nghiên cứu chế tạo kháng thể lòng đỏ trứng gà kháng đặc hiệu f4 pili của escherichia coli để phòng và trị bệnh tiêu chảy ở lợn sau cai sữa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ------ NGUYỄN THỊ HỒNG THẮM NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO KHÁNG THỂ LÒNG ðỎ TRỨNG GÀ KHÁNG ðẶC HIỆU F4 PILI CỦA ESCHERICHIA COLI ðỂ PHÒN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-
-

NGUYỄN THỊ HỒNG THẮM

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO KHÁNG THỂ LÒNG ðỎ TRỨNG GÀ

KHÁNG ðẶC HIỆU F4 PILI CỦA ESCHERICHIA COLI

ðỂ PHÒNG VÀ TRỊ BỆNH TIÊU CHẢY Ở LỢN SAU CAI SỮA

Lời cam ñoan

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu và kết quả thể hiện trong luận văn này là trung thực và chưa từng ñược ai sử dụng ñể bảo vệ bất cứ học vị nào

Tôi cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Hồng Thắm

LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này ngoài sự cố gắng và nỗ lực của bản thân, tôi ñã nhận ñược nhiều sự giúp ñỡ của các cá nhân và tập thể Nhân dịp này cho phép tôi ñược bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới:

Thầy giáo PGS.TS Nguyễn Hữu Nam, TS Nguyễn Viết Không ñã cung cấp những kiến thức chuyên môn bổ ích và dẫn dắt tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và viết luận văn

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới cán bộ, nhân viên - Bộ môn Hoá Sinh, Miễn dịch, Bệnh lý, Viện Thú y ñã tạo ñiều kiện, chỉ bảo và giúp ñỡ tôi trong thời gian học tập, nghiên cứu tại bộ môn

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô trong bộ môn Bệnh lý, Khoa Thú Y- Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội - ñã dạy dỗ, giúp ñỡ và ñộng viên tôi trong suốt thời gian qua

Tôi xin cảm ơn tới cán bộ, công nhân viên trong trại lợn Cầu Diễn ñã hết sức nhiệt tình giúp ñỡ tôi trong thời gian thực hiện thí nghiệm tại trại Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn ñến gia ñình, bạn bè, những người ñã tạo mọi ñiều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn này

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Hồng Thắm

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục các chữ tắt và ký hiệu v

Danh mục các bảng vi

Danh mục các hình vii

1 MỞ ðẦU 1

2 TỔNG QUAN 3

2.1 Vi khuẩn E.coli 3

2.1.1 ðặc điểm hình thái 3

2.1.2 ðặc tính nuơi cấy, sinh hĩa 4

2.1.3 Kháng nguyên và type huyết thanh 5

2.2 Yếu tố độc lực 8

2.2.1 Yếu tố gây bệnh của ETEC 8

2.2.2 Yếu tố bám dính (Adhesion) 9

2.2.3 ðộc tố đường ruột 10

2.2.4 Yếu tố độc lực khác 12

2.3 Bệnh do E.coli gây ra ở lợn con theo mẹ 14

2.4 Bệnh tiêu chảy do E.coli ở lợn sau cai sữa 15

2.4.1 Các chủng gây bệnh 15

2.4.2 Yếu tố độc lực 15

2.4.3 Sinh bệnh học 16

2.4.4 Triệu chứng 16

2.4.5 Bệnh tích 17

2.4.6 Chẩn đốn 17

2.5 Bệnh phù đầu ở lợn con 18

2.6 Nhữngnghiên cứu về chế phẩm phịng và điều trị E.coli 19

2.6.1 Văc xin phịng bệnh lợn con tiêu chảy do E.coli 19

2.6.2 Chế phẩm lịng đỏ trứng trong phịngtrị lợn con tiêu chảy 19

2.7 Nghiên cứu trong nước về phịng trị bệnh do E.coli ở lợn 20

2.7.1 Văc xin 20

2.7.2 Kháng sinh và chế phẩm sinh học thay thế 21

2.7.3 Kháng thể lịng đỏ trứng 22

3 PHẦN III NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.1 ðối tượng và nội dung nghiên cứu 23

3.2 ðịa điểm và thời gian nghiên cứu 23

3.3 Nguyên vật liệu 24

3.3.1 ðộng vật thí nghiệm và sinh phẩm 24

3.3.2 Mơi trường, hĩa chất 24

3.3.3 Máy mĩc, trang thiết bị 25

3.4 Phương pháp nghiên cứu 26

3.4.1 Phương pháp phân lập và giám ựịnh vi khuẩn E.coli 26

3.4.2 Phương pháp PCR xác ựịnh chủng F4 E.coli 27

3.4.3 Phương pháp gây miễn dịch cho gà 29

3.4.4 Chế tạo bột kháng thể lòng ựỏ bằng công nghệ phun sấy khô 31

3.4.5 Phương pháp phối trộn chế phẩm kháng thể lòng ựỏ trứng 32

3.4.6 Phương pháp ELISA kháng thể (Ab-ELISA) 32

3.4.7 Bố trắ thắ nghiệm phân tắch kháng thể F4 pili ở lợn con 37

3.4.8 Bố trắ thắ nghiệm phân tắch kháng thể F4 pili ở gà miễn dịch 38

3.4.9 Phương pháp xác ựịnh liều ựiều trị 41

3.4.10 Phương pháp ựiều trị và theo dõi lợn ựiều trị 42

4 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44

4.1 Nghiên cứu chế tạo kháng thể lòng ựỏ trứng kháng F4-Pili 44

4.1.1 Kết quả gây miễn dịch cho gà, thu thập mẫu huyết thanh và trứng 44 4.1.2 đáp ứng miễn dịch ở gà gây miễn dịch bằng 3 quy trình khác nhau 46 4.1.3 Tương quan hiệu giá kháng thể kháng pili ở huyết thanh và trứng 47 4.1.4 Biến ựộng kháng thể ở huyết thanh và lòng ựỏ trứng gà lô 2 và 3 48 4.2 Nghiên cứu chế tạo chế phẩm lòng ựỏ trứng 50

4.2.1 Chế tạo bột trứng phun sấy khô 50

4.2.2 Phối chế chế phẩm bột lòng ựỏ trứng KT04 50

4.3 Kết quả xác ựịnh liều ựiều trị 53

4.3.1 Xác ựịnh lợn con tiêu chảy do E.coli F4 53

4.3.2 Kết quả xác ựịnh biến ựộng hiệu giá kháng thể ở lợn con 54

4.3.3 Kết quả xác ựịnh liều ựiều trị lành bệnh 50% 56

4.3.4 Kết quả xác ựịnh liều ựiều trị 57

4.3.5 Kết quả kiểm chứng liều ựiều trị 58

4.3.6 đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm ựến tăng trọng 59

4.4 Kết quả ứng dụng chế phẩm trong phòng trị lợn con tiêu chảy 60

4.4.1 Kết quả ựiều trị lợn con tiêu chảy sau cai sữa 60

4.4.2 điều trị dự phòng 61

5 KẾT LUẬN VÀ đỀ NGHỊ 63

5.1 Kết luận 63

5.2 Kiến nghị 63

6 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

6.1 Tiếng Việt 64

6.2 Tiếng Anh 67

DANH MỤC CÁC CHỮ TẮT VÀ KÝ HIỆU

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 03-01 Sơ ñồ phân lập và giám ñịnh vi khuẩn E.coli 27 Hình 04-01 Kết quả ELISA của gà ñược gây miễn dịch bằng 3 quy trình 46 Hình 04-02 Kết quả chuẩn ñộ huyết thanh và trứng các lô gà thí nghiệm 47 Hình 04-03 Biến ñộng hiệu giá kháng thể ở huyết thanh và lòng ñỏ trứng

gà ñược gây miễn dịch bằng quy trình 02

49

Hình 04-04 Kết quả chuẩn ñộ lòng ñỏ trứng sau sấy khô và chế phẩm 51 Hình 04-05 Kết quả chuẩn ñộ kháng thể ở chế phẩm KT04 52 Hình 04-06 Kết quả PCR xác ñịnh các yếu tố ñộc lực của F4 E.coli 54 Hình 04-07 Tỷ lệ dương tính huyết thanh học pili F4 ở lợn con 55

1 MỞ đẦU

Theo thống kê của Tổ chức Nông lương Thế giới (FAO), Việt Nam là quốc gia có số ựầu lợn nhiều nhất ở khu vực đông Nam châu Á với tổng ựàn lợn là 26,9 triệu năm 2006 Trong những năm gần ựây, ngành chăn nuôi lợn Việt Nam phát triển mạnh mẽ, dự kiến tổng ựàn ựạt 35 triệu con vào năm

2020 (Cục Chăn nuôi), ựóng góp 42% tỷ trọng chăn nuôi trong nông nghiệp Tiêu chảy lợn con là hội chứng ựa nguyên nhân như thức ăn kém chất lượng, ngoại cảnh thay ựổi, và các vi sinh vật gây bệnh Các loại vi khuẩn chủ

yếu gây tiêu chảy ở lợn con bao gồm: Escherichia Coli (E.coli), Salmonella

và Clostridium perfringens, trong ựó E.coli là phổ biến nhất Bệnh tiêu chảy

do E.coli ựã có từ lâu và hiện vẫn là bệnh phổ biến gây chết lợn con và làm

giảm tăng trọng, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi lợn

Vi khuẩn E.coli gây bệnh chủ yếu ở lợn con ngay sau cai sữa, thời ựiểm

kháng thể thụ ựộng còn lại ở mức rất thấp và chưa có kháng thể chủ ựộng tuy

lợn con ựã tiếp xúc với mầm bệnh E.coli gây bệnh có 2 yếu tố ựộc lực quan

trọng là yếu tố bám dắnh ở ựầu pili và ựộc tố; yếu tố bám dắnh giúp căn bệnh bám vào thụ thể ở niêm mạc ựường ruột, vi khuẩn tăng sinh và sản sinh ựộc tố gây bệnh

