghiệm. Nhỏ 1 giọt phenolphtalein vào ống nghiệm chứa mẫu màu vàng nhạt của môi trường có độ đục theo mật số vi khuẩn.
Tiến hành chuẩn độ bằng cách cho mỗi lần 25 µL NaOH 0,8N đã chuẩn bị, đếm số lần cho vào đến khi mẫu trong ống nghiệm chuyển sang hồng.
Dùng số lần (x) cho vào mỗi ống nghiệm thay vào công thức để tính được hàm lượng acid: Acid = 0,12 (x-1), %w/v
Trong đó: x là số giọt cho vào đến khi mẫu trong thí nghiệm chuyển sang hồng.
3.1.5. Phương pháp thống kê và xử lý số liệu
Xử lý số liệu: Kết quả nhận được là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại và vẽ biểu đồ bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2007 và Minitab 16.
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 17 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Phân lập các chủng vi khuẩn acid acetic
Mục đích: Phân lập các chủng AAB thuần từ các loại trái cây.
Phương pháp thực hiện
Thu thập 15 loại trái cây chín ở tỉnh Sóc Trăng, Tiền Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long, Hậu Giang, Bến Tre thuộc Đồng bằng Sông Cửu Long.
- Chuẩn bị môi trường YPGD và YPGD agar được khử trùng ở 121oC trong 20 phút và được bổ sung ethanol 4% v/v sau khi môi trường được làm nguội bớt.
+ Môi trường YPGD: cho 50 mL môi trường vào bình tam giác. + Môi trường YPGD agar: rót vào đĩa petri (10-20 mL/đĩa).
- Cân 5 g mẫu cho vào bình tam giác có sẵn 50 mL môi trường YPGD vô trùng có bổ sung 4% v/v ethanol.
-Ủ 30oC trong 24 giờ.
- Cấy phân lập trên môi trường YPGD có bổ sung 4% v/v ethanol, 2% agar và 0,5% CaCO3 (Moryadee và Wasu, 2008). Ủ ở 30oC trong 2-3 ngày.
- Lựa chọn các khuẩn lạc tạo vòng halo trên môi trường là AAB. Khuẩn lạc vi khuẩn acetic sẽ tạo vòng sáng xung quanh do vi khuẩn này tạo ra acid acetic hòa tan CaCO3 làm mất màu trắng đục của CaCO3.
-Tiếp tục cấy phân lập nhiều lần để thu được chủng thuần. Quan sát dưới kính hiển vi để xác định độ đồng nhất của tế bào vi khuẩn, chụp hình để lưu trữ.
3.2.2. Đặc tính hình thái, sinh lý và sinh hóa
- Quan sát hình dạng, đo kích thước tế bào và khuẩn lạc. - Nhuộm Gram, thử catalase và oxydase.
- Khả năng oxy hóa acetate: phân biệt các chủng AAB thuộc hai giống Acetobacter
và Gluconobacter bằng phản ứng oxy hóa acetic tạo CO2 và H2O (Watchara et al., 2009). Cấy các chủng AAB trên môi trường YPGD + Bromocresol green 0,01% g/L ủ ở 30o
C trong 24-72 giờ cho tới khi không có sự thay đổi màu sắc. Được đánh giá như sau:
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 18 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học
Sau 48-72 giờ, đối với giống Gluconobacter môi trường vẫn giữ màu vàng, giống Acetobacter làm môi trường chuyển từ màu vàng thành màu xanh lục. Chú ý một số chủng mạnh có thể làm mất màu môi trường.
3.2.3. Sơ tuyển các chủng vi khuẩn có khả năng sinh acid acetic
Mục đích: Sơ tuyển các chủng vi khuẩn có khả năng lên men acid acetic dựa
trên khả năng oxy hoá acetate trên môi trường có chỉ thị bromocresol green.
Phương pháp thực hiện
- Nuôi các chủng AAB trong ống nghiệm chứa môi trường YPGD agar trong 24 giờ.
- Nhỏ một giọt dung dịch nuôi cấy lên giữa đĩa môi trường thạch màu xanh chứa bromocresol green, ethanol agar (ethanol 0,2%, yeast extract 0,3%, bromocresol green 0,01%) đã chuẩn bị và ủ ở 30oC.
- Đo và so sánh vòng màu vàng sinh ra xung quanh AAB sau 24 và 48 giờ.
