Nuôi ủ 4 chủng AAB: C2 (43o
C, 2,5% w/v), MC2 (41oC, 2% w/v), L2 (41oC, 2% w/v), NH2 (43oC, 2% w/v) trong ống nghiệm chứa 5 mL trong môi trường YPGD lỏng trong 24 giờ, lắc 150 vòng/phút ở 30o
C, sau đó rút 1 mL vào 100 mL trong môi trường YPGD lỏng có bổ sung 4% v/v ethanol và ủ lắc 150 vòng/phút ở 30o
C, 37oC, 38oC và 39oC.
Mỗi ngày tiến hành đo mật số vi khuẩn bằng máy đo OD và theo dõi nồng độ acid trong 7 ngày bằng phương pháp chuẩn độ bằng NaOH 0,8 N.
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 31 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học
Hình 9: Sự phát triển của 4 chủng vi khuẩn AAB ở 30oC
Hình 10: Hàm lượng acid của 4 chủng AAB ở 30oC
Kết quả ở Hình 9 và 10 cho thấy khi lên men ở 30oC thì cả 4 chủng đều phát triển và sinh acid tốt nhưng không đồng đều, đặc biệt là chủng C2 (3,6% w/v), NH2 (3,36% w/v) ở ngày thứ 5 phát triển vượt trội hơn, chủng MC2 phát triển và sinh acid kém hơn chỉ đạt 2,88% (w/v) và chủng L2 đạt 3% (w/v).
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 32 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học
Hình 11: Sự phát triển của 4 chủng vi khuẩn AAB ở 37oC
Hình 12: Hàm lượng acid của 4 chủng AAB ở 37oC
Kết quả ở Hình 11 và 12 cho thấy khi lên men ở 37oC, tương tự như ở 30o
C, khả năng phát triển và hàm lượng acid của chủng C2 (3,64% w/v), NH2 (3,56% w/v) vẫn phát triển rất mạnh hơn hẳn MC2 (3,16% w/v) và L2 (3,4% w/v) nhưng nhìn chung cả 4 chủng đều chịu nhiệt tốt, dựa vào mật số OD và hàm lượng acid của 4 chủng đều cao hơn so với ở 30oC, chứng tỏ ở nhiệt độ này, các chủng có khả năng thích nghi cao hơn so với 30oC nên phát triển rất mạnh.
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 33 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học
Hình 13: Sự phát triển của 4 chủng vi khuẩn AAB ở 38oC
Hình 14: Hàm lượng acid của 4 chủng AAB ở 38oC
Kết quả ở Hình 13 và 14 cho thấy khi lên men ở 38oC, khả năng phát triển của 4 chủng giảm. Hàm lượng acid của chủng C2 (3,56% w/v) và NH2 (3,44% w/v) ở ngày thứ 4, riêng đối với chủng L2 (3,28% w/v) và MC2 (3,12% w/v) phát triển yếu hơn về mật số và hàm lượng acid sinh ra so với C2 và NH2. Tuy nhiên các giá trị tối đa đều thấp hơn so với ở 30oC và 37oC. Kết quả này cho thấy sự gia tăng nhiệt độ đã làm giảm khả năng phát triển cũng như lượng acid sinh ra của chúng.
Sự phát triển và sinh acid của 4 chủng AAB ở 39oC được thể hiện ở Hình 15 và 16.
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 34 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học
Hình 15: Sự phát triển của 4 chủng vi khuẩn AAB ở 39oC
Hình 16: Hàm lượng acid của 4 chủng AAB ở 39oC
Kết quả ở Hình 15 và 16 cho thấy khi lên men ở 39oC khả năng lên men của cả 4 chủng đều giảm đáng kể. Những ngày đầu, cả 4 chủng đều phát triển nhưng với tốc độ thấp. Hàm lượng acid sinh ra của C2 (0,96% w/v) tăng ở ngày đầu tiên và duy trì ở mức đó đến ngày thứ 7. Đối với NH2, MC2 và L2 sau ngày thứ 3 trở đi đều liên tục giảm đến ngày thứ 7 chỉ còn đạt NH2 (0,88% w/v), MC2 (0,6% w/v) và L2 (0,76% w/v). Những giá trị acid cao nhất đều thấp hơn so với 30, 37 và 38oC chứng tỏ ở nhiệt độ càng cao sẽ càng làm giảm khả năng phát triển và sinh acid của chúng.