Có 2 thể bệnh E.coli chắnh ở lợn, (1) bệnh phù ựầu do các E.coli có pili

F18, sản sinh ựộc tố vero (VT) gây bệnh phù ựầu, và (2) Bệnh tiêu chảy do

các E.coli có kháng nguyên bám dắnh pili F4, sản sinh các ựộc tố ựường ruột

chịu nhiệt (ST) và không chịu nhiệt (LT) gây tiêu chảy ở lợn con ngay sau cai

sữa Các chủng E.coli F5, F6 và F18cd ựôi khi cũng gây bệnh ựường ruột ở

lợn con

Mỗi tế bào E.coli ựược phủ bởi lớp lông khoảng 3.000 ựơn vị pili, chúng

thường xuyên thải pili ở nguyên dạng, có ựủ kháng nguyên tắnh gây miễn dịch

ở lợn Vắc xin vô hoạt không có tác dụng do vi khuẩn chết không thải pili Trong phòng thí nghiệm, có thể chiết tách pili bằng cách làm lỏng kết cấu màng của vi khuẩn như làm giảm áp lực thẩm thấu, shock nhiệt

Gây miễn dịch cho gà, chế tạo kháng thể lòng ñỏ trứng ñã trở thành một phương pháp phổ biến chế tạo sinh phẩm ñiều trị (kháng thể dị loài) Các sinh phẩm kháng thể lòng ñỏ trứng dùng trong ñiều trị lợn con tiêu chảy ở Việt Nam hiện nay (nội ñịa và ngoại nhập) có tỷ lệ kháng thể ñặc hiệu kháng pili thấp do nguồn kháng nguyên gây miễn dịch là toàn khuẩn Gây miễn dịch gà

bằng pili tinh chế từ chủng E.coli gây bệnh ở Việt Nam sẽ có 2 ưu thế: (1)

nâng cao tỷ lệ kháng thể ñặc hiệu kháng pili và (2) sự phù hợp chủng gây bệnh hiện ñang lưu hành (vốn không biết ở sản phẩm nhập ngoại)

Xuất phát từ những yêu cầu thực tiễn của sản xuất, cập nhật các công nghệ tiên tiến, nhằm sản xuất chế phẩm sinh học phù hợp nhất trong phòng và

trị bệnh tiêu chảy ở lợn con do E.coli, chúng tôi tiến hành ñề tài:

“Nghiên cứu chế tạo kháng thể lòng ñỏ trứng gà kháng ñặc hiệu F4 pili

của Escherichia coli ñể phòng và trị bệnh tiêu chảy ở lợn sau cai sữa” Mục tiêu của ñề tài là:

Sản xuất ñược kháng thể khác loài sử dụng kháng nguyên F4 pili của

E.coli, ứng dụng trong ñiều trị và ñiều trị dự phòng bệnh tiêu chảy do E.coli ở

lợn con sau cai sữa

2 TỔNG QUAN

2.1 Vi khuẩn E.coli

Vi khuẩn Escherichia coli lần ñầu tiên ñược Theodor Escherich - bác sĩ

nhi khoa người ðức (1857-1911) phân lập và mô tả vào năm 1885 từ phân trẻ

em với tên gọi Bacterium coli commune, một loại vi khuẩn vô hại sống trong

ruột già người và ñộng vật [28], 4 năm sau vi khuẩn này ñược ñổi tên thành Escherich nhằm tri ân người phát hiện Lịch sử bệnh ñã trải qua nhiều tên gọi khác nhau, nhưng từ 1991, Hội ñồng Danh pháp Quốc tế ñã thống nhất gọi tên

vi khuẩn này là Escherichia coli (E.coli)

Trong ñiều kiện bình thường E.coli chỉ khu trú ở trực tràng, ít khi có

trong dạ dày hay ruột non, khi ñiều kiện ngoại cảnh bất lợi, sức ñề kháng của

con vật giảm, E.coli bội nhiễm và gây bệnh [29]

Từ phát hiện ñầu tiên năm 1955 của Schoield và Davis về E.coli gây bệnh

tiêu chảy ở lợn con, càng ngày người ta càng thấy vai trò quan trọng của

E.coli trong ngành chăn nuôi lợn [33]

2.1.1 ðặc ñiểm hình thái

E coli thuộc họ Enterobacteriaceae, là loại trực khuẩn hình gậy ngắn, hai

ñầu tròn, kích thước 2-3 x 0,4-0,6 µm Vi khuẩn bắt màu Gram âm, thường thẫm ở hai ñầu, ở giữa bắt màu nhạt, không hình thành bào tử Trong cơ thể

có hình cầu trực khuẩn, ñứng riêng lẻ ñôi khi xếp thành chuỗi ngắn Phần lớn

E.coli di ñộng do có lông xung quanh thân, một số chủng không di ñộng E.coli có sức ñề kháng kém với nhiệt ñộ, vi khuẩn bị diệt ở 55OC trong vòng 1 giờ, 60OC trong vòng 15-30 phút, ñun sôi 100OC chết ngay Ở môi

trường bên ngoài, các chủng E.coli có thể tồn tại ñược ñến 4 tháng Các hoá

chất sát trùng thông thường: Acid Phenic, Formol, Hydroperoxit 0,1% diệt vi khuẩn sau 5 phút

2.1.2 ðặc tính nuôi cấy, sinh hóa

E.coli là trực khuẩn hiếu-yếm khí tuỳ tiện, dễ dàng trên môi trường nuôi

cấy thông thường Vi khuẩn có thể phát triển ở nhiệt ñộ 5-40OC, thích hợp nhất là 37OC, và ở pH từ 5,5-8,0, pH thích hợp nhất là 7,2-7,4 Sau 24 giờ nuôi cấy ở 37 OC, E.coli phát triển ở các môi trường thông thường với các ñặc

ñiểm như sau:

- Môi trường nước thịt: Phát triển tốt, ñục, có cặn màu tro nhạt, ñôi khi có màu xám nhạt trên mặt môi trường, môi trường có mùi thối

- Môi trường thạch thường: Khuẩn lạc ñường kính 2-3 mm, tròn, hơi lồi,

ướt, bóng láng không trong suốt, màu tro nhạt Khuẩn lạc E.coli to hơn nhưng không trắng bằng khuẩn lạc của Salmonella

- Môi trường thạch máu: khuẩn lạc màu sáng, có thể gây dung huyết

- Môi trường MacConkey: Khuẩn lạc màu ñỏ cánh sen

- Môi trường Endo: Khuẩn lạc màu ánh kim

- Môi trường thạch Brilliant Green: Khuẩn lạc màu vàng chanh

- Môi trường Eosin Methyl Blue: Khuẩn lạc màu tím ñen

ðặc tính sinh hóa: E.coli trong phân thường ñược phân lập trên môi

trường MacConkey hoặc thạch Eosin Methyl Blue ở 370C trong ñiều kiện

hiếu khí, môi trường chọn lọc những chủng thuộc họ Enterobacteriaceae E.coli ñược phân biệt dựa vào các ñặc tính sinh hoá trên môi trường 3 ống nghiệm sau 24 giờ nuôi cấy ở 37OC:

Môi trường KIA (Kligler Iron Agar) cho phép ñọc 4 tính chất:

- Khả năng lên men ñường Glucose (+), làm phần thạch ñứng chuyển từ màu hồng sang màu vàng,

- Khả năng lên men ñường Lactose (+), làm phần thạch nghiêng chuyển

từ màu hồng sang màu vàng

- Khả năng sinh hơi (+), làm phần thạch ñứng bị nứt hoặc tạo thành bọt khí bên trong hoặc có thể ñẩy toàn bộ khối thạch lên cao và ở dưới là hơi,

- Khả năng sinh H2S (-): Vi khuẩn E.coli không có khả năng sinh hơi H2S nên phần thạch ñứng không có màu ñen

Môi trường Mannitol-Mobility cho phép ñọc 2 tính chất:

- Khả năng lên men ñường Mannite (+), làm môi trường chuyển từ màu hồng sang màu vàng

- Khả năng di ñộng (+), làm ñục ñều môi trường (chủng không có khả năng di ñộng chỉ có một ñường cấy vi khuẩn, toàn bộ môi trường vẫn trong)

Môi trường Urea-Indol cho phép ñọc 2 tính chất:

- Khả năng sinh ureaza (-): Vi khuẩn E.coli không có khả năng sinh

ureaza nên không làm biến ñổi màu môi trường

- Khả năng sinh Indol (+), tạo thành một vòng màu ñỏ thẫm khi nhỏ thuốc thử Kowacs vào canh khuẩn

2.1.3 Kháng nguyên và type huyết thanh

Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn E.coli rất phức tạp Kaufman (1994)

ñã dựa vào kháng thể ñặc hiệu (hay type huyết thanh) phân ra các loại kháng nguyên như kháng nguyên O (somatic), kháng nguyên H (flagellar) và kháng nguyên K (capsular) mà nay ñổi tên là kháng nguyên F (Fimbriae) hay kháng nguyên pili Cho ñến nay, bằng phản ứng ngưng kết, các nhà khoa học ñã tìm ñược 250 quyết ñịnh kháng nguyên O, 56 quyết ñịnh kháng nguyên H và 89 quyết ñịnh kháng nguyên F

Kháng nguyên O (Somatic, kháng nguyên thân) [34, 41] ñược cấu thành

bởi các Lipopolysaccharide nằm ở lớp ngoài cùng màng tế bào vi khuẩn Lớp Polysaccharide ngoài cùng có tính ñặc trưng về serotype; lớp Polysaccharide bên trong, không mang kháng nguyên ñặc trưng nhưng khi thay ñổi làm cho

