phân lập và tuyển chọn vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt từ men rượu và men cơm rượu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ACID ACETIC CHỊU NHIỆT TỪ MEN RƯỢU VÀ MEN CƠM RƯỢU CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS.TS NGÔ THỊ PHƯƠNG DUNG NGUYỄN THỊ NGỌC MAI MSSV: 3113727 LỚP: VI SINH VẬT HỌC K37 Cần Thơ, Tháng 12/2014 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS.TS Ngô Thị Phương Dung Nguyễn Thị Ngọc Mai XÉT DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………… ……… Cần Thơ, ngày tháng năm 2014 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG LỜI CẢM TẠ Xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học tạo điều kiện cho thực luận văn Trong trình thực luận văn, nhận giúp đỡ tận tình từ cán sinh viên Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực phẩm Tôi xin chân thành cảm ơn cô Ngô Thị Phương Dung, thầy Huỳnh Xuân Phong thầy Phạm Hồng Quang tận tình truyền đạt kiến thức cho Xin cảm ơn anh Nguyễn Ngọc Thạnh anh Bùi Hoàng Đăng Long tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, hỗ trợ hoàn thành luận văn Cảm ơn bạn Hoàng Anh, Ngọc Giao, Phương Thảo, Hải Yến lớp Vi sinh vật học K37 anh chị học viên cao học, sinh viên phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm nhiệt tình động viên, hỗ trợ đóng góp ý kiến cho suốt trình thực luận văn Nguyễn Thị Ngọc Mai Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37-2014 Trường Đại học Cần Thơ TÓM TẮT Acid acetic ứng dụng rộng rãi nhiều ngành công nghiệp, acid acetic acid hữu sử dụng phổ biến trình chế biến thực phẩm Vi khuẩn acid acetic có ý nghĩa quan trọng trình lên men Đề tài phân lập 30 chủng vi khuẩn acid acetic (Acetic Acid Bacteria, AAB) từ 14 mẫu men rượu men cơm rượu 11 tỉnh thành khác Phân loại thông qua khả oxy hóa acetate cho thấy có 25 chủng thuộc giống Acetobacter chủng thuộc giống Gluconobacter Thử nghiệm khả sinh acid môi trường có 0,01% bromocresol green sơ tuyển 15 chủng AAB (B1, MT, Đ1, H1, H2, L6.2, T2, CA2, CB, C2.2, C3.1, CN, CS, CT1 CV1) có đường kính vùng sáng khoảng 20-46 mm 48 ủ 30oC Kết thử nghiệm khả phát triển nồng độ acid khác cho thấy chủng CN phát triển nồng độ acid 3,0%, chủng CB, H2, C2.2 có khả phát triển nồng độ acid 2,0% Kết thử nghiệm khả chịu nhiệt môi trường YPGD có bổ sung 4% ethanol cho thấy tất chủng phát triển nhiệt độ cao từ 43oC 45oC, chủng B1 H1 phát triển mạnh 45oC Thử nghiệm khả lên men 30oC, 37oC, 38oC 39oC môi trường YPGD bổ sung 4% ethanol điều kiện ủ lắc 150 vòng/phút ngày tuyển chọn chủng AAB chịu nhiệt lên men acid acetic, CN CB với nồng độ acid acetic 3,12% 3,04% (w/v) 39oC Từ khóa: acid acetic, chịu nhiệt, lên men acid acetic, vi khuẩn acid acetic Chuyên ngành Vi sinh vật học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC Trang PHẦN KÝ DUYỆT LỜI CẢM TẠ TÓM TẮT .i MỤC LỤC ii DANH SÁCH BẢNG iv DANH SÁCH HÌNH v CÁC TỪ VIẾT TẮT .vi CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu acid acetic 2.1.1 Giới thiệu chung acid acetic 2.1.2 Phương pháp sản xuất 2.1.3 Ứng dụng 2.2 Tổng quan trình lên men vi sinh vật 2.2.1 Bản chất trình lên men 2.2.2 Quá trình lên men acid acetic 2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men 2.3 Vi khuẩn acid acetic 2.3.1 Giới thiệu vi khuẩn acid acetic 2.3.2 Phân loại 2.3.3 Vai trò quan trọng vi khuẩn acid acetic 11 2.4 Sơ lược men rượu men cơm rượu 12 2.4.1 Men rượu men cơm rượu 12 2.4.2 Hệ vi sinh vật men rượu men cơm rượu 13 2.4.3 Quy trình sản xuất men rượu men cơm rượu 15 Chuyên ngành Vi sinh vật học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 Phương tiện nghiên cứu 17 3.1.1 Thời gian địa điểm 17 3.1.2 Nguyên liệu 17 3.1.3 Thiết bị - dụng cụ hóa chất 17 3.2 Phương pháp nghiên cứu 18 3.2.1 Phân lập chủng vi khuẩn acid acetic 18 3.2.2 Đặc tính hình thái, sinh lý sinh hóa chủng vi khuẩn acid acetic 19 3.2.3 Sơ tuyển chủng vi khuẩn có khả sinh acid acetic 19 3.2.4 Khảo sát khả phát triển nồng độ acid acetic khác 19 3.2.5 Khảo sát