Từ các kết quả trên cho thấy ở nhiệt độ 37o
C khả năng sinh trưởng, phát triển mật số OD (550nm) và hàm lượng acid của 4 chủng đạt giá trị cao nhất, vì thế đây là nhiệt
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 35 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học
độ thích hợp phát triển của cả 4 chủng này, trong đó C2 và NH2 có mật số cao và sinh acid tốt hơn nên 2 chủng này là những chủng vi khuẩn chịu nhiệt đã được tuyển chọn.
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 36 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
- Phân lập được 30 chủng vi khuẩn acid acetic từ 15 loại trái cây từ 6 tỉnh, thành phố khác nhau. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Phân loại thông qua khả năng oxy hóa acetate cho thấy 18 chủng thuộc giống
Acetobacter và 12 chủng thuộc Gluconobacter.
- Sơ tuyển được 15 chủng C1, C2, DH2, NH1, NH2, L2, X1, X2, X3, TL, BB1, BB2, D2, K1 và MC2 có đường kính vùng sáng trung bình trong khoảng 20-46 mm trong 48 giờ ủ ở 30oC.
- Chủng C2 có khả năng phát triển ở nồng độ acid 2,5%, các chủng MC2, L2 và NH2 có khả năng phát triển ở nồng độ acid 2% v/v, còn các chủng còn lại phát triển ở nồng độ 1,5% và 1,0%.
- Tất cả các chủng đều chịu nhiệt tốt, các chủng C2, NH2, MC2 và L2 phát triển trên 39oC, trong đó 2 chủng C2 và NH2 phát triển rất mạnh lên đến 43oC.
- Tuyển chọn được 2 chủng AAB chịu nhiệt lên men tốt nhất là C2 thuộc giống
Gluconobacter và NH2 thuộc giống Acetobacter với nồng độ acid acetic sinh ra đạt 3,56% (w/v) và 3,4% (w/v) ở 38oC.
5.2. Đề nghị
- Định danh tên loài 2 chủng C2 và NH2.
- Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình lên men của chủng C2 và NH2. Từ đó, có thể nghiên cứu về quy trình lên men acetic hay sản phẩm khác có lên men acetic.
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 37 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
Bùi Thị Quỳnh Hoa và Nguyễn Bảo Lộc. 2008. Giáo trình Công nghệ sản xuất rượu bia và nước giải khát. Trường Đại học Cần Thơ.
Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp. 2002. Thực tập Vi sinh vật đại cương. Trường Đại học Cần Thơ.
Đặng Thụy Thùy Vân, Huỳnh Xuân Phong, Ngô Thị Phương Dung, Bùi Duy Nhân, Nguyễn Trường Giang và Đỗ Quốc Hòa. 2010. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu nhiệt lên men acid acetic. Viện CN&PT Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
Đặng Thụy Thùy Vân. 2010. Nghiên cứu điều kiện lên men của các chủng vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt. Luận văn tốt nghiệp ngành Công nghệ Sinh học, Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Như Huỳnh. 2012. Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum tạo màng Bacterial cellulose ứng dụng trong điều trị bỏng. Tạp chí Khoa học và Công nghệ 50 (4) 453-462.
Huỳnh Xuân Phong. 2011. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lên men acid acetic chịu nhiệt. Luận văn thạc sĩ khoa học chuyên ngành công nghệ sinh học, Trường Đại Học Cần Thơ.
Kiều Hữu Ảnh, 1999. Vi sinh vật học công nghiệp, NXB KH&KT, Hà Nội. Lương Đức Phẩm. 1998. Công nghệ vi sinh vật. NXB Nông nghiệp Hà Nội.
Lương Đức Phẩm. 2001. Vi sinh vật học và an toàn vệ sinh thực phẩm. NXB Nông nghiệp Hà Nội.
Nguyễn Đức Lượng. 2003. Công nghệ Vi sinh vật (tập 3). NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.
Nguyễn Lân Dũng. 1999. Vi sinh vật học. Nhà xuất bản Giáo dục.
