mạnh
Mục đích: Tuyển chọn các chủng AAB lên men mạnh có khả năng phát triển ở
nhiệt độ cao.
Phương pháp thực hiện
- Nuôi các chủng AAB trong ống nghiệm chứa 5mL môi trường YPGD có bổ sung 10% dịch trích khoai tây trong 24 giờ, lắc 150 vòng/phút ở 30oC.
- Rút 1 mL từ dịch lỏng vừa ủ vào 100 mL môi trường YPGD lỏng có bổ sung 4% ethanol.
- Ủ ở 30oC, 37oC, 38oC và 39oC và lắc ở 150 vòng/phút (do vi khuẩn có khả năng chịu được nhiệt độ cao nhưng khả năng sinh acid kém hoặc không thể sinh acid nên tiến hành ủ ở nhiệt độ tối đa khoảng 39oC).
- Mỗi ngày tiến hành đo mật số vi khuẩn bằng máy đo OD và theo dõi nồng độ acid trong 7 ngày bằng phương pháp chuẩn độ bằng NaOH 0,8N.
- So sánh và tuyển chọn được các chủng AAB có khả năng lên men acid acetic tốt nhất.
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn acid acetic
Phân lập được tổng cộng 30 chủng vi khuẩn acid acetic (Bảng 3) từ 14 mẫu men rượu và men cơm rượu tại 11 tỉnh thành (An Giang, Bạc Liêu, Buôn Mê Thuột, Cà Mau, Cần Thơ, Đồng Nai, Đồng Tháp, Long An, Thành Phố Hồ Chí Minh, Tiền Giang, Vĩnh Long). Mẫu được cho vào môi trường YPGD (yeast extract 5 g/L, polypepton 5 g/L, glycerol 5 g/L, D-glucose 5 g/L) có bổ sung 4% ethanol, 2% agar và 0,5% CaCO3 (ủ ở 30oC trong 2-3 ngày) để chọn các khuẩn lạc xuất hiện chủng halo trên môi trường, các khuẩn lạc đặc trưng được cấy chuyển nhiều lần để được chủng thuần.
Hình 4: Khuẩn lạc tạo vòng halo trên môi trường (a), môi trường không có CaCO3 (b) và môi trường đối chứng có CaCO3 (c)
Các khuẩn lạc đặc trưng được cấy phân lập nhiều lần trên môi trường YPGD chứa 4% ethanol, 2% agar và 0,5 % CaCO3. Kết quả phân lập và làm thuần 30 chủng vi khuẩn (Bảng 2).
Bảng 2: Số lượng các chủng vi khuẩn acid acetic phân lập từ men rượu và men cơm rượu
STT Mẫu Địa điểm Số chủng phân lập được
1
Men rượu
Buôn Mê Thuột 2
2 Cần Thơ 1 3 Đồng Nai 2 4 Hóc Môn 2 5 Long An 6 6 Tiền Giang 2 7 Vĩnh Long 2 8
Men cơm rượu
An Giang 2 9 Bạc Liêu 1 10 Cà Mau 1 11 Cần Thơ 4 12 Đồng Tháp 1 13 Tiền Giang 2 14 Vĩnh Long 2 Tổng cộng 30
Hình 5: Khuẩn lạc một số chủng AAB
4.2. Đặc tính hình thái , sinh lý và sinh hóa các chủng vi khuẩn acid acetic
Trong 30 chủng đã phân lập, các chủng vi khuẩn có hình dạng khuẩn lạc, hình dạng vi khuẩn và các đặc điểm sinh lý, sinh hóa như sau:
- Hình dạng khuẩn lạc: đa số khuẩn lạc tròn, một số không đều.
- Màu sắc khuẩn lạc: đa số khuẩn lạc màu trắng đục, một số chủng có màu vàng. - Hình dạng tế bào vi khuẩn: hình que,hình que ngắn, hình cầu, hình cầu kết chuỗi. - Catalase: dương tính, âm tính.
- Oxydase: âm tính.