khả chịu nhiệt vi khuẩn acid acetic 20 3.2.6 Tuyển chọn chủng vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt có khả sinh acid mạnh 20 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 4.1 Phân lập chủng vi khuẩn acid acetic 21 4.2 Đặc tính hình thái , sinh lý sinh hóa chủng vi khuẩn acid acetic 23 4.3 Sơ tuyển chủng vi khuẩn có khả sinh acid acetic 26 4.4 Khả phát triển nồng độ acid acetic khác 27 4.5 Khả chịu nhiệt vi khuẩn acid acetic 29 4.6 Tuyển chọn chủng vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt có khả sinh acid mạnh 31 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36 5.1 Kết luận 36 5.2 Đề nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 PHỤ LỤC Chuyên ngành Vi sinh vật học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1: Các mẫu men rượu men cơm rượu thu thập 17 Bảng 2: Số lượng chủng vi khuẩn acid acetic phân lập từ men rượu men cơm rượu 22 Bảng 3: Kết phân loại chủng AAB 25 Bảng 4: Đặc điểm 15 chủng AAB chọn 27 Bảng 5: Kết thử nghiệm khả phát triển nồng độ acid acetic khác 15 chủng AAB 29 Bảng 6: Kết thử nghiệm khả chịu nhiệt 15 chủng AAB 30 Chuyên ngành Vi sinh vật học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1: Cấu trúc hóa học acid acetic Hình 2: Vi khuẩn Acetobacter aceti 10 Hình 3: Quy trình sản xuất bánh men thuốc bắc 16 Hình 4: Khuẩn lạc tạo vòng halo môi trường (a), môi trường CaCO3 (b) môi trường đối chứng có CaCO3 (c) 21 Hình 5: Khuẩn lạc số chủng AAB 23 Hình 6: Hình dạng tế bào nhuộm Gram số chủng AAB 24 Hình 7: Sự biến đổi màu môi trường thị sau 48 25 Hình 8: Sự biến đổi màu thị số chủng AAB 24 (b) môi trường đối chứng (a) 26 Hình 9: Thử khả phát triển chủng AAB nồng độ acid acetic khác (0,5%, 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5% 3,0%) 28 Hình 10: Thử khả chịu nhiệt chủng AAB nhiệt độ khác (30oC, 37oC, 39oC, 41oC, 43oC 45oC) 30 Hình 11: Sự phát triển chủng AAB 30oC 31 Hình 12: Hàm lượng acid acetic chủng AAB 30oC 32 Hình 13: Sự phát triển chủng AAB 37oC 32 Hình 14: Hàm lượng acid acetic chủng AAB 37oC 33 Hình 15: Sự phát triển chủng AAB 38oC 33 Hình 16: Hàm lượng acid acetic chủng AAB 38oC 34 Hình 17: Sự phát triển chủng AAB 39oC 34 Hình 18: Hàm lượng acid chủng AAB 39oC 35 Chuyên ngành Vi sinh vật học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ CÁC TỪ VIẾT TẮT AAB Acetic Acid Bacteria v/v Thể tích/Thể tích w/v Khối lượng/Thể tích YPGD Yeast – Polypeptone – Glycerol – D Glucose Chuyên ngành Vi sinh vật học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Hiện nay, acid hữu không ứng dụng công nghệ thực phẩm mà ứng dụng nhiều công nghiệp như: công nghiệp tổng hợp hữu cơ, công nghiệp thực phẩm, công nghiệp chế biến mủ cao su,… nhu cầu ngày tăng, đặc biệt acid acetic Acid acetic dùng nhiều sản xuất sản phẩm như: giấm, L-sorbose, dihydroxyacetone, D-gluconate, keto-D-gluconates (Matsushita, 2009),… Ở nước ta, việc sản xuất acid acetic chủ yếu phương pháp truyền thống với quy mô nhỏ phục vụ cho công nghiệp thực phẩm Với quy mô đáp ứng nhu cầu ngày tăng nước ta ngành công nghiệp, công nghiệp chế biến mủ cao su Acid acetic dùng trực tiếp bữa ăn gọi giấm ăn Trong nghiên cứu gần nhiều nhà khoa học, giấm có chứa acid amin, glycerin có tác dụng làm mềm da, loại bỏ gàu, giảm cân, chữa lành da khô nức nẻ, làm dịu cổ họng, giảm cháy nắng ong đốt, tốt cho người bị viêm khớp, giảm nhức bị sứa cắn, đau viêm xoang,… Mới đây, nhà khoa học Venezuela phát thấy acid acetic có khả chống lại vi trùng lao vi khẩn kháng thuốc khác (Jim Sliwa, 2014) Để có sản phẩm lên men acid acetic nhờ vào nhóm vi khuẩn gọi chung vi khuẩn acid acetic (Acetic Acid Bacteria, AAB) Nguồn nguyên liệu để sản xuất acid acetic phong phú như: mật rỉ, nước chín, phấn hoa, men rượu, men cơm rượu loại có chứa cellulose gỗ,… Men rượu men cơm rượu thành phần để sản xuất rượu cơm rượu truyền thống sử dụng khắp tỉnh Việt Nam Hệ vi sinh vật men rượu men cơm rượu đa dạng, vai trò nấm men, nấm mốc việc lên men rượu, men rượu men rượu chứa