Văc xin phòng bệnh lợn con tiêu chảy nói chung ắt có hiệu quả. Hiện có
một số văc xin dùng cho nái, phòng bệnh cho lợn con. Các văc xin này bao gồm các yếu tố bám dắnh, phổ biến là F4, F5, F6, F18ab,Ầ và ựộc tố ựường ruột ST hay LT [47, 67].
2.6.2.Chế phẩm lòng ựỏ trứng trong phòng trị lợn con tiêu chảy
Hiện nay, trên thế giới ựã có nhiều công trình nghiên cứu về sản xuất IgY; Yokoyama và cs (1992) thu hoạch trứng gà tách riêng lòng ựỏ sấy khô thành chế phẩm dạng bột. Trong 10 gam lòng ựỏ trứng, sau khi tách riêng protein, lipid và IgY, có thể thu ựược 15 mg IgY ở ựộ tinh khiết 93,8% [68].
Kháng thể IgY có bản chất protein, nhưng bền với nhiệt ựộ và pH. Hoạt tắnh trung hòa kháng thể kháng Ẹcoli không bị ảnh hưởng khi hấp thanh trùng ở 650C, 15 phút. Tại pH 4,0 IgY không bị biến tắnh.
Gây miễn dịch cho gà, kháng thể ựặc hiệu xuất hiện trong huyết thanh sau 8 ngày và trong trứng sau 10 ngày, ựạt hiệu giá cao nhất ở ngày thứ 15 và 20 ngày sau khi gây miễn dịch lần ựầu [52].
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ẦẦẦẦẦ..20
Khi bổ sung vào kháng nguyên gây miễn dịch một loại chất bổ trợ, C- phosphate-quanosine-oligodeoxynucleotide (CpG-ODN), hiệu quả ựáp ứng miễn dịch ựược nâng cao, hiệu quả ựiều trị của chế phẩm bột lòng ựỏ trứng hoàn thiện [44].
Công nghệ kháng thể dị loài trong ựiều trị ựã ựược áp dụng rộng rãi, trên nhiều ựối tượng khác nhaụ IgY-Hp (kháng thể lòng ựỏ trứng kháng
Helicobacter pylori) cho uống làm giảm thiểu nhiễm H. pylori. Tương tự,
kháng thể lòng ựỏ trứng ức chế sự sinh trưởng của Aeromonas hydrophila ở nồng ựộ 1,0 mg/ml trong thời gian ủ bệnh, giảm 70% tỷ lệ chết [45].
Nhật Bản ựược coi là một trong những cường quốc kháng thể lòng ựỏ trứng, chế phẩm kháng thể lòng ựỏ trứng dùng ựiều trị lợn con tiêu chảy bắt ựầu từ năm 1992, với tỷ lệ ựiều trị khỏi bệnh cao [68]. Akita và cs (1993) ựã sử dụng Ẹcoli toàn khuẩn sản xuất kháng thể ựặc hiệu lòng ựỏ trứng gà dùng trong phòng và trị bệnh tiêu chảy cho lợn con. Marquardt và cs (1999) ựã sử dụng kháng thể lòng ựỏ trứng gà miễn dịch kháng pili F4 ETEC ựể ựiều trị tiêu chảy cho lợn sơ sinh và cai sữạ Kết quả cho thấy lợn uống kháng thể lòng ựỏ trứng có khả năng kháng lại sự lây nhiễm ETEC [46].
Chế phẩm lòng ựỏ trứng ựược ựánh giá hiệu quả cao trong ựiều trị (ựánh giá thông qua gây bệnh thực nghiệm). Tuy nhiên phương pháp này tốn kém và chỉ có 81% lợn bị nhiễm (xác ựịnh yếu tố bám dắnh K88 bằng PCR) [55].
2.7.Nghiên cứu trong nước về phòng trị bệnh do Ẹcoli ở lợn
2.7.1.Văc xin
Nguyễn Thị Nội và cs (1978, 1984, 1986, 1989) ựã nghiên cứu sử dụng vắc xin trong phòng bệnh do Ẹcoli, các tác giả ựã lựa chọn các serotyp có tần suất cao ựể chế tạo vắc xin, dựa trên kết quả xác ựịnh serotyp O các chủng
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ẦẦẦẦẦ..21
tuần cho kết quả bảo hộ 30-40% so với ựối chứng [10-12].