- Các nghiệm thức được thực hiện 3 lần để lấy giá trị trung bình. Các chủng có khả năng sinh acid mạnh sẽ được lựa chọn để thử khả năng chịu nhiệt.
3.2.4. Khảo sát khả năng chịu acid ở các nồng độ acid khác nhau
Mục đích: Đánh giá khả năng phát triển và lên men của vi khuẩn AAB ở các nồng độ acid khác nhau.
Phương pháp thực hiện
- Thí nghiệm được thực hiện trên đĩa petri với 3 lần lặp lại.
- Cấy các chủng AAB đã được phân lập và tuyển chọn ở 3.2.3 lên đĩa chứa môi trường YPGD (agar 2%) bổ sung acid acetic ở các nồng độ ban đầu khác nhau: 0,5%; 1,0%; 1,5%; 2,0%; 2,5% và 3%.
- Ủ ở 30oC.
- Theo dõi và đánh giá khả năng phát triển trên đĩa sau 48-72 giờ.
3.2.5. Khảo sát khả năng chịu nhiệt của vi khuẩn acid acetic
Mục đích: Tuyển chọn các chủng AAB có khả năng phát triển tốt ở nhiệt độ cao.
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 19 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học
- Cấy các chủng AAB vừa tuyển chọn vào môi trường YPGD chứa 4% v/v ethanol, 2% agar.
- Ủ ở các nhiệt độ khác nhau: 30oC, 37oC, 39oC, 41oC, 43oC và 45oC. - Theo dõi sự phát triển của AAB sau 2 và 3 ngày.
- Thí nghiệm lặp lại 3 lần ở mỗi nhiệt độ.
3.2.6. Tuyển chọn chủng vi khuẩn AAB chịu nhiệt
Mục đích: Tuyển chọn các chủng AAB lên men mạnh có khả năng phát triển ở nhiệt độ cao.
Phương pháp thực hiện
- Nuôi các chủng AAB trong ống nghiệm chứa 5 mL môi trường YPGD có bổ sung 10% dịch trích khoai tây trong 24 giờ, lắc 150 vòng/phút ở 30oC.
- Rút 1 mL từ dịch lỏng vừa ủ vào 100 mL môi trường YPGD lỏng có bổ sung 4% v/v ethanol.
- Ủ ở 30oC, 37oC, 38oC và 39oC và lắc ở 150 vòng/phút ( do vi khuẩn có khả năng chịu được nhiệt độ cao nhưng khả năng sinh acid kém hoặc không sinh acid, chúng có thể sống sót ở nhiệt độ cao nhưng không còn khả năng sinh acid nên tiến hành ủ ở nhiệt độ tối đa khoảng 39oC).
- Mỗi ngày tiến hành đo mật số vi khuẩn bằng máy đo OD và theo dõi nồng độ acid trong 7 ngày bằng phương pháp chuẩn độ bằng NaOH 0,8 N.
So sánh và tuyển chọn được các chủng AAB có khả năng lên men acid acetic tốt nhất.
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 20 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1. Phân lập và xác định đặc tính của các chủng vi khuẩn acid acetic
Với mục đích có thể thu nhập được các chủng vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt từ nhiều nguồn khác nhau, tổng cộng có 15 loại trái cây chín được thu từ các tỉnh Đồng bằng Sông Cửu Long để phân lập. Mẫu được cho vào môi trường YPGD (yeast extract 5 g/L, polypeptone 5 g/L, glycerol 5 g/L và D-glucose 5 g/L) có bổ sung 4% v/v ethanol và ủ qua đêm, cấy chuyển trên môi trường YPGD có chứa 4% v/v ethanol, 2% agar và 0,5% CaCO3 (ủ 30oC trong 2-3 ngày) để chọn các khuẩn lạc xuất hiện vòng halo trên môi trường.
Hình 3: Đặc điểm khuẩn lạc AAB trên môi trường có chứa CaCO3
Ghi chú: (a) Môi trường đối chứng có CaCO3,(b)(c)(d) Khuẩn lạc tạo vòng halo trên môi trường
Các chủng vi khuẩn được lựa chọn là vi khuẩn acid acetic khi chúng tạo được vòng sáng trên môi trường YPGD có chứa ethanol và CaCO3. Kết quả nhuộm Gram khuẩn lạc có màu hồng đỏ là Gram âm. Trong 30 chủng phân lập có sự đa dạng và đặc điểm, hình thái khuẩn lạc và tế bào cũng như sự xuất hiện của enzyme catalase, cụ thể:
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 21 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học
- Hình dạng khuẩn lạc: phần lớn các khuẩn lạc đều có hình tròn, một số khuẩn lạc không đều. Nhiều khuẩn lạc có dạng bìa nguyên, số ít khuẩn lạc có bìa răng cưa.