lượng vi khuẩn acid acetic định Trong năm gần đây, việc gia tăng nhiệt độ toàn cầu làm xã hội có số thách thức nghiêm trọng việc lên men với quy mô công nghiệp hệ thống làm lạnh lớn tiêu tốn nhiều lượng để giữ nhiệt độ tối ưu Vì vậy, việc phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn chịu nhiệt lên men acid acetic thu hút nhiều quan tâm mang lại lợi nhuận lớn cho xã hội Qua tiến tới quy trình sản xuất giấm sản phẩm lên men từ AAB quy mô công nghiệp mang lại hiệu Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận - Phân lập 30 chủng vi khuẩn acid acetic từ 14 mẫu men rượu men cơm rượu từ 11 tỉnh, thành phố khác - Phân loại thông qua khả oxy hóa acetate tạo CO2 H2O cho thấy có 25 chủng thuộc giống Acetobacter chủng thuộc giống Gluconobacter - Sơ tuyển 15 chủng B1, MT, DD1, H1, H2, L6.2, T2, CA2, CB, C2.2, C3.2, CN, CS, CT1 CV1 có đường kính vùng sáng (thể khả sinh acid) khoảng 20-46 mm 48 ủ 30oC - Chủng CN có khả phát triển nồng độ acid 3,0%, chủng CB, H2, C2.2 có khả phát triển nồng độ acid 2,0%, hai chủng CT1 L6.2 có khả phát triển nồng độ acid 1,5%, chủng lại phát triển nồng độ acid 1,0% - Tất chủng phát triển nhiệt độ cao từ 43oC 45oC, chủng B1, MT, Đ1, H1, H2, L6.2, T2, CA2, C3.1 CV1 phát triển đến 45oC, chủng B1 H1 phát triển mạnh 45oC, chủng CB, C2.2, CN, CS CT1 phát triển 43oC - Đề tài tuyển chọn chủng AAB chịu nhiệt lên men acid acetic CN CB thuộc giống Gluconobacter với nồng độ acid acetic sinh đạt 3,12% 3,04% (w/v) 39oC 5.2 Đề nghị - Định danh mức độ loài chủng CN CB - Nghiên cứu điều kiện lên men nhiệt độ cao chủng CN CB Từ đó, nghiên cứu quy trình lên men giấm hay sản phẩm khác có lên men giấm Chuyên ngành Vi sinh vật học 36 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bùi Thị Quỳnh Hoa Nguyễn Bảo Lộc 2008 Giáo trình Công nghệ sản xuất rượu bia nước giải khát Trường Đại học Cần Thơ Cao Ngọc Điệp Nguyễn Hữu Hiệp 2002 Thực tập Vi sinh vật đại cương Trường Đại học Cần Thơ Huỳnh Xuân Phong 2011 Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lên men acid acetic chịu nhiệt Luận văn thạc sĩ khoa học chuyên ngành công nghệ sinh học, Trường Đại Học Cần Thơ Lương Đức Phẩm 1998 Công nghệ vi sinh vật Nxb Nông nghiệp Hà Nội Lương Đức Phẩm 2001 Vi sinh vật học an toàn vệ sinh thực phẩm Nxb Nông nghiệp Hà Nội Nguyễn Đức Lượng 2003 Công nghệ Vi sinh vật (tập 3) Nxb Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Lân Dũng 1999 Vi sinh vật học Nhà xuất Giáo dục Nguyễn Thúy Hường 2011 Nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ mô hình sản xuất rượu đặc sản Mai Hạ (Hòa Bình) Viện Công nghiệp Thực phẩm Trần Linh Thước, 2003 Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm Nxb Giáo dục, TPHCM Trần Thị Thanh 2000 Công nghệ vi sinh Nxb Giáo dục Hà Nội Tiếng Anh A’ngel Gonza’ lez 2005 Application of molecular methods for routine identification of acetic acid bacteria International Journal of Food Microbiology, vol 108, pp 141 – 146 Becca 2012 Using Utrasound Technology to Combat Wine Spoilage: A Novel Approach Ben Mils 2009 Structural Information (Determined by gar – phase electron diffraction) from CRC Handbook, 88th edition Chuyên ngành Vi sinh vật học 37 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ Cleenwerck I, Vandemeulebroecke L, Janssens D, Swing J 2002 Re – examination of The genus Acetobacter with descriptions of Acetobacter cerivisiae sp Nov and Acetobacter malorum sp nov Int J Syst Evol Microbiol, 52: 1551 – 1558 Jim Sliwa 2014 The active ingredient in vinegar, acid acetic, can effectively kill mycobacteria, even highly drug-resistant Mycobacterium tuberculosis, an international team of researchers from Venezuela, France and the US reports in mBio American Society for Microbiology Jojima, Y., Y Mihara, S Suzuki, K Yokozeki, S Yamanaka, and R Fudou 2004 Saccharibacter floricola gen nov., sp Nov., anovel osmophilic acetic acid bacterium isolated from pollen Int J Syst Evol Microbiol 5, pp 2263-2267 Greenberg DE, Porcella SF, Murray