ñộc lực vi khuẩn và hình thái khuẩn lạc thay ñổi (dạng S sang dạng R) Kháng

nguyên O chịu nhiệt, bền với cồn và axit Kháng nguyên O thường ñược dùng

ñể xác ñịnh serotype của vi khuẩn E.coli bằng phản ứng ngưng kết Hiện có

trên 250 serotype O

Kháng nguyên H (flagella) [54]: Kháng nguyên H ñược cấu tạo bởi

thành phần của roi vi khuẩn, có bản chất protein, tạo nên khả năng di ñộng

của E.coli Kháng nguyên H kém chịu nhiệt cồn và axit yếu Các vi khuẩn di

ñộng khi tiếp xúc với kháng nguyên H tương ứng sẽ trở thành không di ñộng Hiện có 56 type kháng nguyên H, ñược ñánh số từ H1 ñến H56 Vi khuẩn có kháng nguyên H (có roi) là có khả năng di ñộng, tránh bị tiêu diệt bởi tế bào thực bào và làm tăng tiếp xúc với bề mặt tế bào vật chủ

Kháng nguyên K hay Kapsul ñược gọi lúc ñầu do chúng ñược phát hiện

bằng phản ứng ngưng kết toàn khuẩn, và giả sử kháng nguyên K là polisaccharide [30] Sau này khi biết bản chất của kháng nguyên K là protein,

do thành phần ở pili bao quanh bề mặt tế bào vi khuẩn quyết ñịnh, người ta ñổi tên thành kháng nguyên F (Fimbriae hay kháng nguyên Pili)

Thông thường các kháng nguyên K ngăn cản sự ngưng kết của vi khuẩn với kháng huyết thanh O Khi gia nhiệt, kháng nguyên K bị biến tính và mất tác dụng ngăn cản này Kháng nguyên K ñược chia thành 3 loại chính tùy vào khả năng chịu nhiệt: L (biến tính ở 100oC sau 1 giờ), B (100OC trong 1 giờ nhưng vẫn giữ ñược khả năng ngưng kết), và A (121OC sau 2,5 giờ, không bị mất tính kháng nguyên, vẫn giữ nguyên khả năng ngưng kết) [51]

Quan sát dưới kính hiển vi ñiện tử, yếu tố bám dính của các E.coli là các

sợi bám dính pili (fimbriae) bao gồm các ñơn vị cấu trúc nhỏ Sợi bám dính

có tính kháng nguyên, gọi là kháng nguyên bám dính hay kháng nguyên F Các kháng nguyên F có bản chất là protein, dài khoảng 0,5-3 µm, ñường kính 2,1- 7,0 nm, dạng thẳng hay xoắn Kháng nguyên pili giúp vi khuẩn bám dính

vào thụ thể ñặc hiệu (receptor) trên tế bào niêm mạc ruột nên rất quan trọng trong quá trình gây bệnh của vi khuẩn Kháng nguyên pili có thể ñược phân loại dựa theo sự khác biệt về hình thể, hoá học, chức năng và ñặc tính kháng nguyên (serotype F)

Các chủng Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) sinh ñộc tố ñường

ruột phân lập từ lợn mắc tiêu chảy có mang các kháng nguyên F4 (K88), F5 (K99), F41, F6 (987P) và F18 [64]

Kháng nguyên bám dính F4 (K88) [51]: K88 là loại kháng nguyên

không chịu nhiệt và bị phá huỷ ở nhiệt ñộ cao Nhưng ngược lại, ở nhiệt ñộ thấp (≤18oC) K88 cũng không ñược sản sinh [7] F4 là một protein dạng sợi, bao gồm một tiểu ñơn vị chính (FaeG), và nhiều tiểu ñơn vị phụ (FaeF, FaeH, FaeC, và có thể FaeI) Cấu tạo của F4 gồm 2 phần, phần không thay ñổi và phần thay ñổi (khác nhau giữa các chủng) Phần không thay ñổi của các chủng F4 là giống nhau (kháng nguyên tính F4a); phần thay ñổi chia thành 3 nhóm chính tuỳ thuộc vào tính ngưng kết ñặc hiệu: “b,c” (do Orskov và cs phân biệt năm 1964) và loại thứ 3 “d” do Guinee và Jansen phân loại năm

1979 Như vậy, hiện có 3 phân type F4 chính F4ab, F4ac, F4ad (3 serotype)

Kháng nguyên F5 (K99): F5 Protein ñược cấu tạo từ các tiểu ñơn vị

18.500 kDa có ñiểm ñẳng ñiện 9,5 [31], gene F5 nằm trên Plasmid [26] Kháng nguyên F5 là một yếu tố gây bệnh phổ biến, hay gặp ở các chủng ETEC gây tiêu chảy cho bê, nghé, dê, cừu non, ñôi khi ở lợn [48]

Kháng nguyên F6 (987P): Yếu tố bám dính của các F6 ETEC [59] gắn

vào thụ thể glycoprotein [43] ở tế bào thành ruột F6 có cấu trúc chuỗi xoắn

ñược tạo thành từ 3 tiểu protein, một tiểu ñơn vị FasA ở ñỉnh nối với các tiểu ñơn vị của FasF và FasG làm thành sợi pili

Kháng nguyên F41: Giống như kháng nguyên bám dính F5 nhưng có

trọng lượng phân tử lớn hơn Gene mã hóa cho F41 nằm ở Genome

Kháng nguyên bám dính F18: Trước kia gọi là F107 bao gồm 2 biến thể

F18ab và F18ac Những chủng mang yếu tố bám dính F18ab thường sản xuất ñộc tố VT2e và gây bệnh phù ñầu, F18ac thường sản xuất ñộc tố ñường ruột

và gây bệnh tiêu chảy Giữa F18ab và F18ac có miễn dịch bảo hộ chéo

Những dòng E.coli có mang yếu tố F18 bám lên tế bào biểu mô ruột ở lợn

con sau cai sữa, nhưng lại không thể bám lên tế bào biểu mô ruột ở lợn con sơ sinh do lợn sơ sinh chưa có các receptor của F18ab và F18ac; có thể ñây là lý

do vì sao chỉ thấy các chủng Verotoxigenic Escherichia Coli (VTEC) và

ETEC ở lợn cai sữa

2.2 Yếu tố ñộc lực

2.2.1 Yếu tố gây bệnh của ETEC

Các chủng vi khuẩn thuộc nhóm Enterotoxigenic E.coli (ETEC) tham gia

vào quá trình gây bệnh nhờ hai ñặc tính chủ yếu: (1) Khả năng bám dính vào các tế bào biểu mô ruột nhờ các yếu tố bám dính ở bề mặt vi khuẩn (Fimbriae) như F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P), F41, F17 và F18ac; và (2) Khả năng sản sinh một hoặc nhiều loại ñộc tố ñường ruột, bao gồm ñộc tố không chịu nhiệt (LTI và LTII) và ñộc tố chịu nhiệt (STI và STII) [36] Vì

vậy, ñể xác ñịnh một chủng vi khuẩn E.coli có ñộc lực và có trong quá trình

gây bệnh tiêu chảy của lợn, vấn ñề cần thiết là phải xác ñịnh ñược chúng có mang cả hai yếu tố gây bệnh trên

Bám dính là quá trình kết hợp giữa cấu trúc tương ñồng của các kháng

nguyên bề mặt vi khuẩn với các ñiểm nhận trên tế bào Hiện tượng bám dính của vi khuẩn lên bề mặt tế bào vừa mang tính chất lý hoá học, vừa mang tính chất sinh học và ñược thực hiện theo 3 bước:

+ Bước 1: Vi khuẩn liên kết từng phần với bề mặt tế bào, quá trình này ñòi hỏi vi khuẩn phải có khả năng di ñộng

+ Bước 2: Quá trình hấp phụ: phụ thuộc ñặc tính của vi khuẩn và tế bào

mà vi khuẩn bám dính, tương tác bám dính là phản ứng thuận nghịch

+ Bước 3: Là quá trình tác ñộng: ảnh hưởng tương tác giữa yếu tố bám dính của vi khuẩn tại các ñiểm tiếp nhận trên bề mặt tế bào vật chủ

Hai quá trình trước thực hiện nhờ các tác ñộng vật lí và hoá học, quá trình thứ 3 ñược liên kết ñặc hiệu giữa kháng nguyên tại yếu tố bám dính (pili) với receptor tương ứng trên bề mặt của các tế bào biểu mô

2.2.2 Yếu tố bám dính (Adhesion)

ðây là yếu tố có vai trò ñặc biệt quan trọng giúp vi khuẩn thực hiện bước ñầu tiên của quá trình gây bệnh [59], là tiêu chuẩn ñể phân biệt vi khuẩn gây bệnh và vi khuẩn thường trực ñường tiêu hoá không gây bệnh [21] Nhờ có

yếu tố bám dính, E.coli cố ñịnh ñược vào các tế bào biểu mô của niêm mạc

ruột, không bị rửa trôi theo phân

Các chủng ETEC sản sinh K88 là một trong những nguyên nhân quan trọng gây tiêu chảy ở lợn con sau cai sữa và lợn con theo mẹ [7] Tỷ lệ ngưng

kết kháng nguyên K88 của các chủng E.coli phân lập từ lợn con tiêu chảy có

thể ñến 93,33%, cao hơn chủng từ lợn con không tiêu chảy (33,33%) [17]

Các thụ thể bcd tương ứng cho các F4 pili là tập hợp các glycoprotein có

khối lượng phân tử từ 45- 70 kDa, thụ thể bc là sự kết hợp của 2 glycoprotein với khối lượng phân tử tương ứng là 210 và 240 kDa, thụ thể b là một glycoprotein có khối lượng phân tử là 74 kDa, và thụ thể d là glycophingolipid, vẫn chưa biết khối lượng phân tử [63]

Kháng nguyên K88 ñảm nhiệm chức năng bám dính của vi khuẩn vào phần trên của ruột non Trong phòng thí nghiệm có thể lựa chọn khả năng bám dính cao dựa vào test kháng nguyên bám tế bào nhung mao ruột lợn và tế bào phôi gà [22]

2.2.3 ðộc tố ñường ruột

ðộc tố ñường ruột: Có hai loại ñộc tố là thành phần chính của

Enterotoxin ñược tìm thấy ở các vi khuẩn E.coli gây bệnh tiêu chảy, khác

nhau ở khả năng chịu nhiệt: ðộc tố chịu nhiệt (Heat Stable Toxin – ST) không

bị biến tính ở nhiệt ñộ 100OC trong 15 phút, ñộc tố không chịu nhiệt (Heat Labile Toxin – LT) bị vô hoạt ở 60OC trong 15 phút Gene mã hóa cho LT và