CT1 B1
Hình 6: Hình dạng tế bào và nhuộm Gram của một số chủng AAB Phân loại các chủng vi khuẩn acid acetic
Theo tài liệu phân loại của Bergey (Holt et al., 1994), dựa vào phản ứng oxy hóa acetate sẽ phân loại thành hai giống Acetobacter và Gluconobacter. Cấy các chủng AAB trên môi trường YPGD + Bromocresol green 0,02% ủ ở 30oC, sau 24 giờ tất cả các chủng đều chuyển môi trường từ xanh lam sang vàng, nhưng sau 48-72 giờ, một số chủng AAB mà môi trường vẫn giữ màu vàng là Gluconobacter, còn một số chủng khác chuyển màu vàng thành xanh lục là Acetobacter.
CN
H2 CB
Hình 7: Sự biến đổi màu môi trường chỉ thị sau 48 giờ.
Màu xanh lam (a) là môi trường đối chứng, màu vàng (b) là Gluconobacter, màu xanh lục (c) là Acetobacter
Kết quả phân loại 30 chủng AAB thành 2 giống Acetobacter và Gluconobacter
được liệt kê ở Bảng 3.
Bảng 3: Kết quả phân loại các chủng AAB
STT Loại mẫu Địa điểm phân lập Chủng AAB
Acetobacter Gluconobacter
1
Men rượu
Buôn Mê Thuột B1 x
2 B2 x 3 Cần Thơ MT x 4 Đồng Nai Đ1 x 5 Đ2 x 6 Hóc Môn H1 x 7 H2 x 8 Long An L4.1 x 9 L4.2 x 10 L5.1 x 11 L5.2 x 12 L6.1 x 13 L6.2 x 14 Tiền Giang T1 x 15 T2 x 16 Vĩnh Long VL1 x 17 VL2 x 18
Men cơm rượu An Giang CA1 x
19 CA2 x
20 Bạc Liêu CB x 21 Cà Mau CM x 22 Cần Thơ C2.1 x 23 C2.2 x 24 C3.1 x 25 CN x 26 Đồng Tháp CS x 27 Tiền Giang CT1 x 28 CT2 x 29 Vĩnh Long CV1 x 30 CV2 x
Như vậy, trong 30 chủng AAB đã được phân lập được 25 chủng thuộc giống
Acetobacter chiếm đa số với tỷ lệ là 83,3% và 5 chủng thuộc giống Gluconobacter
chiếm tỷ lệ ít hơn (16,7%).
4.3. Sơ tuyển các chủng vi khuẩn có khả năng sinh acid acetic
Nuôi các chủng AAB trong ống nghiệm chứa môi trường YPGD lỏng trong 24 giờ. Nhỏ một giọt dung dịch nuôi cấy lên đĩa môi trường thạch màu xanh chứa bromocresol green đã chuẩn bị trước và đem ủ ở 30oC. Tiến hành đo vòng vàng sinh ra sau 24 giờ và sau 48 giờ.
Hình 8: Sự biến đổi màu chỉ thị của một số chủng AAB ở 24 giờ (b) và môi trường đối chứng (a).
Các chủng vi khuẩn làm xuất hiện vòng sáng màu vàng xung quanh khuẩn lạc thể hiện khả năng sinh acid, kết quả sơ tuyển được 15 chủng vi khuẩn được đánh giá là có khả năng sinh acid mạnh (Bảng 7, Phụ lục 3).