PR, Holland SM, Zelazny AM 2006 Granulibacter bethesdensis gen nov., a distinctive patogenic acetic acid bacterium in the familly Acetobacteraceae Int J Syst Evol Microbiol, 56: 2609 – 2616 Holt, J G., N.R Krieg P.H.A Sneath, J.T Stanley and S T Williams 1994 Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology 9th Ed, Williams and Wilkins, Baltimore Watchara Kanchanarach 2010 Studies on Acetuc acid Fermentation and Acetic acid Resistance Abilities in Thermotolerant Acetobacter pasteurianus Strains Watchara Kanchanara, Guunjana Theeragool, Toshiharu Yakishi, Hirohide Toyama, Asao Adachi, Kazunobu Maatsushita, 2009 Characterization of thermotolerant Acetobacter pasteurianus strains and quinoprotein alcohol dehydrogenases Trang web http://luanvan.co/luan-van/quy-trinh-san-xuat-ruou-gao-tu-banh-men-thuoc-bac-1560/, (ngày 16/5/2014) http://en.wikipedia.org/wiki/Acetic_acid, (ngày 15/6/2014) http://www.vinachem.com.vn/Desktop.aspx/Xuat-ban-pham/4/11/, (ngày 16/6/2014) Chuyên ngành Vi sinh vật học 38 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: HÌNH ẢNH MỘT SỐ THIẾT BỊ Kính hiển vi Cân phân tích Tủ ủ Nồi khử trùng Máy đo quang phổ Tủ lắc Tủ cấy vô trùng Chuyên ngành Vi sinh vật học Buồng ủ nhiệt cách thủy Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC 2: BẢNG THỐNG KÊ KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Kết thống kê hàm lượng acid acetic (%w/v) lên men 30oC General Linear Model: Nồng độ versus Chủng, Ngày Factor Chủng Ngày Type fixed fixed Levels Values C2.2, CB, CN, CT1, H2, L6.2 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, Analysis of Variance for Nồng độ, using Adjusted SS for Tests Source Chủng Ngày Chủng*Ngày Error Total DF 35 96 143 S = 0.136748 Seq SS 129.5864 114.9244 38.8232 1.7952 285.1292 Adj SS 129.5864 114.9244 38.8232 1.7952 R-Sq = 99.37% Adj MS 25.9173 16.4178 1.1092 0.0187 F 1385.95 877.96 59.32 P 0.000 0.000 0.000 R-Sq(adj) = 99.06% Unusual Observations for Nồng độ Obs 38 48 49 58 60 70 74 87 121 Nồng độ 2.52000 0.60000 1.56000 3.24000 2.52000 1.08000 4.08000 1.68000 2.52000 Fit 2.80000 0.92000 1.24000 2.96000 2.96000 0.76000 3.80000 1.40000 2.76000 SE Fit 0.07895 0.07895 0.07895 0.07895 0.07895 0.07895 0.07895 0.07895 0.07895 Residual -0.28000 -0.32000 0.32000 0.28000 -0.44000 0.32000 0.28000 0.28000 -0.24000 St Resid -2.51 -2.87 2.87 2.51 -3.94 2.87 2.51 2.51 -2.15 R R R R R R R R R R denotes an observation with a large standardized residual Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Chủng CN CN CN CN CB CB CB CB CN CB CN H2 CB H2 L6.2 H2 L6.2 L6.2 C2.2 CT1 CN H2 H2 H2 C2.2 C2.2 CT1 Ngày 7 3 7 6 7 N 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Mean 5.56000 5.00000 4.76000 3.80000 3.80000 3.64000 3.52000 3.48000 3.32000 2.96000 2.80000 2.76000 2.32000 2.20000 2.12000 2.08000 1.92000 1.80000 1.60000 1.56000 1.40000 1.40000 1.40000 1.24000 1.20000 1.12000 1.08000 Chuyên ngành Vi sinh vật học Grouping A B B C C C D C D C D D E E F F F G G H H H H H I I I I J I J K J K J K K K K L L L L L L L M M M M M M M N N N N N N N O O P O P Q O P Q R Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 CT1 CB CT1 L6.2 CT1 C2.2 H2 C2.2 L6.2 CT1 L6.2 L6.2 CT1 C2.2 C2.2 C2.2 H2 CT1 L6.2 CN CB 4 3 1 0 0 0 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Trường Đại học Cần Thơ 1.04000 1.00000 0.92000 0.92000 0.88000 0.84000 0.80000 0.76000 0.76000 0.72000 0.68000 0.64000 0.60000 0.44000 0.36000 0.00000 0.00000 -0.00000 -0.00000 -0.00000 -0.00000 N O P N O P O P O P O P O P O P P P Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q R R R R R R R R R R R R S S S S S S S S S S S S S T T T T T T T T T T U U U U U U U U V U V V V V V V V Means that not share a letter are significantly different Kết thống kê hàm lượng acid acetic (%w/v) lên men 37oC General Linear Model: Nồng độ versus Chủng, Ngày Factor Chủng Ngày Type fixed fixed Levels Values C2.2, CB, CN, CT1, H2, L6.2 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, Analysis