ST nằm trên Plasmid ETEC có thể ñồng thời sản sinh 2 loại ñộc tố hoặc chỉ 1 loại, ở người thường là ST [61]

Nhóm ñộc tố ñường ruột tác ñộng vào chu trình Adenylat làm thay ñổi quy trình trao ñổi muối-nước ở ruột gây tiêu chảy Cả hai loại ñộc tố này ñều không gây ra những biến ñổi bệnh tích hoặc sự thay ñổi về mặt hình thái của lớp niêm mạc ruột non, chỉ có tác ñộng gây ra những biến ñổi mạnh, làm gia tăng quá trình thẩm xuất H2O, Na+ và Cl-, gây giảm sự hấp thu nước và các chất dinh dưỡng Kết quả là cơ thể bị mất nước, mất muối NaHCO3, con vật rơi vào tình trạng bị nhiễm ñộc và suy kiệt

- ðộc tố không chịu nhiệt LT: ðộc tố LT của E.coli có bản chất protein

[37], có khối lượng phân tử lớn, bị vô hoạt ở 60OC trong 15 phút [50] ðộc tố

LT chỉ tìm thấy ở các chủng ETEC gây bệnh cho người và lợn nhưng lại không phân lập ñược từ ETEC gây bệnh cho bò [26]

ðộc tố LT, gồm 2 phân lớp LT-I và LT-II, không có phản ứng chéo LT tác ñộng bằng cách kích hoạt enzyme adenylate cyclase gây tăng cường chu trình adenosine monophosphate (cAMP) Sự hoạt ñộng quá ngưỡng của cAMP trong tế bào dẫn ñến sự gia tăng thẩm xuất Cl-, Na+, HCO- và nước vào trong lòng ruột Cơ thể mất nước trầm trọng, các quá trình trao ñổi chất bị ngừng trệ, con vật bị trúng ñộc do acid nội sinh

+ LT-I có hai phân lớp LTp (LTp-I) tìm thấy ở E.coli lợn và LTh (LTh-I,

người) có quan hệ gần gần gũi và có thể phản ứng chéo [50]

+ LT-II: ðược tìm thấy chủ yếu ở E.coli trên ñộng vật và hiếm khi ở

người, LT-II có một số ñặc tính sinh học tương tự ñộc tố CT và LT-I, nhưng không bị trung hoà bằng giải ñộc tố của Vibrio cholerae hoặc LT-I [40]

- ðộc tố chịu nhiệt: ST có trọng lượng phân tử nhỏ và những cầu nối

disulfit ST ñược chia thành 2 nhóm là STa và STb, khác nhau về cấu trúc và

cơ chế hoạt ñộng Gen mã hoá cho cả 2 nhóm chủ yếu trên plasmid và vài gen

mã hoá ST ñược tìm thấy trên transposon STa (hay ST-I) ñược sản sinh bởi ETEC Protein STa có khoảng 50% giống với EAST1 của EAEC Một số chủng ETEC cũng sản sinh ñộc tố EAST1 ngoài ñộc tố Sta [56] Còn STb chỉ ñược tìm thấy trong ETEC

STa: là một peptide gồm 18-19 amino acid với trọng lượng phân tử

khoảng 2 kDa STa ñược chia thành 2 lớp gọi là STp (ñộc tố ST ở lợn hay STIa) và STh (ñộc tố ST ở người hay STIb) Thụ thể chính của STa là enzyme xuyên màng guanylate cyclase C (GC-C) thuộc họ những enzyme receptor cyclase [62] Sự kết hợp của STa vào GC-C kích thích hoạt tính GC, gia tăng lượng cGMP nội bào [58] kích thích tiết Cl- và/hoặc ngăn cản sự hấp thu NaCl, gây ra sự tiết chất lỏng trong ruột

STb: STb chủ yếu thấy ở các chủng ETEC từ lợn, hiếm thấy ở các chủng ETEC gây bệnh trên người Tiền STb protein có 71 amino acid, chuyển hoá thành protein hoàn chỉnh gồm 48 amino acid với trọng lượng phân tử khoảng 5,1 kDa [27] Trình tự STb không tương ñồng với trình tự STa, mặc dù nó cũng có 4 Cysteine nối với nhau bằng cầu nối disulfit [27] ðộc tố này bị phá huỷ ở 100OC trong vòng 15 phút Mặt khác, STb khá mẫn cảm và bị vô hoạt bởi proteaza hay Trypsin, bị bất hoạt sau 60 phút ở 37OC Như vậy, có thể sử dụng những enzyme này phá hủy STb ñể bảo vệ ñường tiêu hoá [65]

Không giống như STa, STb gây ra những tổn thương lớp biểu mô ruột STb có thể kết hợp không ñặc hiệu với màng tế bào chất và ñi vào trong tế

bào STb không kích thích tiết Cl- như STa, nhưng kích thích tế bào ruột tiết bicarbonate (HCO3-) [58] STb không làm tăng cAMP hay cGMP nội bào mặc

dù nó kích thích tăng lượng Calci nội bào từ ngoại bào [32] STb cũng kích thích giải phóng PGE2 và serotonin [39]

- Nhóm ñộc tố thứ 3, bán chịu nhiệt EST1 (Enteroaggregative partially –

heat stable enterotoxin 1) do các E.coli thuộc nhóm Enteroaggregative

(EaggEC) cũng thường gặp trong các trường hợp lợn con tiêu chảy

2.2.4 Yếu tố ñộc lực khác

Yếu tố kháng khuẩn của E.coli (Colicin V): Các chủng E.coli ở người

hoặc ñộng vật thường mang plasmid có gen mã hoá Colicin V [60] Colicin V

là một yếu tố có bản chất protein trọng lượng phân tử thấp ColV plasmid mã

hoá cho Colicin V, thấy ở nhiều chủng E.coli thuộc họ Enterobacteriaceae

Colicin V ức chế sự hình thành thể màng Ngoài ra, ColV plasmid thường kết

hợp với quá trình xâm nhập và gây bệnh của E.coli [60] ðặc biệt, những

plasmid này cũng mang các gen có khả năng kích thích sự tăng sinh tế bào trong vật chủ [66]

Khoảng 78% chủng E.coli gây bệnh bò, gà và cừu sản sinh Colicin V

Nếu như, loại bỏ plasmid colicin V, vi khuẩn giảm ñộc lực và ngược lại Một

số ColV plasmid làm tăng sức ñề kháng của vi khuẩn ñối với vật chủ

Có hai yếu tố ñộc lực ñã ñược xác ñịnh có mặt trên ColV plasmid [60] Một loại làm tăng khả năng kháng cơ chế phòng vệ bằng cách mã hoá cho các protein tăng cường khả năng kháng lại cơ chế giải ñộc của vật chủ, quá trình này ñược tiến hành gián tiếp thông qua chất bổ trợ trong huyết thanh

Loại thứ hai là ColV plasmid mã hoá cho một hệ thống vận chuyển sắt [66] vì tất cả các sinh vật, ñể duy trì cuộc sống ñều cần phải có sắt Hầu hết các vi khuẩn phải có khả năng ñồng hoá ñược dinh dưỡng, khoáng từ môi

trường mà ở ñó kim loại thường tồn tại ở dạng keo hydroxit không hoà tan hoặc ở dạng phức chất Do ñó, ñể tồn tại ñược trong môi trường vật chủ, vi khuẩn mang những plasmid có chứa các gen mã hoá cho một hệ thống khử sắt Hydroxamate ái lực cao có khả năng chuyển Fe2+ ở dạng phức transferrin hoặc lactoferrin ở trong vật chủ ñể thành dạng sắt mà sinh vật dễ dàng hấp thụ

ñể sinh trưởng [66] Hệ thống vận chuyển sắt ái lực cao và ColV plasmid

trong E.coli có mối leein hệ chặt chẽ, ñảm bảo sử dụng ñược nguồn Fe2+ sẵn

có trong cơ thể của vật chủ bị nhiễm cho sự tồn tại và phát triển

Các Colicin V tác ñộng ñến tế bào mẫn cảm theo cơ chế gây ñộc: phong tỏa tế bào không cho tiếp xúc hoặc thu nhận chất dinh dưỡng, do ñó vi khuẩn mẫn cảm bị rơi vào trạng thái mất cân bằng trao ñổi chất, thoái hoá và phân rã; Colicin V tự ngấm vào tế bào vi khuẩn “ñịch thủ” và tác ñộng như những enzyme cắt các acid nucleic nội bào, dẫn tới phá huỷ hoàn toàn hệ gen của vi khuẩn; vài loại Colicin V khác tạo ra các kênh vận chuyển ion qua màng tế bào vi khuẩn gây ra sự quá tải về nồng ñộ, chủng loại ion, làm mất cân bằng hiệu ñiện thế qua màng, rối loạn trao ñổi chất và bị tiêu diệt

Yếu tố kháng kháng sinh: ðể ñiều trị bệnh ñường ruột, người chăn nuôi

ñã sử dụng nhiều loại kháng sinh, ngoài ra họ còn trộn kháng sinh vào thức ăn

với tỷ lệ thấp ñể phòng bệnh do vi khuẩn và kích thích tăng trọng Vì vậy sự

kháng kháng sinh của vi khuẩn ñường ruột nói chung và E.coli nói riêng ñang

ngày một tăng, làm cho hiệu quả ñiều trị giảm thấp, thậm chí nhiều loại kháng

sinh còn bị kháng hoàn toàn

Sử dụng kháng sinh lan tràn là tác nhân gây ra sự chọn lọc và phát triển rộng rãi các chủng kháng kháng sinh vốn có sẵn trong mỗi thế hệ vi khuẩn Trong môi trường, các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh khác nhau di chuyển

từ vi khuẩn này qua vi khuẩn khác làm tồn tại trên cùng một vi khuẩn nhiều R plasmid tạo thành các chủng kháng nhiều loại kháng sinh [57]

