4. PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1.1. Kết quả gây miễn dịch cho gà, thu thập mẫu huyết thanh và trứng
Kháng nguyên F4 pili của Ẹcoli do Bộ môn Hóa sinh Miễn dịch Bệnh lý cung cấp, có nồng ựộ protein là 4 mg/ml. Hỗn dịch kháng nguyên tiêm ựược chuẩn bị dưới dạng nhũ dầu với bổ trợ complete Freund như trình bày ở phần phương pháp nghiên cứụ
Tổng số 40 gà chia thành 3 lô thắ nghiệm ựược gây miễn dịch bằng kháng nguyên pili F4 Ẹcoli như trình bày ở phần phương pháp và 1 lô ựối chứng chỉ tiêm nhũ PBS không có kháng nguyên. Gà ựược nuôi từ tuần tuổi thứ 18 (ựẻ bói) ựến 51, mẫu huyết thanh ựược thu ở 4 gà cho mỗi lô sau mỗi tuần. Trứng gà ựược thu, ựánh dấu theo ngày và lô. Kết quả thu thập mẫu huyết thanh và trứng gà ựược trình bày ở bảng 04-01.
Bảng 04-01. Thu thập mẫu huyết thanh gà miễn dịch và trứng gà
Huyết thanh Trứng
Tuần Ngày QT01 QT02 QT03 đC Ầ. Tuần đến ngày QT01 QT02 QT03 đC
1 D0 4 4 4 4 1 20/09/09 13 12 21 8 2 D7 4 4 4 4 2 27/09/09 26 23 38 23 3 D14 4 4 4 4 3 04/10/09 42 44 25 33 4 D21 4 4 4 4 4 11/10/09 43 54 37 49 5 D28 4 4 4 4 5 18/10/09 52 53 43 53 6 D35 4 4 4 4 6 25/10/09 53 53 53 55 7 D42 4 4 4 4 7 01/11/09 53 50 50 54 8 D49 4 4 4 4 8 08/11/09 56 55 51 50 9 D56 4 4 4 4 9 15/11/09 54 54 53 49 10 D63 4 4 4 4 10 22/11/09 52 49 47 54 11 D70 4 4 4 4 11 29/11/09 44 48 50 53 12 D77 4 4 4 4 12 06/12/09 45 51 46 53 13 D84 4 4 4 4 13 13/12/09 51 54 51 52
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ẦẦẦẦẦ..45
Huyết thanh Trứng
Tuần Ngày QT01 QT02 QT03 đC Ầ. Tuần đến ngày QT01 QT02 QT03 đC
14 D91 4 4 4 4 14 20/12/09 53 49 50 53 15 D98 4 4 4 4 15 27/12/09 55 52 54 54 16 D105 4 4 4 4 16 03/01/10 44 45 42 51 17 D112 4 4 4 4 17 10/01/10 51 52 53 54 18 D119 4 4 4 4 18 17/01/10 53 47 56 47 19 D126 4 4 4 4 19 24/01/10 54 52 51 54 20 D133 4 4 4 4 20 31/01/10 51 48 53 54 21 D140 4 4 4 4 21 07/02/10 57 48 53 52 22 D145 4 4 4 4 22 12/02/10 52 51 47 53 23 D154 4 4 4 4 23 21/02/10 55 48 46 53 24 D161 4 4 4 4 24 28/02/10 48 50 47 49 25 D168 4 4 4 4 25 07/03/10 39 48 51 50 26 D175 4 4 4 4 26 14/03/10 36 43 54 54 27 D182 4 4 4 4 27 21/03/10 44 48 50 47 28 D189 4 4 4 4 28 28/03/10 43 49 49 51 29 D196 4 4 4 4 29 04/04/10 39 48 25 38 30 D203 4 4 4 4 30 11/04/10 41 53 30 43 31 D210 4 4 4 4 31 18/04/10 36 46 20 46 32 D217 4 4 4 4 32 25/04/10 40 43 29 42 33 D224 4 4 4 4 33 26/04/10 7 9 6 6 Tổng 528 132 132 132 132 Tổng 5979 1482 1529 1431 1537 Nhận xét: (1) Tổng số 528 mẫu huyết thanh ựược thu thập (132 mẫu/lô)
trong ựó có 396 mẫu của 3 lô gà thắ nghiệm gây miễn dịch theo quy trình 01, 02 và 03, 132 mẫu của lô gà ựối chứng. Những mẫu huyết thanh ựược thu thập theo tuần cho phép phân tắch biến ựộng ựáp ứng miễn dịch của gà theo quy trình và theo thời gian, ựồng thời nhằm phân tắch so sánh với hiệu giá kháng thể ở lòng ựỏ trứng.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ẦẦẦẦẦ..46
Giai ựoạn ựầu gà ựẻ bói, số trứng không ựáng kể. Lượng trứng tăng dần và ổn ựịnh từ tuần thứ 4. Số trứng gà thu thập cho mỗi lô là tương ựối ựồng ựều: 1482 trứng (lô 1, quy trình 01), 1529 (lô 2, quy trình 02), 1431 (lô 3, quy trình 03) và 1537 (lô ựối chứng). Các khay trứng ựược ựánh số theo lô và ngày, bảo quản ở kho lạnh 4-8OC ựến khi dùng.