of Variance for Nồng độ, using Adjusted SS for Tests Source Chủng Ngày Chủng*Ngày Error Total DF 35 96 143 S = 0.210581 Seq SS 37.3001 52.2049 24.1308 4.2571 117.8928 Adj SS 37.3001 52.2049 24.1308 4.2571 R-Sq = 96.39% Adj MS 7.4600 7.4578 0.6895 0.0443 F 168.23 168.18 15.55 P 0.000 0.000 0.000 R-Sq(adj) = 94.62% Unusual Observations for Nồng độ Obs 127 128 129 Nồng độ 3.00000 3.00000 0.76000 Fit 2.25333 2.25333 2.25333 SE Fit 0.12158 0.12158 0.12158 Residual 0.74667 0.74667 -1.49333 St Resid 4.34 R 4.34 R -8.69 R R denotes an observation with a large standardized residual Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Chủng CN CB CB CN CN CB H2 CN H2 CT1 CB Ngày 6 7 N 3 3 3 3 3 Mean 3.28000 2.80000 2.68000 2.64000 2.25333 2.08000 1.96000 1.92000 1.84000 1.72000 1.72000 Chuyên ngành Vi sinh vật học Grouping A A B A B C A B C D B C D E C D E D E E E E E F F F F F F G G G G G H H H I H I Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 H2 CT1 CT1 H2 CT1 CN CB CN H2 CT1 CB L6.2 H2 C2.2 CN C2.2 L6.2 C2.2 C2.2 L6.2 CT1 L6.2 L6.2 H2 CB C2.2 C2.2 L6.2 C2.2 CT1 L6.2 C2.2 H2 CT1 L6.2 CN CB 4 3 3 4 5 6 1 2 1 0 0 0 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1.60000 1.48000 1.40000 1.32000 1.24000 1.12000 0.92000 0.88000 0.76000 0.56000 0.56000 0.48000 0.40000 0.40000 0.36000 0.36000 0.32000 0.32000 0.28000 0.28000 0.28000 0.28000 0.24000 0.20000 0.20000 0.16000 0.16000 0.16000 0.16000 0.12000 0.12000 0.00000 0.00000 -0.00000 -0.00000 -0.00000 -0.00000 Trường Đại học Cần Thơ E F G H I F G H I F G H I G H I H I I J J J J J J J K K K K K K K L L L L L L L M M M M M M M N N N N N N N O O O O O O O O O O O O O O O O O P P P P P P P P P P P P P P P P P P Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R Means that not share a letter are significantly different Kết thống kê hàm lượng acid acetic (%w/v) lên men 38oC General Linear Model: Nồng độ versus Chủng, Ngày Factor Chủng Ngày Type fixed fixed Levels Values CB, CN, CT1, H2 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, Analysis of Variance for Nồng độ, using Adjusted SS for Tests Source Chủng Ngày Chủng*Ngày Error Total DF 21 64 95 S = 0.0764853 Seq SS 22.4788 60.5135 13.4504 0.3744 96.8171 Adj SS 22.4788 60.5135 13.4504 0.3744 R-Sq = 99.61% Adj MS 7.4929 8.6448 0.6405 0.0058 F 1280.85 1477.74 109.49 P 0.000 0.000 0.000 R-Sq(adj) = 99.43% Unusual Observations for Nồng độ Obs 71 76 Nồng độ 1.32000 3.24000 Fit 1.16000 3.08000 SE Fit 0.04416 0.04416 Residual 0.16000 0.16000 St Resid 2.56 R 2.56 R R denotes an observation with a large standardized residual Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Chủng CN CB CN CB CN CB CN CB H2 H2 H2 CN CT1 CT1 CB H2 CN CT1 CT1 CB H2 CN CT1 H2 CB CT1 H2 CT1 CB CT1 H2 CN Ngày 6 7 5 4 5 3 2 1 0 0 N 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Mean 3.16000 3.08000 3.00000 2.96000 2.56000 2.32000 1.96000 1.68000 1.48000 1.40000 1.16000 0.92000 0.88000 0.84000 0.80000 0.76000 0.76000 0.72000 0.56000 0.52000 0.52000 0.32000 0.28000 0.28000 0.24000 0.12000 0.12000 0.08000 0.00000 -0.00000 -0.00000 -0.00000 Grouping A A A A B B C D D E E F F G G H H H H H H H I I I I I J J J J K J K L J K L K L M L M L M M M M M N N N N N N N N Means that not share a letter are significantly different Kết thống kê hàm lượng acid acetic (%w/v) lên men 39oC General Linear Model: Nồng độ versus Chủng, Ngày Factor Chủng Ngày Type fixed fixed Levels Values CB, CN, CT1, H2 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, Analysis of Variance for Nồng độ, using Adjusted SS for Tests Source Chủng Ngày Chủng*Ngày Error Total DF 21 64 95 S = 0.112250 Seq SS 22.2528 57.6408 13.5888 0.8064 94.2888 Adj SS 22.2528 57.6408 13.5888 0.8064 R-Sq = 99.14% Adj MS 7.4176 8.2344 0.6471 0.0126 F 588.70 653.52 51.36 P 0.000 0.000 0.000 R-Sq(adj) = 98.73% Unusual Observations for Nồng độ Obs 64 71 73 75 76 77 Nồng độ 2.04000 1.32000 3.36000 2.88000 3.36000 2.76000 Fit 2.24000 1.12000 3.12000 3.12000 3.04000 3.04000 