Nguyễn Thị Diễm Chi, Hoàng Tuyền Yến Linh và Nguyễn Vũ Thanh. 2002. Nghiên cứu nuôi cấy Acetobacter xylinum làm màng sinh học trị phòng và các tổn thương da. Y học tp.HCM. 6: 139-141.
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 38 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học
Nguyễn Thị Kem. 2012. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Acetobacter ứng dụng trong lên men thủy sâm. Luận văn tốt nghiệp ngành Công nghệ Sinh học, Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
Trần Thị Thanh. 2000. Công nghệ vi sinh. NXB Giáo dục Hà Nội.
Võ Thị Ngọc Bích.2012. Ảnh hưởng của ethanol và acid acetic đến khả năng lên men của Acetobacter tropicalis. Luận văn tốt nghiệp ngành Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
Tiếng Anh
A’ngel, Gonza lez. 2005. Application of molecular methods for routine indentification of acid acetic bacteria. International J. of Food Microbiology 98, pp.141-146. Amornrut Moryadee and Wasu Pathom-Aree, 2008. Isolation of Thermotolerant (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Acetic Acid Bacteria from Fruits for Vinegar Production.Research Journal of Microbiology, 3: 209-212.
Cleenwerck, I., K. Vandemeulebroecke, D. Janssens, and J. Swings. 2002. Re- examination of the genus Acetobacter, with description of Acetobacter cerevisiae
sp. Nov. and Acetobacter malorum sp. Nov. Int J Syst Evol Microbiol 52, pp.1551-1558.
De Toit, W. J. and I. S. Pretorius, 2002. The occurrence, control and esoteric effect of acetic acid bacteria in winemaking. Annuals of Microbiology 52, pp. 155-179. Dworkin, M., S. Falkow, E. Rosenberg, K. Schleifer, and E. Stackebrandt. 2006. The
Prokaryotes – A Handbook on the Biology of Bacteria. Third Ed. Vol 5: Proteobacteria: Alpha and Beta Subclasses. Springer Science + Business Media, New York, USA, p163-200.
Ercolini, D. 2004. PCR-DGGE fingerprinting: novel strategies for detection of microbes in food. Journal of Microbiology Methods 56, pp.297-314.
Greeberg, D.E., S. F. Porcella, F. Stock, A. Wong, P. S. Conville, P. R. Murray, S. M. Holland, and A. M. Zelazny. 2006. Granulibacter bethesdensis gen. nov., sp. Nov., a distinctive pathogenic acetic acid bacterium in the family Acetobacteraceae. Int J Syst Evol Microbiol 56, pp.2609-2616.
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 39 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học
Gullo, M., C. Caggia, L. DeVero, and P. Giudici 2006. Charactertization of acetic acid bacteria in traditional balsamic vinegar. International Journal of Food Microbiology
96, pp.209-212.
Haruta, S., S. Ueno, I. Egawa, K. Hashiguchi, A. Fujii, M. Nagano, M. Ishii, and Y. Holt, J. G., N. R. Krieg, P. H. A. Sneath, J. T. Stanley, and S. T. Williams. 1994.
Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. 9th Ed, Wiliams and Wilkins, Baltimore, USA.
Igarashi. 2006. Succesion of bacterial and fungal communities during a traditional pot fermentation of rice vinegar assessed by PCR-mediated denaturing gradient gel electrophoresis. International J of food Microbiology 99, pp.79-87.
Jim Sliwa 2014. The active ingredient in vinegar, acid acetic, can effectively kill mycobacteria, even highly drug-resistant Mycobacterium tuberculosis, an international team of researchers from Venezuela, France and the US reports in mBio®, American Society for Microbiology.
Jojima, Y., Y. Mihara, S. Suzuki, K. Yokozeki, S. Yamanaka, and R. Fudou. 2004. Saccharibacter floricola gen. nov., sp. Nov., anovel osmophilic acetic acid bacterium isolated from pollen. Int J Syst Evol Microbiol 5, pp.2263-2267.
Kazunobu Matsushita, Hirohide Toyama, Osao Adachi 2008. Respiratory Chains and Bioenergenics of Acetic Acid Bacteria Advances in Microbial Physiology, Volume 36, Issue null, page 247-301.