Lê Văn Tạo và cs (1993, 1995) ựã chế tạo vắc xin Ẹcoli vô hoạt từ các chủng gây bệnh tiêu chảy lợn con có mang các yếu tố gây bệnh (Enterotoxin, Hly, ColV, F4, R). Lợn con uống văc xin giảm tỷ lệ bệnh từ 46% xuống còn 11%, giảm tỷ lệ chết từ 9% còn 2,2% [20], giảm tỷ lệ lợn con mắc bệnh phân trắng từ 31,0% ựến 34,6% và tỷ lệ chết do bệnh này từ 3,6- 6,8% [21].
Văc xin vô hoạt phòng bệnh phù ựầu cũng ựã ựược thử nghiệm, giảm tỷ lệ bệnh 20% ở một số tỉnh đồng bằng sông Cửu Long [14], ở Bình định và Hà Tây [16], ở Bắc Giang [9], bảo hộ 90% lợn không mắc bệnh phù ựầụ để nâng cao hiệu lực của văc xin phòng bệnh do Ẹcoli, văc xin tiểu phần có thể là một trong những hướng ưu tiên.
2.7.2.Kháng sinh và chế phẩm sinh học thay thế
Trong khi việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi vẫn còn phổ biến, kháng sinh trộn thức ăn là một biện pháp thông dụng ựể phòng bệnh, hiện tượng kháng kháng sinh ngày càng phổ biến [15, 18], việc giảm thiểu sự lạm dụng kháng sinh bắt ựầu ựược cân nhắc [19], các yếu tố liên quan ựến cơ chế lan truyền sự kháng thuốc cũng ựang ựược quan tâm [23].
Các thử nghiệm tìm dẫn xuất tự nhiên thay cho kháng sinh và sulfamid là một hướng nghiên cứu ưu tiên, như thử nghiệm sử dụng dịch chiết lá cây xuân hoa (P. palatiferum) ựiều trị lợn con tiêu chảy [4], sử dụng Becberin (kháng sinh chiết từ cây Hoàng Liên) ựiều trị tiêu chảy ở lợn con tập ăn [6]. Sinh phẩm Bacterin EBC tiêm dưới da liều 3ml/con ở lợn 3 ngày tuổi, không có phản ứng phụ [8]. Chế phẩm cao mật lợn, Vitom cho hiệu quả ựiều trị lành bệnh 75% [25]. Chế phẩm biosubtyl (men tiêu hoá sống chứa 105-106 CFU/g
Bacillus subtilis) làm giảm 42% tiêu chảy tái phát ở lợn con 1- 60 ngày [3].
Chế phẩm Ẹcoli sữa chế từ các vi khuẩn phân lập từ lợn con tiêu chảy [1], dùng cho lợn mẹ làm giảm tỷ lệ tiêu chảy từ 55,5% xuống còn 28,12% [8].
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ẦẦẦẦẦ..22
2.7.3.Kháng thể lòng ựỏ trứng
Cùng với các biện pháp miễn dịch thụ ựộng, như qua sữa ựầu của lợn mẹ, còn có thể sử dụng 1 lượng thắch hợp kháng thể ựặc hiệu, khác loài chống lại các chủng Ẹcoli ựộc, bổ sung vào thức ăn cho lợn con sẽ có tác dụng khống chế tiêu chảỵ Kháng thể dị loài sản xuất từ gà ựược gây miễn dịch cung cấp một phương pháp thay thế mới ựể ựiều trị các bệnh lây nhiễm.
Sinh phẩm lòng ựỏ trứng có 3 ựiểm thuận lợi: (1) do trứng gà là nguồn phong phú, dễ kiếm [24] kháng thể IgY có trong trứng gà có chất lượng cao, số lượng lớn, giá thành rẻ mà không phải giết vật thắ nghiệm, (2) Ngoài tác dụng ựặc hiệu, lòng ựỏ trứng còn có tác dụng bảo vệ niêm mạc ựường tiêu hoá của gia súc non (3) Kháng thể phi ựặc hiệu còn có tác dụng trung hoà ựộc tố và láng một lớp vỏ vật lý bảo vệ màng nhầy của ruột non [24], ngăn cản quá trình ựộc tố ựường ruột bám màng nhầy ruột non [52].
Các công ty thuốc thú y trong nước cũng bắt ựầu sản xuất chế phẩm lòng ựỏ trứng áp dụng trong ựiều trị bệnh lợn con tiêu chảy do Ẹcoli. Công ty
Hanvet chế tạo thành công kháng thể KTE kháng 11 chủng Ẹcoli ựộc.