Chuyên ngành Vi sinh vật học SE Fit 0.06481 0.06481 0.06481 0.06481 0.06481 0.06481 Residual -0.20000 0.20000 0.24000 -0.24000 0.32000 -0.28000 St Resid -2.18 2.18 2.62 -2.62 3.49 -3.06 R R R R R R Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ R denotes an observation with a large standardized residual Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Chủng CN CB CN CB CN CB CN CB H2 H2 H2 CN CT1 CT1 CT1 H2 CN CB CT1 H2 CB CN CB CT1 H2 H2 CT1 CT1 CB H2 CN CT1 Ngày 6 7 5 4 5 4 1 1 0 0 N 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Mean 3.12000 3.04000 2.96000 2.92000 2.52000 2.24000 1.88000 1.76000 1.40000 1.36000 1.12000 0.96000 0.84000 0.76000 0.72000 0.72000 0.72000 0.72000 0.60000 0.48000 0.44000 0.36000 0.28000 0.28000 0.24000 0.16000 0.12000 0.08000 0.00000 -0.00000 -0.00000 -0.00000 Grouping A A A A B B C C D D E E F F F G G H G H I G H I J H I J H I J H I J H I J H I J I J J K K K K K K K K L L L L L L L M M M M M M M M N N N N N N N N O O O O O O O O O O O Means that not share a letter are significantly different Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC 3: BẢNG CÁC SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM Bảng 7: Kết thử nghiệm khả sinh acid chọn 15 chủng tốt STT Loại mẫu Địa điểm Tên Tạo acid (mm) Chọn chủng 24 48 B1 15 23 B2 MT 11 20 * Đ1 12 22 * Đ2 10 H1 17 25 * H2 20 29 * L4.1 11 L4.2 10 L5.1 7 L5.2 14 12 L6.1 13 L6.2 19 26 T1 10 13 T2 12 23 VL1 15 VL2 10 CA1 13 CA2 15 20 * * Buôn Mê Thuột Cần Thơ Đồng Nai Hóc Môn Men rượu 10 Long An 11 14 Tiền Giang 15 16 Vĩnh Long 17 18 An Giang 19 * * * 20 Bạc Liêu CB 25 32 21 Cà Mau CM C2.1 C2.2 18 25 * C3.1 19 29 * CN 39 46 * CS 14 20 * CT1 16 22 * CT2 11 17 CV1 18 26 CV2 22 23 24 Men cơm rượu Cần Thơ 25 26 27 28 29 30 Chuyên ngành Vi sinh vật học Đồng Tháp Tiền Giang Vĩnh Long * Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 8: Bảng thống kê số liệu phát triển (OD 550nm) chủng AAB ngày 30oC, 37oC, 38oC, 39oC Nhiệt độ 30oC 37oC 38oC 39oC Chủng Sự phát triển chủng AAB theo ngày đo OD (550nm) CN 0,027 0,912 1,389 1,554 1,631 1,749 1,866 2,147 CB 0,024 1,168 1,276 1,422 1,586 1,628 1,745 1,877 C2.2 0,022 0,685 1,283 1,508 1,870 2,076 2,346 2,612 CT1 0,026 0,461 1,276 1,483 1,885 2,068 2,351 2,643 H2 0,024 0,868 1,186 1,480 1,892 2,041 2,334 2,526 L6.2 0,029 0,605 1,224 1,329 1,865 2,043 2,103 2,481 CN 0,029 0,490 0,882 1,476 1,559 1,684 1,740 1,927 CB 0,026 0,872 1,195 1,397 1,507 1,529 1,657 1,914 C2.2 0,024 0,350 1,135 1,412 1,744 1,834 1,994 2,134 CT1 0,027 0,658 1,041 1,454 1,759 1,828 1,996 2,231 H2 0,023 0,620 1,096 1,404 1,870 1,903 2,174 2,364 L6.2 0,024 0,439 1,090 1,312 1,848 1,901 2,077 2,309 CN 0,024 0,703 1,165 1,438 1,504 1,678 1,711 1,920 CB 0,033 0,822 0,818 1,383 1,368 1,646 1,695 1,899 CT1 0,028 0,725 1,078 1,306 1,585 1,818 1,993 2,015 H2 0,034 0,787 0,973 1,385 1,812 1,907 1,982 2,310 CN 0,022 0,605 1,121 1,419 1,671 1,740 1,771 1,963 CB 0,030 0,929 0,806 1,332 1,497 1,657 1,684 1,842 CT1 0,025 0,801 1,040 1,297 1,587 1,722 1,906 2,006 H2 0,029 0,829 0,938 1,358 1,790 1,899 1,965 2,306 Ghi chú: Giá trị bảng giá trị trung bình lần lặp lại Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 9: Bảng thống kê số liệu hàm lượng acid chủng AAB ngày 30oC, 37oC, 38oC, 39oC Nhiệt độ 30oC 37oC 38oC 39oC Chủng Hàm lượng acid chủng AAB theo dõi ngày (% w/v) CN 1,4 2,8 3,32 3,8 4,76 5,56 CB 2,32 2,96 3,48 3,64 3,8 3,52 C2.2 0,36 0,44 0,76 0,84 1,12 1,6 1,2 CT1 0,6 0,92 0,72 0,88 1,04 1,56 1,08 H2 0,8 1,24 1,4 1,4 2,08 2,76 2,2 L6.2 0,64 0,68 0,76 0,92 1,8 2,12 1,92 CN 0,36 0,88 1,12 1,92 2,64 3,28 2,92 CB 0,1 0,56 0,92 1,72 2,08 2,8 2,68 C2.2 0,16 0,16 0,32 0,4 0,36 0,28 0,16 CT1 0,12 0,28 0,56 1,24 1,4 1,72 1,48 H2 0,2 0,4 0,76 1,32 1,6 1.96 1,84 L6.2 0,12 0,16 0,28 0,48 0,32 0.28 0,24 CN 0,32 0,76 0,92 1,96 2,56 3,16 CB 0,24 0,52 0,8 1,68 2,32 3,08 2,96 CT1 0,08 0,12 0,28 0,56 0,88 0,84 0,72 H2 0,12 0,28 0,52 0,76 1,16 1,48 1,4 CN 0,36 0,72 0,96 1,88 2,52 3,12 2,96 CB 0,28 0,44 