4.1.2.đáp ứng miễn dịch ở gà gây miễn dịch bằng 3 quy trình khác nhau
Tổng số 396 mẫu huyết thanh thu thập ở (bảng 04-01) và 44 mẫu huyết thanh ngẫu nhiên theo thời gian của lô ựối chứng ựược phân tắch bằng Ab- ELISA sử dụng kháng nguyên F4-pili do Bộ môn Hóa sinh Miễn dịch Bệnh lý cung cấp. Gà ựối chứng ựều cho kết quả âm tắnh. Dương tắnh huyết thanh học theo mẫu của 132 mẫu/lô thắ nghiệm của 3 lô tương ứng với quy trình gây miễn dịch 01, 02 và 03 ựược trình bày ở hình 04-01.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ẦẦẦẦẦ..47
Nhận xét: Kết quả ở hình 04-01 cho thấy (1) Gà có ựáp ứng miễn dịch
ựặc hiệu kháng pili F4 ở cả 3 quy trình.
(2) Mức OD trong ELISA có khác nhau thùy thuộc vào cá thể và thời ựiểm thu mẫu, tuy nhiên sau 14 ngày, ựáp ứng miễn dịch của gà cho tắn hiệu dương tắnh ELISA rõ rệt và kéo dài, sau 33 tuần vẫn ở mức dương tắnh.
4.1.3.Tương quan hiệu giá kháng thể kháng pili ở huyết thanh và trứng
để ựánh giá hiệu giá kháng thể trong huyết thanh và trong lòng ựỏ trứng của mỗi quy trình, ựại diện mẫu huyết thanh tại ngày thứ 35 ựược dùng ựể chuẩn ựộ, so sánh với ựối chứng, kết quả ựược minh họa ở hình 04-02.
Hình 04-02. Kết quả chuẩn ựộ huyết thanh và trứng các lô gà thắ nghiệm Nhận xét: (1) Lô ựối chứng chỉ tiêm nhũ dầu PBS (không có kháng
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ẦẦẦẦẦ..48
nguyên pili), gà không có ựáp ứng miễn dịch ựối với kháng nguyên pili F4. Ngược lại, cả 3 lô thắ nghiệm, có tiêm kháng nguyên pili với các quy trình khác nhau ựều có kháng thể ựặc hiệu kháng pili F4 trong huyết thanh và trong trứng, nhưng ở mức ựộ khác nhaụ
(2) Hiệu giá huyết thanh là 100 x 9 log2 (1/25600) ở gà cả hai lô gây miễn dịch bằng quy trình 02 và quy trình 03, cao hơn so với quy trình 01 (100 x 6 log2: 1/3200).
(3) Hiệu giá kháng thể ựặc hiệu trong lòng ựỏ trứng thấp hơn trong huyết thanh ở cả 3 quy trình: Mức chênh lệch hiệu giá ở quy trình 1 là 3 log 2, quy trình 2 là 1 log2 và quy trình 3 là 2 log2.
(4) Trong ba quy trình gây miễn dịch ựã thử nghiệm, quy trình 02 là tốt nhất với mục ựắch thu sản phẩm cuối cùng là trứng có lòng ựỏ với hiệu giá kháng thể ựặc hiệu cao nhất.
4.1.4.Biến ựộng kháng thể ở huyết thanh và lòng ựỏ trứng gà lô 2 và 3
Phân tắch biến ựộng kháng thể ở gà và lòng ựỏ trứng ựược tiến hành với huyết thanh và trứng của gà thắ nghiệm gây miễn dịch bằng quy trình 02 và 03. Từ số mẫu của 33 tuần, mẫu huyết thanh của 10 thời ựiểm ựược chuẩn ựộ so sánh với trứng thu thập cũng cùng ngày thu huyết thanh.
Thời ựiểm của 10 mẫu ựược lựa chọn bao gồm (so với D0-số ngày sau ngày ựầu tiên gây miễn dịch) là D7, D14, D21, D28 (1, 2, 3, 4 tuần), D56, D91, D119, D154, D182 và D224 (2, 3, 4, 5, 6 và 7,5 tháng). Huyết thanh ựược pha loãng bắt ựầu từ 1: 200 theo cơ số 2 ựến giếng thứ 8 (1: 25600). Kết quả biến ựộng hiệu giá của kháng thể ựặc hiệu theo thời gian của huyết thanh và lòng ựỏ trứng gà gây miễn dịch bằng quy trình 2 và quy trình 3 là tương tự. Hình 04-03 mô tả kết quả biến ựộng hiệu giá của kháng thể ựặc hiệu của quy trình 2 ở cả huyết thanh (bên trái) và lòng ựỏ trứng (phải).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ẦẦẦẦẦ..49
Hình 04-03. Biến ựộng hiệu giá kháng thể ở huyết thanh và lòng ựỏ trứng
gà ựược gây miễn dịch bằng quy trình 02.
Nhận xét: (1) Hiệu giá kháng thể ở huyết thanh tại thời ựiểm 1 tuần sau gây miễn dịch là 200 x 3 log2 (dương tắnh tại hiệu giá 1/800), sau ựó tăng nhanh ựạt hiệu giá 1: 12.800 ở ngày thứ 14 và ựạt hiệu giá cao nhất (1: 25.600) vào ngày thứ 21. Hiệu giá cao nhất kéo dài ựến 2 tháng sau ựó giảm dần ựến 7,5 tháng còn 1: 3200.
(2) Tương tự, hiệu giá kháng thể lòng ựỏ trứng bắt ựầu xuất hiện ở mức 200 x 7 log2 (1: 6.400) vào ngày thứ 14 sau mũi miễn dịch ựầu tiên, tăng lên và ựạt mức tối ựa vào ngày 21 là 200 x 8 log2 (1: 12.800), duy trì ắt nhất ựến ngày thứ 56. Hiệu giá này giảm xuống mức 1: 6.400 vào ngày 91 và 1: 1.600 vào ngày thứ 154.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ẦẦẦẦẦ..50
miễn dịch lập lại trước khi hiệu giá huyết thanh giảm (cuối tháng thứ 2).
4.2.Nghiên cứu chế tạo chế phẩm lòng ựỏ trứng