Bảng 4: Đặc điểm của 15 chủng AAB được chọn STT Nguồn phân lập Chủng phân lập AAB C at al a se O xyda se Vùng sáng (mm) Hình dạng
A G giờ 24 giờ 48 Khuẩn lạc Tế bào
1
Men rượu
B1 x + - 15 23 Không đều, mô,
nguyên, trắng đục Cầu kết chuỗi 2 MT x + - 11 20 Tròn, mô nguyên, trắng đục Cầu
3 Đ1 x + - 12 22 Không đều, gò,
nguyên, trắng đục Cầu 4 H1 x + - 17 25 Tròn, mô, nguyên, trắng đục Que 5 H2 x + - 20 29 Tròn, mô, nguyên, vàng nhạt Que ngắn
6 L6.2 x + - 19 26 Tròn, gò, nguyên, trắng Cầu 7 T2 x + - 12 23 Tròn, mô, nguyên, trắng đục Cầu kết chuỗi 8 Men cơm rượu
CA2 + - 15 20 Không đều, gò,
nguyên, trắng đục
Cầu kết chuỗi
9 CB x + - 25 32 Tròn, mô, răng cưa,
vàng nhạt Que 10 C2.2 x + - 18 25 Tròn, mô, nguyên, trắng đục Cầu
11 C3.1 x + - 19 29 Tròn, mô, nguyên,
trắng đục Que 12 CN x + - 39 46 Tròn, mô, nguyên, vàng nhạt Que 13 CS x + - 14 20 Tròn, gò, nguyên, trắng đục
Cầu kết chuỗi
14 CT1 x + - 16 22 Không đều, mô,
nguyên, trắng đục Que ngắn 15 CV1 x + - 18 26 Tròn, mô, nguyên, trắng đục Cầu
Bảng 4 cho thấy các chủng vi khuẩn có hình dạng khuẩn lạc đa số có dạng hình tròn, số ít không đều, bìa nguyên. Hình dạng tế bào: hình cầu, hình que, kết chuỗi. Có đặc tính catalase dương tính, oxydase âm tính. Các chủng vi khuẩn làm xuất hiện vòng sáng màu vàng xung quanh khuẩn lạc thể hiện khả năng sinh acid, kết quả sơ tuyển được 15 chủng vi khuẩn có vùng sáng màu vàng có đường kính từ 20 mm trở lên sau 48 giờ ủ ở 30oC được đánh giá là những vi khuẩn có khả năng sinh acid mạnh.
4.4. Khảo sát khả năng phát triển ở các nồng độ acid acetic khác nhau
Cấy 15 chủng AAB đã sơ tuyển ở thí nghiệm 4.3 vào môi trường YPGD (2% agar) bổ sung acid acetic ở các nồng độ ban đầu khác nhau: 0,5%, 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5% và 3%. Sau đó đem ủ ở 30oC.
Hình 9: Thử khả năng phát triển của các chủng AAB ở các nồng độ acid acetic khác nhau (0,5%, 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5% và 3,0%)
Theo dõi và quan sát sự phát triển của 15 chủng AAB được tuyển chọn trên đĩa petri ủ ở 6 nồng độ acid khác nhau: 0,5%, 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5% và 3,0% trong 48- 72 giờ. Kết quả thể hiện ở Bảng 5.
Bảng 5: Kết quả thử nghiệm khả năng phát triển ở các nồng độ acid acetic khác nhau của 15 chủng AAB
Chủng 48 giờ 72 giờ 0,5% 1,0% 1,5% 2,0% 2,5% 3,0% 0,5% 1,0% 1,5% 2,0% 2,5% 3,0% B1 + + - - - - + + - - - - MT + + - - - - + + - - - - Đ1 + - - - - - + - - - - - H1 + + - - - - + + - - - - H2 + + + + - - + + + + - - L6.2 + + + - - - + + + - - - T2 ++ ++ - - - - ++ ++ - - - - CA2 ++ ++ - - - - ++ ++ - - - - CB ++ ++ ++ ++ - - ++ ++ ++ ++ - - C2.2 + + + + - - + + + + - - C3.1 + - - - - - + - - - - - CN ++ ++ ++ ++ + + ++ ++ ++ ++ + + CS + + - - - - + + - - - - CT1 + + + - - - + + + - - - CV1 ++ + - - - - ++ + - - - -
*Ghi chú: (-) không phát triển, (+) phát triển, (++) phát triển mạnh.
Kết quả cho thấy tất cả 15 chủng AAB đều phát triển ở 0,5% acid acetic, phát triển kém hoặc không phát triển ở các nồng độ acid cao hơn. Chủng CN có thể phát triển ở nồng độ acid 3%. Ba chủng CB, H2 và C2.2 có khả năng phát triển ở 2,0% acid acetic. Hai chủng CT1 và L6.2 phát triển được ở nồng độ acid 1,5%. Các chủng B1, MT, H1, T2, CA2, CS và CV1 phát triển ở nồng độ acid 1,0%. Các chủng còn lại chỉ phát triển ở nồng độ 0,5%. Qua đó thấy được khả năng phát triển ở các nồng độ acid cao của các chủng CN, CB, H2, C2.2, L6.2 và CT1.