- Màu sắc khuẩn lạc: có màu trắng đục và màu vàng.
- Hình dạng tế bào: hình cầu, hình elip, hình que ngắn, hình que kết đôi hoặc kết chuỗi.
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 22 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học
Bảng 1: Kết quả phân lập các chủng AAB
STT Địa điểm Mẫu Số chủng phân lập được
1 Cần Thơ Chuối 2 2 Mãng Cầu 2 3 Tiền Giang Khế 2 4 Nhãn 2 5
Sóc Trăng Thanh Long 1
6 Khóm 2 7 Vĩnh Long Xoài 2 8 Sa pô 2 9 Đào 2 9 Xoay 3 11 Bòn Bon 2 12 Dưa Hấu 2 13 Vải 2 14 Bến Tre Lựu 2
15 Hậu Giang Nho 2
Tổng cộng 30
4.2. Đặc tính hình thái, sinh lý và sinh hóa của các chủng AAB
Theo tài liệu định danh của Bergey (Holt et al., 1994), dựa vào phản ứng oxy hóa acetate sẽ được các chủng phân lập thành hai nhóm là Acetobacter và Gluconobacter.
Cấy các chủng AAB trên môi trường YPGD bổ sung 0,01% g/L bromocresol green và ủ ở 30oC. Sau 24 giờ tất cả các chủng đều chuyển môi trường xanh lam sang vàng, nhưng sau 48-72 giờ, một số chủng AAB mà môi trường vẫn giữ màu vàng là
Gluconobacter, còn một số chủng chuyển từ màu vàng thành màu xanh lục là
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 23 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học
Hình 5 : Sự biến đổi màu môi trường chỉ thị sau 72 giờ.
*Ghi chú: (a) màu xanh lam là môi trường đối chứng, (b) màu vàng là Gluconobacter, (c)màu xanh lục là Acetobacter
Kết quả phân loại các chủng AAB dựa vào sự biến đổi màu môi trường chỉ thị được thể hiện ở Bảng 2.
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 24 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học
Bảng 2: Kết quả phân loại các chủng AAB
STT Địa điểm Loại mẫu phân lập Chủng AAB
Acetobacter Gluconobacter 1 Cần Thơ Chuối C1 x 2 C2 X 3 Mãng Cầu MC1 x 4 MC2 X 5 Tiền Giang Khế K1 x 6 K2 x 7 Nhãn N1 x 8 N2 x 9 Sóc Trăng Thanh Long TL x 9 Khóm KO1 x 11 KO2 X 12 Vĩnh Long Vải V1 x 13 V2 x 14 Dưa Hấu DH1 x 15 DH2 X 16 Bòn Bon BB1 X 17 BB2 X 18 Xoay X1 X 19 X2 x 20 X3 x 21 Đào D1 X 22 D2 X 23 Sa pô A1 x 24 25 26 A2 X Xoài XO1 XO2 x X 27 Bến Tre Lựu L1 x 28 L2 x 29
Hậu Giang Nho NH1 X
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 25 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học
Bảng 3: Tỷ lệ vi khuẩn Acetobacter và Gluconobacter
Giống Số chủng AAB Tỷ lệ (%)
Acetobacter 18 60
Gluconobacter 12 40
Như vậy, trong 30 chủng AAB đã phân lập được, giống Acetobacter chiếm đa số với tỷ lệ 60% còn giống Gluconobacter chiếm tỷ lệ ít hơn (chiếm 40%).
4.3. Kết quả thử nghiệm khả năng sinh acid acetic
Đánh giá khả năng sinh acid của các chủng vi khuẩn dựa trên sự thay đổi màu của chất chỉ thị bromocresol green trên môi trường YPGD (Hình 6). Các chủng AAB được nuôi tăng sinh trong 24 giờ và cho phát triển trên môi trường bromocresol green ethanol agar (0,4% v/v ethanol, 0,5% yeast extract, 0,01% bromocresol green).