Lisdiyanti, P., H. Kawasaki, T. Seki, Y. Yamada, T. Uchimura, and K.Komagata. 2000. Systematic study of genus Acetobacter with descriptions of Acetobacter indonesiensis sp. Nov., Acetobacter tropicalis sp. Nov., Acetobacer orleanensis (Henneberg 1906) comb. Nov., Acetobacter lovaniensis (Frateur 1950) comb. Nov., and Acetobacter estunensis (Carr 1958) comb. Nov. J Gen Appl Microbiol 46, pp. 147-165.
Loganathan, P. and S. Nair. 2004. Swaminatania salitorans gen. nov., sp. Nov., a salt- tolerant, nitrogen-fixing and phosphate-solubilizing bacterium from wild rice (Porterisia coarctata Tateoka). Int J Syst Evol Microbiol 54, pp.1185-1190.
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 40 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học
Martin R. Adams and Maurice O. Moss. 2008. Food Microbiology. University of Surrey, Guildford, UK
Matsushita, K. 2009. Thermotolerant acetic acid bacteria: Its physiological features and application for high temperature oxydative fermentation. Proceeding of Satellite Seminar in Asian Core Program. The National University of Laos, Laos. Matsutani, M., H. Hirakawa, M. Nishikura, W. Soemphol, I. Ali Ibnaof Ali, T. Yakushi, and K. Matsushita. 2011. Increased number of arginine-based salt brigdes contributes to the thermotolerance of thermotolerant acid acetic bacteria, pp. 120-124.
Moryadee, A. and P. Wasu. 2008. Isolation of thermotolerant acid acetic bacteria from fruits for vinegar production. Research Journal of Microbiology, vol. 3, No. 3, pp.209-212.
Nanda, K., M. Taniguchi, S. Ujike, N. Ishihara, H. Mori, H. Ono, Y. Murooka. 2001. Characterization of acid acetic bacteria in traditional acetic acid fermentions of rice vinegar (Komesu) and unpolished rice vinegar (Kurosu) produced in Japan. Applied and Environmental Microbiology 67, pp.986-990.
Ndoye, B., S. Lebecque, R. Dubois-Dauphin, L. Tounkara, A. T. Guiro, C, Kere, B. Diarawa, and P. Thonart. 2006. Thermoresistant properties of acetic acid bacteria isolatated from tropical products of Sub-Saharan Africa and destined to industrial vinegar. Enzyme and Microbial Technology, Vol. 39, pp.916-923.
Ndoye, B., Weekers, F., Diawara, B., Guiro, A. T. & Thonart, P. (2007). Survival and preservation after freeze-dying process of thermoresistant
Ohmori, S., H. Masai, K. Arima and T. Beppu. 1980. Isolation and identification of acetic acid bacteria for submerged acetic acid fermentation at high temperature.
Agric,Biol. Chem. 44 (12), pp.2901-2906.
Randazzo, C. L., H. Heiling, C. Restuccia, P. Giudici, and C. Caggia. 2005. Bacterial population in traditional sourdough evaluated by molecular methods. Journal of Applied Microbiology 99, pp.251-258.
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 41 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học
Sacki., G. Theeragool, K. Matsushita, H. Toyama, N. Lotong, and O. Adachi, 1997. Development of thermotolerant acetic acid bacteria useful for vinegar fermentation at high temperatures. Biosci Biotech Biochem 61 (1), pp.138-145. Schuller, G., C. Hertel, and W. P. Hammes. 2000. Gluconacetobacter entanii sp. Nov., (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
isolated from submerged high-acid industrial vinegar fermentations. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 50, pp.2013-2020.
Sievers, M., A. Lorenzo, S. Gianotti, C. Boesch, and M. Teuber. 1996. 16-23S ribosomal RNA spacer regions of Acetobacter europaeus and A. xylinum, tRNA genes and antitermination sequences. FEMS Microbiology Letters 142, pp.43-48. Sievers, M., C. Gaberthuel, C. Boesch, W. Ludwig, and M. Teuber. 1995.
Phylogenetic position of Gluconobacter species as coherent cluster separated from all Acetobacter species on the basis of 16S ribosomal RNA sequences.