0,72 1,76 2,24 3,04 2,92 CT1 0,12 0,08 0,28 0,6 0,84 0,76 0,72 H2 0,16 0,24 0,48 0,72 1,12 1,4 1,36 Ghi chú: Giá trị bảng giá trị trung bình lần lặp lại Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC 4: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Phương pháp nhuộm Gram (Cao Ngọc Điệp Nguyễn Hữu Hiệp, 2002) Nhỏ giọt nước cất khử trùng lên kính mang vật Lấy sinh khối vi khuẩn môi trường YPGD cho vào giọt nước vô trùng miếng lam vô trùng, trải cho thật mỏng Lướt mặt kính mang vật lửa cách khoảng 10cm khoảng lần để giết chết vi sinh vật dán chúng lên kính mang vật Nhỏ giọt crystal violet cho phủ nơi cố định, để 60 giây Rửa nước từ – giây; thấm nhẹ cho khô bớt nước Nhỏ dung dịch lugol 60 giây (gắn phẩm nhuộm violet vào tế bào vi khuẩn Gram dương) Rửa cồn thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối phiến kính, đến giọt cồn không màu tím nữa, nhỏ từ từ Rửa nước vài giây, thấm nhẹ giấy thấm cho khô Nhỏ – giọt safranine để 60 giây Rửa nước vài giây Dùng giấy thấm chậm nhẹ hay hơ lửa cho khô nước Quan sát kính hiển vi Kết quả: Tế bào vi khuẩn có màu tím xanh: Vi khuẩn Gram dương Tế bào vi khuẩn có màu hồng đỏ: Vi khuẩn Gram âm Thử nghiệm catalase (Trần Linh Thước, 2003) Nguyên tắc: Các vi sinh vật hiếu khí kỵ khí tùy ý chứa chuỗi dẫn truyền điện tử có cytochrome có enzyme catalase (trừ Streptococcus spp) Enzyme thành viên hệ thống enzyme bảo vệ tế bào khỏi tổn thương dẫn xuất độc tính cao oxy phân tử tế bào hiếu khí vi hiếu khí Các vi sinh vật có khả biến dưỡng lượng theo phương thức hô hấp với oxy chất nhận điện tử cuối chuỗi dẫn truyền điện tử tạo H2O O2, ngăn cản tích tụ phân tử có độc tính cao tế bào Tuy nhiên, catatalase, nhiều enzyme oxydase khác hệ thống enzyme bảo vệ tế bào khỏi stress oxy hóa có khả thủy phân hydrogen peroxide Các enzyme diện tế bào, vi sinh vật hiếu khí vi hiếu khí có khả biến dưỡng lượng theo phương thức hô hấp hiếu khí Sự thủy phân hydrogen peroxide giải phóng O2 ghi nhận qua tượng sủi bọt khí Phương pháp thực hiện: Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ - Hóa chất sử dụng dung dịch hydrogen peoxide 30% giữ lạnh chai màu nâu, tránh ánh sáng; dung dịch đệm phosphate pH 7,0 Có thể thực thử nghiệm catalase phương pháp sau: - Thử phiến kính (lame): dùng kim cấy lấy sinh khối vi sinh vật phiến kính Ghi nhận sủi bọt có Kết quả: thử nghiệm (+) có tượng sủi bọt khí O2 tạo ngược lại (-) tượng sủi bọt khí Thử nghiệm oxydase (Trần Linh Thước, 2003) Nguyên tắc: Thử nghiệm nhằm xác định diện hệ enzyme oxydase vi sinh vật Thành viên quan trọng hệ enzyme cytochrome oxydase chuỗi dẫn truyền điện tử hô hấp hiếu khí với O2 chất điện tử sau nên diện loài vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy ý Số chủng loại cytochrome oxydase phát nhờ thuốc thử p-phenylenediamine Trong điều kiện có diện cytochrome c khử tế bào, thuốc thử bị oxy hóa thành hợp chất indolphenol có màu xanh dương Phương pháp thự hiện: Nhỏ giọt nước cất vô trùng lên kính mang vật Lấy sinh khối vi khuẩn cho vào giọt nước cất vô trùng kính mang vật Dùng thuốc thử oxydase đặt lên giọt nước cất vô trùng chứa sinh khối vi khuẩn Kết quả: Thử nghiệm (+) xuất màu xanh dương đậm, thử nghiệm (-) không xuất màu xanh dương đậm Acid tổng số Chuẩn bị hóa chất - Dung dịch NaOH 0,8N: cân 4g NaOH khan cho vào 125mL nước cất, hòa tan giữ chai có nút mài - Dung dịch thị phenoltaphlein: cân xác 40mg phenoltaphlein cho vào 25mL ethanol 70% Giữ chai có nút kín Cách thực - Lấy 1mL dịch lên men cho vào ống nghiệm 10mL - Cho vào 10µL dung dịch phenoltaphlein lắc Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ - Dùng pipet cho vào lần 25µl dung dịch NaOH 0,8N, lắc đến có màu hồng nhạt bền khoảng phút Ghi nhận số lần thêm 25µL dung dịch NaOH 0,8N - Lượng acid tính công thức (% w/w): 0,12 x (n-1); n số lần thêm 25µL dung dịch NaOH 0,8N Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học [...]