4.5. Khảo sát khả năng chịu nhiệt của vi khuẩn acid acetic
Cấy 15 chủng AAB đã sơ tuyển ở thí nghiệm 4.3 vào môi trường YPGD (2% agar) bổ sung 4% ethanol. Đem ủ ở các nhiệt độ khác nhau: 30oC, 37oC, 39oC, 41oC, 43oC và 45oC.
Hình 10: Thử khả năng chịu nhiệt của các chủng AAB ở các nhiệt độ khác nhau (30oC, 37oC, 39oC, 41oC, 43oC và 45oC)
Quan sát sự phát triển của 15 chủng AAB được tuyển chọn trên đĩa petri ủ ở 6 nhiệt độ tăng dần 30oC, 37oC, 39oC, 41oC, 43oC và 45oC trong 48-72 giờ (Bảng 6).
Bảng 6: Kết quả thử nghiệm khả năng chịu nhiệt của 15 chủng AAB
Chủng 48 giờ 72 giờ 30oC 37oC 39oC 41oC 43oC 45oC 30oC 37oC 39oC 41oC 43oC 45oC B1 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ MT ++ ++ ++ ++ + + ++ ++ ++ ++ + + Đ1 ++ ++ ++ ++ ++ + ++ ++ ++ ++ ++ + H1 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ H2 ++ ++ + + + + ++ ++ + + + + L6.2 ++ ++ + + + + ++ ++ + + + + T2 ++ ++ ++ ++ ++ + ++ ++ ++ ++ ++ + CA2 ++ ++ ++ ++ + + ++ ++ ++ ++ + + CB ++ ++ + + + - ++ ++ + + + - C2.2 ++ ++ ++ ++ + - ++ ++ ++ ++ + - C3.1 ++ ++ ++ ++ ++ + ++ ++ ++ ++ ++ + CN ++ ++ + + + - ++ ++ + + + - CS ++ ++ ++ + + - ++ ++ ++ + + - CT1 ++ ++ ++ ++ + - ++ ++ ++ ++ + - CV1 ++ ++ + + + + ++ ++ + + + +
Kết quả khảo sát khả năng chịu nhiệt cho thấy đa số các chủng đều có thể phát triển ở nhiệt độ cao. Các chủng B1, MT, Đ1, H1, H2, L6.2, T2, CA2, C3.1 và CV1 phát triển ở 45oC trong đó hai chủng B1 và H1 phát triển mạnh hơn các chủng còn lại. Các chủng CB, C2.2, CN, CS và CT1 phát triển được ở 43oC.
4.6. Tuyển chọn chủng vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt có khả năng sinh acid mạnh mạnh
Từ kết quả thử nghiệm ở thí nghiệm 4.4 và 4.5, chọn ra được 6 chủng AAB (CN, CB, H2, C2.2, L6.2 và CT1) có khả năng chịu acid và chịu nhiệt tốt. Chủng CN phát triển ở nồng độ acid 3,0% và nhiệt độ 43oC, chủng H2 phát triển ở 2,0% acid acetic và nhiệt độ 45oC, hai chủng CB và C2.2 phát triển ở 2,0% acid acetic và nhiệt độ 43oC, hai chủng L6.2 và CT1 phát triển ở 1,5% acid acetic, chủng L6.2 phát triển ở 45oC và chủng CT1 phát triển ở 43oC.
Nuôi 6 chủng AAB trong ống nghiệm chứa 5 mL môi trường YPGD có bổ sung 10% dịch trích khoai tây trong 24 giờ, sau đó rút 1 mL cho vào môi trường YPGD lỏng có bổ sung 4% ethanol, ủ ở 30oC, 37oC, 38oC và 39oC, ủ lắc ở 150 vòng/phút.
Tiến hành theo dõi giá trị OD (550 nm) và theo dõi nồng độ acid trong 7 ngày.
Hình 12: Hàm lượng acid của 6 chủng AAB ở 30oC
Ở 30oC, tất cả 6 chủng vi khuẩn đều phát triển tương đối tốt nhưng không đồng đều (Hình 11), trong đó chủng khả năng sinh acid của chủng CN (5,56% (w/v)) mạnh vượt trội so với các chủng thử nghiệm còn lại (Hình 12).