2.3 Bệnh do E.coli gây ra ở lợn con theo mẹ

Lợn con sơ sinh bị tiêu chảy do nhiều nguyên nhân, trong đĩ cĩ E.coli

Bệnh thường xảy ra ổ lợn của nái đẻ lứa đầu Bệnh thường xảy ra khi thời tiết thay đổi, khí hậu rét, mưa nhiều, độ ẩm cao

Phần lớn các chủng E.coli gây bệnh tiêu chảy ở lợn con mới sinh thuộc

thuộc nhĩm ETEC với các serogroup O8, O9, O20, O101, O141, O147, O149

và O157, trong đĩ serogroup O149 là phổ biến nhất [49] Các ETEC mang một hoặc nhiều kháng nguyên bám dính như F4, F5, F6, F18, F41 và cĩ khả năng sản sinh độc tố đường ruột ST và LT

Triệu chứng: Bệnh xảy ra rất nhanh thường 12 giờ sau khi sinh, thậm chí

chỉ sau 2 giờ sau khi sinh Lợn sơ sinh chết ngay sau khi xuất hiện triệu chứng tiêu chảy, tỷ lệ chết trong đàn cĩ thể lên tới 70%, chủ yếu dưới 4 ngày tuổi Nền chuồng cĩ phân màu trắng, lợn con tụm vào một gĩc chuồng Lợn con xù lơng, gầy cịm, suy nhược, yếu ớt, các đầu xương nhơ ra, mắt trũng sâu Chuyển biến từ cịn bú sang bỏ bú; phân từ màu sáng sang màu trắng hoặc xám, lúc đầu thành bãi, về sau phân tự do chảy, lợn bê bết phân Một số trường hợp lợn cĩ triệu chứng nơn mửa Trọng lượng cơ thể lợn giảm sút nhanh 30- 40%, cơ vùng bụng run rẩy, nhão, khơng cịn trương lực

Bệnh tích: Xác chết gầy, phần thân sau bê bết phân; tồn bộ đường tiêu

hố xuất huyết, các xuất huyết điểm ở ruột non và thành dạ dày Dạ dày giãn rộng, chứa đầy sữa đơng vĩn khơng tiêu Ruột non căng phồng chứa đầy hơi, thành ruột cĩ những đám xuất huyết, chất chứa lẫn máu, niêm mạc ruột non bong trĩc, thành ruột mỏng Hệ thống lâm ba ruột tụ huyết Các cơ quan nội tạng khác như tim, gan, thận, phổi ít biến đổi

Chẩn đốn: Chẩn đốn phân biệt dựa vào triệu chứng của bệnh tiêu chảy

do E.coli gặp nhiều khĩ khăn do biểu hiện lâm sàng của bệnh rất giống với

bệnh viêm dạ dày ruột truyền nhiễm do virus Tuy nhiên cĩ thể dựa vào đặc

điểm phát bệnh để phân biệt: Bệnh colibacillosis thường xảy ra sớm hơn

(2-12 giờ), bệnh do virus TGE (Transmission GastroEnteroritis) thường xuất hiện muộn hơn (72 giờ) Tỷ lệ chết do colibacillosis khoảng 5-70%, trong khi

đĩ tỷ lệ chết do TGE xấp xỉ 100%

Chẩn đốn phịng thí nghiệm: Thường phải phân lập căn bệnh trên các

mơi trường đặc hiệu, xác định các yếu tố độc lực bằng PCR và type kháng nguyên O và F bằng ngưng kết và ELISA

2.4 Bệnh tiêu chảy do E.coli ở lợn sau cai sữa

Bệnh thường xảy ra ở tất cả các lứa tuổi của lợn, nhưng tỷ lệ mắc bệnh, mức độ trầm trọng và tỷ lệ chết cao tập trung vào lợn con từ 4 tuần tuổi đến sau cai sữa 1 tháng

ðặc điểm: Bệnh thường xảy ra ở lợn sau cai sữa 3-10 ngày với triệu

chứng tiêu chảy, đơi khi cĩ lợn chết đột ngột ở ngày thứ 4 - 5 sau cai sữa Bệnh lây lan trong đàn rất nhanh, trong vịng 1-3 ngày tỷ lệ ốm cĩ thể lên tới 80-90% Ở trại chăn nuơi tập trung, trong thời gian ngắn bệnh sẽ lây sang các đàn khác Bệnh cũng cĩ thể tồn tại trong đàn bị nhiễm hàng tuần hoặc tháng

2.4.1 Các chủng gây bệnh

Các chủng E.coli thuộc nhĩm ETEC là nguyên nhân chính của bệnh tiêu chảy ở lợn sau cai sữa Ngồi nhĩm ETEC, các chủng E.coli thuộc nhĩm VTEC, EPEC và gần đây nhĩm EaggEC (Enteroaggrigative E.coli) cũng

thường xuyên phân lập được từ lợn con bị bệnh tiêu chảy [69]

2.4.2 Yếu tố độc lực

Những chủng này thường mang một hoặc nhiều kháng nguyên bám dính F4, F5, F6 và F41 và cĩ thể sản sinh độc tố đường ruột như Sta, STb, LT1, LT2 và ST1, EAST1 [STb (77.6%), EAST1 (65.8%), LT (61.6%), STa (26.5%) and VT2e (16.4%) [35]]

Ở lợn con sau cai sữa các chủng E.coli thuộc nhóm ETEC là nguyên nhân chính gây bệnh Colibacillosis [49] Các chủng F4 E.coli là nguyên nhân chính

gây bệnh tiêu chảy (44,7%), tuy nhiên cũng thường gặp F18 (39,3), ñôi khi

Intimin (1,4%), và F6 (0,9%) và F5, F41 [35, 53] ða số các chủng E.coli

thuộc nhóm ETEC gây bệnh tiêu chảy cho lợn con sau cai sữa thuộc một số serotype ñặc trưng như O149, O138, O139, O141, O147 và O8, trong ñó các chủng thuộc tổ hợp O 149:K91:K88 (F4) là phổ biến [38]

2.4.3 Sinh bệnh học

Các Receptor của kháng nguyên bám dính của E.coli thuộc nhóm ETEC

gây bệnh tiêu chảy sau cai sữa: Các receptor của F4 xuất hiện nhiều ở niêm mạc ruột của lợn con sơ sinh và có xu hướng giảm nhẹ ở lợn con sau cai sữa

Ngoại cảnh: Có rất nhiều yếu tố liên quan ñến quá trình gây bệnh của vi

khuẩn E.coli ở lợn sau cai sữa như: lợn con bị stress khi tách mẹ, nhập chung

với ñàn khác, thay ñổi thức ăn, mất nguồn kháng thể bị ñộng truyền qua sữa

mẹ, chuồng ẩm

Cơ thể lợn: pH trong ñường ruột của lợn sau cai sữa cao hơn so với trước

cai sữa, yếu tố này rất quan trọng bởi vì các chủng E.coli dung huyết thuộc

serotype O149, K88 từ phần cuối của hệ thống tiêu hoá chuyển ñến cư trú ở

phần trước của ruột non Số lượng của các chủng E.coli gây dung huyết ở

phần trung tâm của ruột chạy có thể nhiều 103 ñến 105 lần ở lợn con bị nhiễm bệnh Colibacillosis so với lợn khoẻ mạnh ở cùng lứa tuổi

Miễn dịch ở lợn cai sữa: Lợn con sau cai sữa là mất ñi nguồn miễn dịch

thụ ñộng qua sữa mẹ Ở giai ñoạn sau cai sữa sự bảo hộ qua sữa mẹ mất ñi, lợn con chưa có khả năng tự sản sinh kháng thể ñể phòng bệnh

2.4.4 Triệu chứng

Ngay sau khi cai sữa 3-4 ngày, lợn có hiện tượng giảm cân với tỷ

50-100% Trong một số trường hợp khơng cĩ biểu hiện tiêu chảy Trong đàn cĩ 1 hoặc 2 con lợn chết đột ngột nhưng khơng cĩ biểu hiện triệu chứng lâm sàng Sau đĩ một nhĩm trong đàn cĩ triệu chứng tiêu chảy, lây lan và tỷ lệ ốm chết lên đến 100% Triệu chứng điển hình là sốt, bỏ ăn, phân lỏng, màu vàng, mùi hơi tanh, đi lại siêu vẹo, co giật, đầu, mặt phù Xuất hiện những vùng da tím tái ở mũi, chĩp tai và bụng Một vài lợn cĩ triệu chứng thần kinh, đi vịng trịn theo một chiều nhất định hoặc liệt hai chân sau, vào giai đoạn cuối lợn nằm nghiêng chân bơi chèo, xác gày và bẩn Trong một đàn, bệnh thường kéo dài 6-7 ngày Nếu khơng điều trị kịp thời lợn bệnh bị chết sau 5 ngày nhiễm, số cịn lại chậm lớn, cịi cọc

2.4.5 Bệnh tích

Mức độ bệnh tích phụ thuộc nhiều vào tuổi mắc bệnh, thời gian kéo dài của bệnh, thường bệnh tích tập trung ở cơ quan tiêu hố và hơ hấp Nhìn chung xác lợn chết gầy, bẩn; thân bê bết phân; mắt trũng sâu; tím tái ở mũi, tai Niêm mạc mắt miệng nhợt nhạt; Phổi nhợt nhạt và khơ; cơ tim nhão, mất trương lực; bàng quang xẹp, niêm mạc xuất huyết; gan mất màu, cĩ những nốt hoại tử trên bề mặt Dạ dày chứa đầy thức ăn Chất chứa trong các đoạn ruột

cĩ trạng thái khác nhau từ nhiều nước đến sền sệt, cĩ mùi đặc trưng Niêm mạc ruột, dạ dày xuất huyết, nếu tiêu chảy nặng niêm mạc bị bong trĩc

Quan sát bệnh tích vi thể thấy lẫn trong lớp tế bào lơng nhung là vi khuẩn

E.coli Lớp tế bào lơng nhung bị phá huỷ nặng [13]