... Mục tiêu đề tài Đề tài nhằm phân lập và tuyển chọn được vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt từ men rượu và men cơm rượu để lên men acid acetic Nội dung thực hiện: - Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn acid acetic - Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển và lên men acid acetic - Chọn các chủng AAB chịu nhiệt lên men tốt nhất Chuyên ngành Vi sinh vật học 2 Vi n NC&PT Công nghệ Sinh học... người tiêu dùng Dựa vào đó mà đề tài Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt từ men rượu và men cơm rượu được thực hiện nhằm mục đích đa dạng hơn về nguồn nguyên liệu từ những địa điểm khác nhau, mong muốn phân lập được nhiều dòng vi khuẩn acid acetic có khả năng chịu nhiệt cao và sinh acid mạnh Từ đó có thể định danh sơ bộ các chủng AAB có đặc tính tốt và tiến tới vi c sản xuất giống... Bảng 1: Các mẫu men rượu và men cơm rượu thu thập được Địa điểm Mẫu Quận Thốt Nốt, thành phố Cần Thơ Men rượu và men cơm rượu Thành phố Mỹ Tho, tỉnh Tiền Giang Men rượu và men cơm rượu Xã Đông Bình, thị xã Bình Minh, tỉnh Vĩnh Long Men rượu và men cơm rượu Xuân Thới Thạnh, Hóc Môn, thành phố Hồ Chí Minh Men rượu Mai Hắc Đế, thành phố Buôn Mê Thuột Men rượu Huyện Vĩnh Cửu, tỉnh Đồng Nai Men rượu Gò Đen,... nhất (Trần Thị Thanh, 2000)  Men cơm rượu Men cơm rượu (hay men ngọt) là một loại men thuộc men thuốc bắc có vị ngọt không phải loại men đắng (thường có kích thước nhỏ hơn vi n men làm rượu) dùng để làm cơm rượu Khi dùng sản xuất cơm rượu, vi n men được giã nhuyễn, tỷ lệ men và gạo thường thay đổi tùy vào trọng lượng mỗi vi n men Sự tồn tại của nhiều vi sinh vật trong vi n men tạo nên sự cân bằng giữa... trường phân lập vi khuẩn acid acetic YPGD: Yeast extract 5,0 g/L Polypeptone 5,0 g/L Glycerol 5,0 g/L D-Glucose 5,0 g/L - Các hóa chất khác: cồn tuyệt đối, bromocresol green, phenolthalein, NaOH,… 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Phân lập các chủng vi khuẩn acid acetic Mục đích: Phân lập các chủng AAB thuần từ các loại men rượu và men cơm rượu Phương pháp thực hiện - Thu mua một số loại men rượu và men cơm. .. quá trình lên men Mặt khác, nếu trong dịch lên men có mặt oxy thì vi khuẩn acetic sẽ oxy hóa rượu thành acid acetic làm giảm lượng rượu tạo thành Chuyên ngành Vi sinh vật học 14 Vi n NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ 2.4.3 Quy trình sản xuất men rượu và men cơm rượu  Các thành phần chủ yếu của men rượu và men cơm rượu Bột gạo: Phải chọn nguyên... khả năng thủy phân tinh bột vừa có khả năng chuyển đường thành rượu, tuy nhiên sự chuyển hóa này thấp Đặc biệt các loài nấm men dại này chịu được nhiệt độ rất cao (60-65oC)  Vi khuẩn Trong bánh men thuốc bắc có rất nhiều vi khuẩn phát triển, nhưng chủ yếu là vi khuẩn lactic như Lactobacillus, Streptococcus và vi khuẩn acetic như Acetic aceti, Acetic suboxydans, vi khuẩn gây thối Vi khuẩn sinh sản... tỉnh Long An Men rượu Phường Cái Khế, Quận Ninh Kiều, Thành phố Cần Thơ Men cơm rượu Quận Ô Môn, thành phố Cần Thơ Men cơm rượu Mỹ Phước, thành phố Long Xuyên, tỉnh An Giang Men cơm rượu Lê Lợi, phường 2, thành phố Cà Mau Men cơm rượu Thành phố Sa Đéc, tỉnh Đồng Tháp Men cơm rượu Huyện Hồng Dân, tỉnh Bạc Liêu Men cơm rượu 3.1.3 Thiết bị - dụng cụ và hóa chất  Thiết bị - dụng cụ Các thiết bị và dụng cụ... acid acetic 2.1.1 Giới thiệu chung acid acetic Acid acetic (hay còn gọi là acid ethanoic) là một acid hữu cơ, công thức hóa học là CH3COOH, khối lượng phân tử của acid acetic là 60 g/mol Acid acetic là một acid yếu, thuộc nhóm acid monoprotic Acid acetic tan tốt trong nước, ethanol, eter, benzene, acetone và chloroform; không tan trong CS2 Acid acetic rất bền với các chất oxy hóa như acid chromic và. .. trường YPGD chứa 4% ethanol, 2% agar và 0,5 % CaCO3 Kết quả phân lập và làm thuần 30 chủng vi khuẩn (Bảng 2) Chuyên ngành Vi sinh vật học 21 Vi n NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 2: Số lượng các chủng vi khuẩn acid acetic phân lập từ men rượu và men cơm rượu Mẫu Địa điểm Số chủng phân lập được 1 Buôn Mê Thuột 2 2 Cần Thơ 1 3 Đồng Nai 2 Hóc Môn