FEMS Microbiology Letter 126, pp. 123-126.
Sokollek, J. S., Christian Hertel, Walter P. Hammes. 1998. Cultivation and preservation of vinegar bacteria. Journal of Biotechnology 60, pp. 195-206.
Sudsakda, S., W. Srichareon and W. Pathom-Aree, 2007. Comparison of three enrichment broths for the isolation of thermotolerant acetic acid bacteria from flowers and fruits. Res. J. Microbiol.
Treek, J. 2005. Quick identification of acetic acid bacteria based on nucleotide sequences of the 16S-23S rDNA internal transcribed spacer region and of the PQQ-dependent alcohol dehydrogenase gene. Systematic and Applied Microbiology 28, pp.735-745.
Watchara Kanchanarach. 209. Studies on Acetuc acid Fermentation and Acetic acid Resistance Abilities in Thermotolerant Acetobacter pasteurianus Strains.
Yukphan, P., Takahashi, M., Potacharoen, W., Tanasupawat, S., Nakagawa, Y., Tanticharoen, M. & Yamada, Y. 2005. Gluconobacter albidus (ex Kondo and Ameyama 1958). InValidation of the Publication of New Names and New Combinations Previously Effectively Published Outside the IJSEM, List no. 93. Int J Syst Evol Microbiol 55, 983-985.
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 42 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học http://doc.edu.vn/tai-lieu/luan-van-chon-giong-vi-khuan-va-khao-sat-mot-so-dieu- kien-len-men-acetic-de-lam-giam-trai-cay-42852/(ngày 15/6/2014) http://en.wikipedia.org/wiki/Acetic_acid, (ngày 15/6/2014) http://www.vinachem.com.vn/Desktop.aspx/Xuat-ban-pham/4/11/, (ngày 16/6/2014) http://www.asm.org/index.php/asm-newsroom/press-releases/2-uncategorised/92867- vinegar-kills-tuberculosis-and-other-mycobacteria (ngày 24/11/2014)
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học
PHỤ LỤC
PHỤ LỤC 1: HÌNH ẢNH THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG THÍ NGHIỆM
Kính hiển vi Cân phân tích Tủ ủ
Nồi khử trùng Máy OD Tủ ủ nhiệt
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học
PHỤ LỤC 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 2.1. Phương pháp nhuộm Gram
− Nhỏ một giọt nước đã khử trùng lên kính mang vật.
− Lấy một ít sinh khối trên môi trường thạch MRS (hoặc trong ống trữ), cho vào giọt nước vô trùng trên miếng lam vô trùng, trãi ra cho đều và thật mỏng theo hình xoắn ốc.
− Lướt mặt nước của kính mang vật trên ngọn lửa cách khoảng 10cm độ 3 lần để giết chết vi sinh vật và dán chúng lên kính mang vật.
− Nhỏ 1 hoặc 2 giọt Crystal violet cho phủ nơi cố định, để 60 giây. − Rửa nước từ 2 – 3 giây, chậm nhẹ cho khô bớt nước.
− Nhỏ giọt Lugol trong 60 giây (gắn phẩm nhuộm violet vào tế bào G+).
− Rửa cồn: thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối phiến kính, đến khi giọt cồn không còn màu tím nữa, nhỏ từ từ.
− Rửa nước vài giây, chậm nhẹ bằng giấy thấm cho khô. − Nhỏ 1 – 2 giọt Safranine để trong 60 giây.
− Rửa nước vài giây.
− Dùng giấy thấm chậm nhẹ hay hơ lửa cho khô nước. − Quan sát kính hiển vi.
Kết quả:
Tế bào vi sinh vật có màu tím xanh: vi khuẩn Gram dương. Tế bào vi sinh vật có màu hồng đỏ: Vi khuẩn Gram âm.
Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp (2002)
2.2. Thử nghiệm catalase (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nguyên tắc: các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy ý chứa chuỗi dẫn truyền điện có cytochrome đều có enzyme catalase ( trừ các streptococcus spp). Enzyme này là một trong các thành viên của hệ thống các enzyme bảo vệ tế bào khỏi tổn thương bởi