Chế phẩm bột kháng thể YP-99, kháng các chủng Ẹcoli cùng nguồn với ẸRnl, ẸRn2 và ẸMa (mang yếu tố bám dắnh F5 và F6, vô hoạt bằng formol) có tác dụng ựiều trị lành bệnh 80,7% lợn con theo mẹ bị tiêu chảy [2].
Các nghiên cứu ựều nhằm nâng cao hiệu quả của chế phẩm lòng ựỏ trứng, hoàn thiện phương pháp chế kháng nguyên (rửa mặt thạch, vô hoạt), hoặc ựa dạng hóa chế phẩm (bột uống, thuốc tiêm), ựiều trị lành bệnh lợn con tiêu chảy sau 3 ngày [24].
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ẦẦẦẦẦ..23
3. PHẦN IIỊ NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1.đối tượng và nội dung nghiên cứụ 3.1.đối tượng và nội dung nghiên cứụ
đối tượng:
- Gà ựược gây miễn dịch bằng kháng nguyên F4 pili,
- Kháng thể lòng ựỏ trứng và chế phẩm kháng thể lòng ựỏ trứng, - Ẹcoli gây bệnh lợn con tiêu chảy,
- Lợn con bị tiêu chảy do Ẹcoli tại thời ựiểm cai sữa và ngay sau cai sữạ
Nội dung nghiên cứu:
1. Nghiên cứu chế tạo kháng thể lòng ựỏ trứng kháng Pili F4
(1) Nghiên cứu quy trình gây miễn dịch cho gà. (2) Nghiên cứu chế tạo chế phẩm lòng ựỏ trứng.
2. Nghiên cứu xác ựịnh liều ựiều trị bệnh lợn con tiêu chảy của chế phẩm lòng ựỏ trứng kháng pili F4
(1) Xác ựịnh nguyên nhân Ẹcoli gây tiêu chảy ở lợn con cai sữạ (2) Xác ựịnh biến ựộng kháng thể kháng F4 pili ở lợn con.
- Thu thập mẫu huyết thanh lợn con,
- Ab-ELISA xác ựịnh hiệu giá kháng thể kháng F4-pilị
(3) Nghiên cứu xác ựịnh liều ựiều trị bệnh lợn con tiêu chảy của chế phẩm lòng ựỏ trứng kháng F4-pilị
(4) Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm trong phòng trị lợn con tiêu chảy - Hiệu quả ựiều trị lợn con tiêu chảy sau cai sữạ
- Hiệu quả ựiều trị dự phòng.
3.2.địa ựiểm và thời gian nghiên cứu
địa ựiểm nghiên cứu: Bộ môn Hóa sinh Miễn dịch Bệnh lý, Viện Thú Y, - Phun sấy khô lòng ựỏ trứng tại Viện Công nghệ Thực phẩm,
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ẦẦẦẦẦ..24
- Trại lợn giống Cầu Diễn, Công ty Nhà nước một Thành viên Giống gia súc Hà Nộị
Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 5 năm 2009 ựến tháng 10 năm 2010.
3.3.Nguyên vật liệu
3.3.1.động vật thắ nghiệm và sinh phẩm.
- Gà hướng trứng (giống CP Brown) khỏe mạnh, ựược tiêm phòng các bệnh truyền nhiễm phổ biến Gumboro, Newcastle, cúm,
- Lợn con cai sữa ở trại chăn nuôi lợn giống Cầu Diễn,
- Kháng nguyên Pili của F4 (K88) Ẹcoli do Bộ môn Hóa sinh Miễn dịch
Bệnh lý, Viện Thú y cung cấp,
- Antipig-HRP-Conjugate: Cat. # A7042 do Sigma-Aldrich cung cấp, - Anti-Chicken Chicken IgY Polyclonal (Rabbit), Horseradish Peroxidase Conjugated: Cat. LS-C60281-1500, LifeSpan BioSciences,
- Taq DNA Polymerase Master mix 2x: Cat. # M5122, Promega, - Thang DNA 100 bp DNA chuẩn: Cat. #15628-019, Invitrogen.