Hình 13: Sự phát triển của 6 chủng AAB ở 37oC
Kết quả Hình 13 cho thấy ở 37oC, tất cả các chủng vi khuẩn đều phát triển tốt, điều này cho thấy khả năng chịu nhiệt của tất cả các chủng AAB rất tốt. Tuy nhiên, kết quả Hình 14 thể hiện chỉ một số chủng vi khuẩn có khả năng sinh acid mạnh ở 37oC. Khả năng sinh acid của chủng CN vẫn mạnh hơn. Trong ngày lên men thứ 6, hàm lượng acid của chủng CN đạt 3,28% (w/v), chủng CB đạt 2,8% (w/v), chủng CT1 đạt
1,72% (w/v), chủng H2 đạt 1,96% (w/v). Hai chủng còn lại là C2.2 và L6.2, do ảnh hưởng của nhiệt độ nên hàm lượng acid sinh ra rất thấp, chỉ đạt 0,28% (w/v).
Hình 14: Hàm lượng acid của 6 chủng AAB ở 37oC
Do khả năng sinh acid của hai chủng C2.2 và L6.2 rất kém nên chỉ khảo sát sự lên men của 4 chủng CN, CB, CT1 và H2 ở 38oC và 39oC.
Hình 16: Hàm lượng acid của 4 chủng AAB ở 38oC
Ở 38oC, sự phát triển của các chủng vi khuẩn tốt (Hình 15), tuy nhiên mật độ vi khuẩn và hàm lượng acid sinh ra ở các chủng giảm so với ở 30oC và 37oC. Ở ngày lên men thứ 6, chủng CN đạt 3,16% (w/v), chủng CB đạt 3,08% (w/v), chủng CT1 đạt 0,84% (w/v), chủng H2 đạt 1,48% (w/v) (Hình 16). Kết quả cho thấy sự ảnh hưởng về khả năng sinh acid của các chủng AAB khi tăng nhiệt độ.
Hình 18: Hàm lượng acid của 4 chủng AAB ở 39oC
Ở 39oC, khả năng phát triển và khả năng sinh acid của các chủng đều giảm, ở ngày lên men thứ 6 hàm lượng acid của chủng CN đạt 3,12% (w/v) và chủng CB đạt 3,04% (w/v), chủng CT1 đạt 0,76% (w/v), chủng H2 đạt 1,4% (w/v) (Hình 18). Những giá trị cao nhất đều giảm so với ở 30oC, 37oC và 38oC, chứng tỏ ở nhiệt độ cao, khả năng phát triển và khả năng sinh acid của các chủng AAB đều bị ảnh hưởng.
Kết quả thí nghiệm này cho thấy khả năng phát triển và khả năng sinh acid của 6 chủng AAB. Từ đó tuyển chọn được 2 chủng CN và CB có khả năng sinh acid mạnh ở nhiệt độ cao.
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận
- Phân lập được 30 chủng vi khuẩn acid acetic từ 14 mẫu men rượu và men cơm rượu từ 11 tỉnh, thành phố khác nhau.
- Phân loại thông qua khả năng oxy hóa acetate tạo CO2 và H2O cho thấy có 25 chủng thuộc giống Acetobacter và 5 chủng thuộc giống Gluconobacter.
- Sơ tuyển được 15 chủng B1, MT, DD1, H1, H2, L6.2, T2, CA2, CB, C2.2, C3.2, CN, CS, CT1 và CV1 có đường kính vùng sáng (thể hiện khả năng sinh acid) trong khoảng 20-46 mm trong 48 giờ ủ ở 30oC.
- Chủng CN có khả năng phát triển ở nồng độ acid 3,0%, các chủng CB, H2, C2.2 có khả năng phát triển ở nồng độ acid 2,0%, hai chủng CT1 và L6.2 có khả năng phát triển ở nồng độ acid 1,5%, các chủng còn lại chỉ phát triển ở nồng độ acid 1,0%.
- Tất cả các chủng đều phát triển ở nhiệt độ cao từ 43oC và 45oC, các chủng B1, MT, Đ1, H1, H2, L6.2, T2, CA2, C3.1 và CV1 phát triển đến 45oC, trong đó 2 chủng B1 và H1 phát triển mạnh ở 45oC, các chủng CB, C2.2, CN, CS và CT1 phát triển