Hình 6: Sự biến đổi màu chỉ thị của một số chủng AAB
*Ghi chú: (a) màu xanh lam là môi trường đối chứng, (b) màu vàng là khả năng sinh acid của AAB
Đường kính trung bình của vùng phân giải và một số đặc tính của 15 chủng vi khuẩn sơ tuyển được trình bày ở Bảng 4.
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 26 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học
Bảng 4: Hình dạng khuẩn lạc và đặc điểm hình thái của các chủng AAB
TT Nguồn phân lập Chủng phân lập AAB C a ta la se O x y d a se Vùng sáng mm Hình dạng A G 24 giờ 48
giờ Khuẩn lạc Vi khuẩn
1
Chuối
C1 x + - 12 23 Tròn, vàng sậm, mô, bìa
nguyên, 1-1,3 mm Cầu, kết đôi
2 C2 x + - 22 46 Tròn, vàng, mô, bìa nguyên,
0,2-0,5 mm Que 3 Mãng cầu MC2 x + - 15 30 Tròn, vàng nhạt, gò, bìa nguyên, 1-1,3 mm Que ngắn 4 Khế K1 x + - 11 33 Tròn, vàng nhạt, mô, bìa nguyên, 1-1,3 mm Elip, kết chuỗi 5 Thanh Long TL x + - 17 37
Tròn, trắng, mô, bìa nguyên, 1-
1,5 mm Que
6 Nho NH1 x + - 12 31 Không đều, trắng, gò, bìa
nguyên, 0,8-1,2 mm
Cầu, kết chuỗi
7 Dưa
Hấu DH2 x + - 9 29 Tròn, vàng nhạt, gò, bìa nguyên, 0,8-1 mm
Que ngắn, kết chuỗi 8
Bòn Bon
BB1 x + - 17 31 Không đều, trắng, mô, bìa
nguyên, 0,5-0,8 mm
Cầu, kết chuỗi
9 BB2 x + - 13 28 Tròn, trắng, mô, bìa nguyên,
0,8-1 mm Elip, kết đôi
9
Xoay
X1 x + - 11 26 Tròn, trắng, mô, bìa nguyên, 1-
1,5 mm Cầu, kết đôi
11 X2 x - - 11 24 Không đều, trắng, mô, bìa
nguyên, 0,7-1mm
Cầu, kết chuỗi 12 X3 x + - 12 25 Tròn, vàng sậm, gò, bìa răng cưa, 0,8-1,2 mm Cầu, đơn, kết đôi
13 Đào D2 x + - 12 24 Không đều, trắng, gò, bìa răng
cưa, 1-1,5 mm
Elip, kết chuỗi
14 Nho NH2 x + - 14 39 Không đều, vàng, gò, bìa
nguyên, 0,8-1 mm
Que ngắn, kết chuỗi
15 Lựu L2 x + - 16 43 Tròn, vàng, mô, nguyên, 0,4-
0,6 mm Que
Các chủng vi khuẩn có hình dạng khuẩn lạc đa số có dạng hình tròn, số ít không đều, bìa nguyên hay bìa răng cưa. Hình dạng tế bào: hình cầu, que, que ngắn, elip, kết chuỗi. Có đặc tính oxydase âm tính, catalase: âm tính, dương tính. Các chủng vi khuẩn làm xuất hiện vòng sáng màu vàng xung quanh khuẩn lạc thể hiện khả năng sinh acid, kết quả sơ tuyển được 15 chủng vi khuẩn có đường kính trung bình của vòng màu vàng từ 20 mm trở lên sau 48 giờ ủ ở 30oC được đánh giá là những chủng vi khuẩn có khả năng sinh acid mạnh (Bảng 4).
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 27 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học
4.4. Khả năng chịu acid của vi khuẩn acid acetic
Cấy 15 chủng AAB đã sơ tuyển vào môi trường YPGD (2% agar) bổ sung acid acetic ở các nồng độ ban đầu khác nhau: 0,5%; 1,0%; 1,5%; 2,0%; 2,5% và 3,0% với 3 lần lặp lại.
Theo dõi và quan sát sự phát triển của 15 chủng AAB trong 48-72 giờ ủ ở 30o
C.
Hình 7: Khả năng chịu acid của các chủng AAB ở 0,5%; 1,0%; 1,5%; 2,0%, 2,5%
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 28 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học