2.4.6 Chẩn đốn

Chẩn đốn phân biệt: cần phân biệt với bệnh viêm ruột và phĩ thương hàn cũng cĩ triệu chứng tiêu chảy và chết nhưng khơng liên quan đến giai đoạn cai sữa, 2 bệnh này thường gặp ở lợn nhỡ Lợn con bị bệnh phĩ thương hàn cĩ phân mùi thối khắm, lẫn dịch nhầy, thỉnh thoảng cĩ lẫn máu Bệnh viêm ruột tiêu chảy thường xảy ra dai dẳng trong đàn, lợn bị bệnh thường sốt cao

Chẩn đốn trong phịng thí nghiệm: Cách tốt nhất dựa vào yếu tố độc

lực và định type kháng nguyên O Phân lập E.coli từ phân và phủ tạng trên

các mơi trường thơng thường Cĩ thể dùng ELISA, kháng thể huỳnh quang để xác định các kháng nguyên bám dính F4, hoặc PCR xác định gene cho yếu tố

bám dính F4 và độc tố đường ruột 100% chủng E.coli phân lập từ lợn chết cĩ

ngưng kết với kháng huyết thanh K88, 40% gây dung huyết mạnh [13]

2.5 Bệnh phù đầu ở lợn con

Bệnh phù đầu (Oedema disease) ở lợn được Shanks mơ tả lần đầu tiên tại Ireland năm 1938, do các VTEC cĩ kháng nguyên bám dính F18 và độc tố VT2 gây ra Bệnh thường xảy ra ở lợn sau cai sữa Bệnh xảy ra lẻ tẻ hoặc ổ dịch nhỏ; bệnh xuất hiện đột ngột, kéo dài trung bình 8 ngày và kết thúc cũng đột ngột Tỷ lệ bệnh thấp (16%) nhưng tỷ lệ chết cao (64%) [42]

Triệu chứng: Sau 36 giờ ủ bệnh lợn bỏ ăn, sốt, chui rúc một gĩc chuồng,

uống nhiều nước, táo bĩn Sau 48 giờ lợn cĩ biểu hiện khĩ thở, bỏ ăn hồn tồn, uống nhiều nước, mắt hơi phù, vừa tiêu chảy vừa táo bĩn ðến giờ thứ

52 bắt đầu cĩ lợn co giật và chết

Bệnh tích: Phù dưới da tồn thân; phù mí mắt, trán, đường cong lớn ở dạ

dày Cĩ dịch nhầy ở thanh quản, màng treo ruột, ruột kết giữa, vỏ thận, tràn nước màng tim, màng phổi Trường hợp mạn tính, khơng thấy phù, nhưng cĩ thể thấy cuống não phồng rộp [5]

Chẩn đốn: Bệnh phù đầu xảy ra ở ổ dịch thường đặc trưng, những

trường hợp quá lẻ tẻ hoặc mạn tính thường khĩ chẩn đốn Quan sát những tổn thương đặc trưng như phù ở mí mắt, mặt trước, sau gốc tai Xét nghiệm vi

khuẩn học: phân lập E.coli gây, xét nghiệm yếu tố bám dính F18ab [tăng

cường trên mơi trường đặc hiệu (Iso-Sensitest, Oxoid), 20% CO2]; Xét nghiệm huyết thanh học bằng ngưng kết nhanh với kháng thể đơn dịng, ELISA phát hiện F18ab; thử độc tố trên tế bào Vero PCR xác định sự cĩ mặt

của gene mã hóa F18ab và ñộc tố Stx2e

Ở Việt Nam: Bệnh phù ñầu thường xảy ra ở lợn 45 ñến 90 ngày tuổi (sau

cai sữa và trước cai sữa muộn), thường gặp ở những con phát triển nhanh nhất trong ñàn với triệu chứng sốt, bỏ ăn, phù, co giật ñiển hình Bệnh xảy ra quanh năm, cao nhất vào mùa hè Bệnh lẻ tẻ, rời rạc, không lan từ ñàn này sang ñàn khác Tỷ lệ lợn bệnh thấp nhưng tỷ lệ chết cao [5]

2.6 Những nghiên cứu về chế phẩm phòng và ñiều trị E.coli

Tiêu chảy ở lợn con do E.coli không phải chỉ là vấn ñề của Việt Nam mà

là vấn ñề nan giải của thế giới Những nghiên cứu về văc xin và sinh phẩm

phòng trị bệnh do E.coli là mối quan tâm của nhiều quốc gia

2.6.1 Văc xin phòng bệnh lợn con tiêu chảy do E.coli

Văc xin phòng bệnh lợn con tiêu chảy nói chung ít có hiệu quả Hiện có

một số văc xin dùng cho nái, phòng bệnh cho lợn con Các văc xin này bao gồm các yếu tố bám dính, phổ biến là F4, F5, F6, F18ab,… và ñộc tố ñường ruột ST hay LT [47, 67]

2.6.2 Chế phẩm lòng ñỏ trứng trong phòng trị lợn con tiêu chảy

Hiện nay, trên thế giới ñã có nhiều công trình nghiên cứu về sản xuất IgY; Yokoyama và cs (1992) thu hoạch trứng gà tách riêng lòng ñỏ sấy khô thành chế phẩm dạng bột Trong 10 gam lòng ñỏ trứng, sau khi tách riêng protein, lipid và IgY, có thể thu ñược 15 mg IgY ở ñộ tinh khiết 93,8% [68]

Kháng thể IgY có bản chất protein, nhưng bền với nhiệt ñộ và pH Hoạt

tính trung hòa kháng thể kháng E.coli không bị ảnh hưởng khi hấp thanh

trùng ở 650C, 15 phút Tại pH 4,0 IgY không bị biến tính

Gây miễn dịch cho gà, kháng thể ñặc hiệu xuất hiện trong huyết thanh sau

8 ngày và trong trứng sau 10 ngày, ñạt hiệu giá cao nhất ở ngày thứ 15 và 20 ngày sau khi gây miễn dịch lần ñầu [52]

Khi bổ sung vào kháng nguyên gây miễn dịch một loại chất bổ trợ, phosphate-quanosine-oligodeoxynucleotide (CpG-ODN), hiệu quả ñáp ứng miễn dịch ñược nâng cao, hiệu quả ñiều trị của chế phẩm bột lòng ñỏ trứng hoàn thiện [44]

C-Công nghệ kháng thể dị loài trong ñiều trị ñã ñược áp dụng rộng rãi, trên nhiều ñối tượng khác nhau IgY-Hp (kháng thể lòng ñỏ trứng kháng

Helicobacter pylori) cho uống làm giảm thiểu nhiễm H pylori Tương tự, kháng thể lòng ñỏ trứng ức chế sự sinh trưởng của Aeromonas hydrophila ở

nồng ñộ 1,0 mg/ml trong thời gian ủ bệnh, giảm 70% tỷ lệ chết [45]

Nhật Bản ñược coi là một trong những cường quốc kháng thể lòng ñỏ trứng, chế phẩm kháng thể lòng ñỏ trứng dùng ñiều trị lợn con tiêu chảy bắt ñầu từ năm 1992, với tỷ lệ ñiều trị khỏi bệnh cao [68] Akita và cs (1993) ñã

sử dụng E.coli toàn khuẩn sản xuất kháng thể ñặc hiệu lòng ñỏ trứng gà dùng

trong phòng và trị bệnh tiêu chảy cho lợn con Marquardt và cs (1999) ñã sử dụng kháng thể lòng ñỏ trứng gà miễn dịch kháng pili F4 ETEC ñể ñiều trị tiêu chảy cho lợn sơ sinh và cai sữa Kết quả cho thấy lợn uống kháng thể lòng ñỏ trứng có khả năng kháng lại sự lây nhiễm ETEC [46]

Chế phẩm lòng ñỏ trứng ñược ñánh giá hiệu quả cao trong ñiều trị (ñánh giá thông qua gây bệnh thực nghiệm) Tuy nhiên phương pháp này tốn kém

và chỉ có 81% lợn bị nhiễm (xác ñịnh yếu tố bám dính K88 bằng PCR) [55]

2.7 Nghiên cứu trong nước về phòng trị bệnh do E.coli ở lợn

2.7.1 Văc xin

Nguyễn Thị Nội và cs (1978, 1984, 1986, 1989) ñã nghiên cứu sử dụng

vắc xin trong phòng bệnh do E.coli, các tác giả ñã lựa chọn các serotyp có tần

suất cao ñể chế tạo vắc xin, dựa trên kết quả xác ñịnh serotyp O các chủng

E.coli gây bệnh phân lập ñược Vắc xin tiêm cho nái chửa trước khi ñẻ 4-6

tuần cho kết quả bảo hộ 30-40% so với ñối chứng [10-12]

Lê Văn Tạo và cs (1993, 1995) ñã chế tạo vắc xin E.coli vô hoạt từ các

chủng gây bệnh tiêu chảy lợn con có mang các yếu tố gây bệnh (Enterotoxin, Hly, ColV, F4, R) Lợn con uống văc xin giảm tỷ lệ bệnh từ 46% xuống còn 11%, giảm tỷ lệ chết từ 9% còn 2,2% [20], giảm tỷ lệ lợn con mắc bệnh phân trắng từ 31,0% ñến 34,6% và tỷ lệ chết do bệnh này từ 3,6- 6,8% [21]

Văc xin vô hoạt phòng bệnh phù ñầu cũng ñã ñược thử nghiệm, giảm tỷ lệ bệnh 20% ở một số tỉnh ðồng bằng sông Cửu Long [14], ở Bình ðịnh và Hà Tây [16], ở Bắc Giang [9], bảo hộ 90% lợn không mắc bệnh phù ñầu ðể nâng

cao hiệu lực của văc xin phòng bệnh do E.coli, văc xin tiểu phần có thể là một

trong những hướng ưu tiên

2.7.2 Kháng sinh và chế phẩm sinh học thay thế

Trong khi việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi vẫn còn phổ biến, kháng sinh trộn thức ăn là một biện pháp thông dụng ñể phòng bệnh, hiện tượng kháng kháng sinh ngày càng phổ biến [15, 18], việc giảm thiểu sự lạm

dụng kháng sinh bắt ñầu ñược cân nhắc [19], các yếu tố liên quan ñến cơ chế

lan truyền sự kháng thuốc cũng ñang ñược quan tâm [23]

Các thử nghiệm tìm dẫn xuất tự nhiên thay cho kháng sinh và sulfamid là một hướng nghiên cứu ưu tiên, như thử nghiệm sử dụng dịch chiết lá cây

xuân hoa (P palatiferum) ñiều trị lợn con tiêu chảy [4], sử dụng Becberin

(kháng sinh chiết từ cây Hoàng Liên) ñiều trị tiêu chảy ở lợn con tập ăn [6] Sinh phẩm Bacterin EBC tiêm dưới da liều 3ml/con ở lợn 3 ngày tuổi, không

có phản ứng phụ [8] Chế phẩm cao mật lợn, Vitom cho hiệu quả ñiều trị lành bệnh 75% [25] Chế phẩm biosubtyl (men tiêu hoá sống chứa 105-106 CFU/g

Bacillus subtilis) làm giảm 42% tiêu chảy tái phát ở lợn con 1- 60 ngày [3] Chế phẩm E.coli sữa chế từ các vi khuẩn phân lập từ lợn con tiêu chảy [1],

dùng cho lợn mẹ làm giảm tỷ lệ tiêu chảy từ 55,5% xuống còn 28,12% [8]

2.7.3 Kháng thể lòng ñỏ trứng

Cùng với các biện pháp miễn dịch thụ ñộng, như qua sữa ñầu của lợn mẹ, còn có thể sử dụng 1 lượng thích hợp kháng thể ñặc hiệu, khác loài chống lại

các chủng E.coli ñộc, bổ sung vào thức ăn cho lợn con sẽ có tác dụng khống

chế tiêu chảy Kháng thể dị loài sản xuất từ gà ñược gây miễn dịch cung cấp một phương pháp thay thế mới ñể ñiều trị các bệnh lây nhiễm

Sinh phẩm lòng ñỏ trứng có 3 ñiểm thuận lợi: (1) do trứng gà là nguồn phong phú, dễ kiếm [24] kháng thể IgY có trong trứng gà có chất lượng cao,

số lượng lớn, giá thành rẻ mà không phải giết vật thí nghiệm, (2) Ngoài tác dụng ñặc hiệu, lòng ñỏ trứng còn có tác dụng bảo vệ niêm mạc ñường tiêu hoá của gia súc non (3) Kháng thể phi ñặc hiệu còn có tác dụng trung hoà ñộc

tố và láng một lớp vỏ vật lý bảo vệ màng nhầy của ruột non [24], ngăn cản

quá trình ñộc tố ñường ruột bám màng nhầy ruột non [52]

Các công ty thuốc thú y trong nước cũng bắt ñầu sản xuất chế phẩm lòng

ñỏ trứng áp dụng trong ñiều trị bệnh lợn con tiêu chảy do E.coli Công ty Hanvet chế tạo thành công kháng thể KTE kháng 11 chủng E.coli ñộc

Chế phẩm bột kháng thể YP-99, kháng các chủng E.coli cùng nguồn với

E.Rnl, E.Rn2 và E.Ma (mang yếu tố bám dính F5 và F6, vô hoạt bằng formol)

có tác dụng ñiều trị lành bệnh 80,7% lợn con theo mẹ bị tiêu chảy [2]

Các nghiên cứu ñều nhằm nâng cao hiệu quả của chế phẩm lòng ñỏ trứng, hoàn thiện phương pháp chế kháng nguyên (rửa mặt thạch, vô hoạt), hoặc ña dạng hóa chế phẩm (bột uống, thuốc tiêm), ñiều trị lành bệnh lợn con tiêu chảy sau 3 ngày [24]

3 PHẦN III NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 ðối tượng và nội dung nghiên cứu

ðối tượng:

- Gà ñược gây miễn dịch bằng kháng nguyên F4 pili,

- Kháng thể lòng ñỏ trứng và chế phẩm kháng thể lòng ñỏ trứng,

- E.coli gây bệnh lợn con tiêu chảy,

- Lợn con bị tiêu chảy do E.coli tại thời ñiểm cai sữa và ngay sau cai sữa

Nội dung nghiên cứu:

1 Nghiên cứu chế tạo kháng thể lòng ñỏ trứng kháng Pili F4

(1) Nghiên cứu quy trình gây miễn dịch cho gà

(2) Nghiên cứu chế tạo chế phẩm lòng ñỏ trứng

2 Nghiên cứu xác ñịnh liều ñiều trị bệnh lợn con tiêu chảy của chế phẩm lòng ñỏ trứng kháng pili F4

(1) Xác ñịnh nguyên nhân E.coli gây tiêu chảy ở lợn con cai sữa

(2) Xác ñịnh biến ñộng kháng thể kháng F4 pili ở lợn con

- Thu thập mẫu huyết thanh lợn con,

- Ab-ELISA xác ñịnh hiệu giá kháng thể kháng F4-pili

(3) Nghiên cứu xác ñịnh liều ñiều trị bệnh lợn con tiêu chảy của chế phẩm lòng ñỏ trứng kháng F4-pili

(4) Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm trong phòng trị lợn con tiêu chảy

- Hiệu quả ñiều trị lợn con tiêu chảy sau cai sữa

- Hiệu quả ñiều trị dự phòng

3.2 ðịa ñiểm và thời gian nghiên cứu

ðịa ñiểm nghiên cứu: Bộ môn Hóa sinh Miễn dịch Bệnh lý, Viện Thú Y,

- Phun sấy khô lòng ñỏ trứng tại Viện Công nghệ Thực phẩm,

- Trại lợn giống Cầu Diễn, Công ty Nhà nước một Thành viên Giống gia súc Hà Nội

Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 5 năm 2009 ñến tháng 10 năm 2010

3.3 Nguyên vật liệu

3.3.1 ðộng vật thí nghiệm và sinh phẩm

- Gà hướng trứng (giống CP Brown) khỏe mạnh, ñược tiêm phòng các bệnh truyền nhiễm phổ biến Gumboro, Newcastle, cúm,

- Lợn con cai sữa ở trại chăn nuôi lợn giống Cầu Diễn,

- Kháng nguyên Pili của F4 (K88) E.coli do Bộ môn Hóa sinh Miễn dịch

Bệnh lý, Viện Thú y cung cấp,

- Antipig-HRP-Conjugate: Cat # A7042 do Sigma-Aldrich cung cấp,

- Anti-Chicken Chicken IgY Polyclonal (Rabbit), Horseradish Peroxidase Conjugated: Cat LS-C60281-1500, LifeSpan BioSciences,

- Taq DNA Polymerase Master mix 2x: Cat # M5122, Promega,

- Thang DNA 100 bp DNA chuẩn: Cat #15628-019, Invitrogen

3.3.2 Môi trường, hóa chất

- Hoá chất dùng trong phản ứng Ab-ELISA:

Coating buffer (Carbonate-Bicarbonate buffer PH=9,6): Cat #C-304, do hãng Sigma-Aldrich cung cấp,

PBS (Photphate Buffer Saline): Cat #P4417, Sigma-Aldrich,

Cơ chất màu OPD (Ortho-phenylenediamine): Cat S2045, DAKO,

Tween 20: Cat #40350-2, Cica-Reagent,

H2SO4: Cat #S:1/2-26-30-45, Lachema,

Nước Oxy già 30% (H2O2): Cat #S:3-28-36/39-45, Lachema,

Sữa tách bơ ñộ béo ≤ 0.08% (Skim Milk): Cat #92720, Marvel

- Hoá chất ñể làm phản ứng PCR:

Dung dịch TE 5 mM [(TrisBase-EDTA pH 7,0), EDTA Disodium: Cat # H5031, Promega; Tris Base, Cat # H5131, Promega)],

DNase free-water: Cat #P119C, Promega

- Các loại hoá chất chạy ñiện di:

Agarose: Cat #A9539 do hãng Sigma-Aldrich cung cấp,

TAE Buffer (dung dịch mẹ 50x): Cat #24710-030, Gibco,

Ethidium Bromide: Cat #E-1385, Sigma-Aldrich

- Môi trường 3 ống nghiệm

KIA: Cat #1.03913.0500 do hãng Merck cung cấp,

Mannitol-Mobility: Cat #1.05404.0500, Merck,

Urea-Indole: Cat #880239, Bio-Rad

- Hoá chất chế môi trường nuôi cấy vi khuẩn:

Pepton: Cat #M885 do hãng Himedia cung cấp,

Agar: Cat #3644679, Merck,

Yeast extract: Cat #L21, OXOID,

BHI (Brain Heart Infusion): Cat #1.10493.0500, Merck,

Blood Agar base (thạch máu nền): Cat #M089, Himedia

- Hóa chất bảo quản huyết thanh

Natriazit (NaN3): Cat #5224343, Merck

- Bổ trợ dầu

Freund Complete Adjuvant: Cat #F5881, do Sigma-Aldrich cung cấp

- Hóa chất thông thường phòng thí nghiệm

3.3.3 Máy móc, trang thiết bị

- Máy móc

Tủ ấm lắc chuyên dụng (Stat fax 2200, Awareness), Vortex (Genie), máy ñọc ELISA (Elx800, Biotek), hộp ñèn tử ngoại, máy PCR (Thermocycler), máy ñiện di (Biorad), máy sấy trứng Centrifuge spray dryer- LPG-5

- Trang thiết bị dụng cụ thông thường phòng thí nghiệm

Cân phân tích, buồng cấy vô trùng (Biosafety Cabinet), nồi hấp, tủ sấy, tủ

ấm, bể ấm, tủ lạnh 40C, tủ lạnh -300C, tủ lạnh -800C, tủ ấm CO2, ñèn UV Micro-pipette các loại 2 µl, 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl và ñầu tip tương ứng

Dụng cụ thông thường phòng thí nghiệm: Ống nghiệm, ñĩa Petri, ñèn cồn, que cấy, pince, kéo, ñĩa ELISA 96 giếng, tấm dán ELISA

Bơm tiêm, bông cồn, ống ly tâm 14 ml; 50 ml; Eppendorf 0,2 ml và 1,5

ml, máng nhựa, giá ñựng, cốc xả týp và dung dịch

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Phương pháp phân lập và giám ñịnh vi khuẩn E.coli

Phương pháp chuẩn bị các môi trường nuôi cấy vi khuẩn

Các môi trường nuôi cấy, giám ñịnh ñặc tính sinh vật hóa học của E.coli

bao gồm nước thịt, thạch thường, thạch máu, thạch KIA, Mannitol-Mobility, Urea-Indole…ñược chuẩn bị như thường quy phòng thí nghiệm

Phương pháp thu thập mẫu phân

Phân ñược lấy trực tiếp từ trực tràng của lợn con Cố ñịnh lợn, dùng tăm bông ngoáy vào lỗ hậu môn, cho tăm bông vào ống Eppendorf có sẵn dung dịch bảo quản Mẫu ñược ghi rõ ký hiệu, tính biệt, ngày tuổi và ngày lấy mẫu Mẫu phân ñược bảo quản trong hộp lạnh và chuyển về phòng thí nghiệm

Phương pháp nuôi cấy, phân lập và giám ñịnh vi khuẩn E.coli

Mẫu phân mới chuyển về phòng thí nghiệm ñược nuôi cấy, phân lập giám ñịnh ñặc tính sinh vật hóa học và giám ñịnh PCR như thường quy và ñược tóm

tắt ở sơ ñồ hình 03-01

Hình 03-01 Sơ ñồ phân lập và giám ñịnh vi khuẩn E.coli

3.4.2 Phương pháp PCR xác ñịnh chủng F4 E.coli

Quy trình tách DNA vi khuẩn

- Canh khuẩn nuôi cấy sau 16-18h/370C, lắc 220 vòng/ phút,

- Lấy 50µl canh khuẩn ly tâm 3000v/phút ở 40C, bỏ dịch lấy cặn,

- Hòa tan cặn bằng 250 µl nước cất, dùi thủng lỗ ống ñựng mẫu,

- ðun cách thủy 5 phút/1000C,

- Lập tức chuyển ống vi khuẩn ñã ñun vào ñá lạnh, giữ 3 phút,

- Ly tâm 4000v/phút trong 4 phút ở 40C,

- Giữ trên ñá lạnh, dịch trong chứa DNA dùng làm sợi mẹ trong PCR

Chuẩn bị mồi (Primer)

ðể xác ñịnh sự có mặt của gene mã hóa pili F4, các ñộc tố ñường ruột LT, Sta và STb, phương pháp PCR sử dụng cặp mồi ñặc hiệu có trình tự

nucleotide ở bảng 03-01

Bảng 03-01 Trình tự nucleotide của các cặp mồi và sản phẩm nhân gene

F4 GCA CAT GCC TGG ATG ACT GGTG

CGT CCG CAG AAG TAA CCC ACCT

499

LT ATT TAC GGC GTT ACT ACT CTC

TTT TGG TCT CGG TAC GAT AGT

272

STa TCC GTG AAA CAA CAT GAC GG

ATA ACA TCC AGC ACA GGC AG

158

STb GCC TAT GCA TCT ACA CAA TC

TGA GAA ATG GAC AAT GTC CG

133

Chuẩn bị Primer: Dung dịch mẹ primer 100 µM (10 x nồng ñộ cho

PCR) ñược chuẩn bị trong dung dịch TE pH 8,0, bảo quản ở -30OC Trước khi tiến hành PCR, chuẩn bị dung dịch primer theo tỷ lệ 1/10 trong TE, dung dịch làm việc có nồng ñộ 10 µM, dùng 1 µl primer mỗi loại cho 25 µl phản ứng

Thành phần PCR

Chuẩn bị (trên ñá lạnh) trong mỗi phản ứng 25 µl PCR trong ống PCR 0,2

ml thành mỏng bằng cách tuần tự thêm các chất và dung lượng như ở bảng 03-02; chạy máy PCR theo chương trình và chu trình nhiệt như bảng 03-03

Bảng 03-02 Thành phần phản ứng PCR

1 Dnase-, Rnase- Free water Cat #P119C, Promega 8,5

5 Gotaq Green MasterMix 2x (Cat # M5122, Promega) 12,5

Bảng 03-03 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR

Giai ñoạn Bước Tên Nhiệt ñộ (0C) Thời gian (phút) Số chu kỳ

ðiện di sản phẩm PCR trên gel Agarose

- Thêm 0,8 gam Agarose (Cat #A9539 Sigma-Aldrich) vào 40 ml dung dịch 1 x TAE (Cat #24710-030, Gibco),

- ðun sôi trong Microwave, 2 phút tạo dung dịch Agarose 2%,

- ðể nguội dung dịch tới 600C; ñổ gel vào khuôn nằm ngang ñã có lược; ñể yên 20 phút cho tới khi gel ñông cứng; tháo bỏ lược

gel ðặt gel Agarose vào khoang chạy, thêm dung dịch chạy ñiện di TAE 1

X ñến khi ngập gel

- Nhỏ mẫu vào trong các giếng tương ứng của gel (không cần thêm loading dye vì Gotaq Green MasterMix ñã có dye); nhỏ thang DNA 1 giếng (Cat #15628-019, Invitrogen)

- Chạy ñiện di ở 100 Vol trong 30 phút

- Nhuộm gel trong Ethidium Bromide (Cat #E-1385, Sigma-Aldrich) 5µg/ml trong 10 phút

- Kiểm tra sản phẩm PCR trên ñèn UV, chụp ảnh

3.4.3 Phương pháp gây miễn dịch cho gà

Chuẩn bị hỗn hợp kháng nguyên gây miễn dịch cho gà

ðể gây miễn dịch cho gà bằng các quy trình khác nhau, kháng nguyên pili ñược chuẩn bị ở dạng nhũ dầu tuần tự như sau:

- Giải ñông tan kháng nguyên pili F4 do Bộ môn Hóa sinh Miễn dịch Bệnh lý cung cấp Kháng nguyên gốc có nồng ñộ protein 4 mg/ml trong PBS

- Chuẩn bị 5 ống kháng nguyên, lần lượt thêm các thành phần theo từng ống như ở bảng 04-04, trộn ñều sau ñó thêm Complete Freund Adjuvant (Cat

#F5881, Sigma-Aldrich) theo tỷ lệ 1: 1 Tạo nhũ bằng máy siêu âm

Bảng 03-04 Thành phần các ống nhũ kháng nguyên

Ống Kháng nguyên

Pili gốc (ml)

PBS (ml)

Freund Adjuvant (ml)

Nhũ kháng nguyên (ml)

Nồng ñộ pili thành phẩm (mg/ml)

Bố trí thí nghiệm gây miễn dịch cho gà, so sánh 3 quy trình

Ba quy trình gây miễn dịch cho gà gồm:

- Quy trình 01 (lô 01): Giữ nguyên liều kháng nguyên, lập lại 4 lần

- Quy trình 02 (lô 02): Tiêm liều kháng nguyên giảm dần

- Quy trình 03 (lô 03): Tiêm liều kháng nguyên tăng dần

- Lô 04: ðối chứng, không tiêm kháng nguyên, chỉ tiêm nhũ dầu PBS

Gà CP Brown hướng trứng 18 tuần tuổi ñược gây miễn dịch bằng cách tiêm bắp 1ml/con theo lịch tiêm và liều lượng theo lô ở bảng 03-05

Bảng 03-05 Liều kháng nguyên tiêm (mg F4 pili) theo quy trình

Ngày ñầu Ngày 7 Ngày 14 Ngày 28 Ghi chú

Lô 2 2 1 0,5 0,25 Kháng nguyên ống 1 ñến 4

Lô 3 0,25 0,5 1 2 Kháng nguyên ống 4 ñến 1

Lô 4 ðC-PBS ðC-PBS ðC-PBS ðC-PBS Nhũ PBS ống 5

Thu thập mẫu huyết thanh gà

Thu thập mẫu máu gà: Thu thập mẫu máu 4 gà cho mỗi lô thí nghiệm

tại ngày tiêm (D0) và mỗi tuần sau ñó thu mẫu máu 1 lần ñến tuần thứ 33 Dùng bơm và kim tiêm lấy 1 ml máu ở tĩnh mạch cánh, cho máu vào ống Eppendorf, ghi ký hiệu mẫu Bảo quản ở nhiệt ñộ lạnh và vận chuyển về phòng thí nghiệm Các mẫu máu ñược ñánh số tuần tự D0, D7, D14, D21, D28, D35, D42, D49, D56, D63, D70, D77, D84, D91, D98, D105, D112, D119, D126, D133, D140, D145, D154, D161, D168, D175, D182, D189, D196, D203, D210, D217 và D224

Tách huyết thanh và bảo quản: Ly tâm ống Eppendorf ở 4000

vòng/phút trong 10 phút, dùng micropipet và ñầu type tương thích chuyển 0,4

ml huyết thanh sang ống Eppendorf vô trùng, thêm 4 µl Natriazit 10% (NaN3), dán nhãn, bảo quản huyết thanh trong 1 tuần ở 4OC, bảo quản lâu dài

ở -30OC ñến khi phân tích

Thu thập mẫu trứng gà miễn dịch

Trứng gà ñược thu thập hàng ngày, ñánh số theo lô và theo ngày, bảo quản ở kho lạnh 4OC ñến khi phân tích hoặc chế bột trứng

3.4.4 Chế tạo bột kháng thể lòng ñỏ bằng công nghệ phun sấy khô

Bước 2: Phun sấy khô

Tại bình ñầu vào của máy phun sấy khô có thanh khuấy bổ sung nước cất

ñể ñiều chỉnh ñộ nhớt nếu cần (thường bổ sung 5 thể tích nước cất 1 lần cho 5