3.3.2.Môi trường, hóa chất
- Hoá chất dùng trong phản ứng Ab-ELISA:
Coating buffer (Carbonate-Bicarbonate buffer PH=9,6): Cat. #C-304, do hãng Sigma-Aldrich cung cấp,
PBS (Photphate Buffer Saline): Cat. #P4417, Sigma-Aldrich, Cơ chất màu OPD (Ortho-phenylenediamine): Cat. S2045, DAKO, Tween 20: Cat. #40350-2, Cica-Reagent,
H2SO4: Cat. #S:1/2-26-30-45, Lachema,
Nước Oxy già 30% (H2O2): Cat. #S:3-28-36/39-45, Lachema, Sữa tách bơ ựộ béo ≤ 0.08% (Skim Milk): Cat. #92720, Marvel.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ẦẦẦẦẦ..25
- Hoá chất ựể làm phản ứng PCR:
Dung dịch TE 5 mM [(TrisBase-EDTA pH 7,0), EDTA Disodium: Cat. # H5031, Promega; Tris Base, Cat. # H5131, Promega)],
DNase free-water: Cat. #P119C, Promegạ
- Các loại hoá chất chạy ựiện di:
Agarose: Cat. #A9539 do hãng Sigma-Aldrich cung cấp, TAE Buffer (dung dịch mẹ 50x): Cat. #24710-030, Gibco, Ethidium Bromide: Cat. #E-1385, Sigma-Aldrich.
- Môi trường 3 ống nghiệm
KIA: Cat. #1.03913.0500 do hãng Merck cung cấp, Mannitol-Mobility: Cat. #1.05404.0500, Merck, Urea-Indole: Cat. #880239, Bio-Rad.
- Hoá chất chế môi trường nuôi cấy vi khuẩn:
Pepton: Cat. #M885 do hãng Himedia cung cấp, Agar: Cat. #3644679, Merck,
Yeast extract: Cat. #L21, OXOID,
BHI (Brain Heart Infusion): Cat. #1.10493.0500, Merck, Blood Agar base (thạch máu nền): Cat. #M089, Himediạ
- Hóa chất bảo quản huyết thanh
Natriazit (NaN3): Cat. #5224343, Merck.
- Bổ trợ dầu
Freund Complete Adjuvant: Cat. #F5881, do Sigma-Aldrich cung cấp.
- Hóa chất thông thường phòng thắ nghiệm. 3.3.3.Máy móc, trang thiết bị
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ẦẦẦẦẦ..26
Tủ ấm lắc chuyên dụng (Stat fax 2200, Awareness), Vortex (Genie), máy ựọc ELISA (Elx800, Biotek), hộp ựèn tử ngoại, máy PCR (Thermocycler), máy ựiện di (Biorad), máy sấy trứng Centrifuge spray dryer- LPG-5.
- Trang thiết bị dụng cụ thông thường phòng thắ nghiệm
Cân phân tắch, buồng cấy vô trùng (Biosafety Cabinet), nồi hấp, tủ sấy, tủ ấm, bể ấm, tủ lạnh 40C, tủ lạnh -300C, tủ lạnh -800C, tủ ấm CO2, ựèn UV.
Micro-pipette các loại 2 ộl, 10 ộl, 20 ộl, 100 ộl, 200 ộl, 1000 ộl và ựầu tip tương ứng.
Dụng cụ thông thường phòng thắ nghiệm: Ống nghiệm, ựĩa Petri, ựèn cồn, que cấy, pince, kéo, ựĩa ELISA 96 giếng, tấm dán ELISẠ
Bơm tiêm, bông cồn, ống ly tâm 14 ml; 50 ml; Eppendorf 0,2 ml và 1,5 ml, máng nhựa, giá ựựng, cốc xả týp và dung dịch.
3.4.Phương pháp nghiên cứu
3.4.1.Phương pháp phân lập và giám ựịnh vi khuẩn Ẹcoli Phương pháp chuẩn bị các môi trường nuôi cấy vi khuẩn Phương pháp chuẩn bị các môi trường nuôi cấy vi khuẩn
Các môi trường nuôi cấy, giám ựịnh ựặc tắnh sinh vật hóa học của Ẹcoli bao gồm nước thịt, thạch thường, thạch máu, thạch KIA, Mannitol-Mobility, Urea-IndoleẦựược chuẩn bị như thường quy phòng thắ nghiệm.
Phương pháp thu thập mẫu phân
Phân ựược lấy trực tiếp từ trực tràng của lợn con. Cố ựịnh lợn, dùng tăm bông ngoáy vào lỗ hậu môn, cho tăm bông vào ống Eppendorf có sẵn dung dịch bảo quản. Mẫu ựược ghi rõ ký hiệu, tắnh biệt, ngày tuổi và ngày lấy mẫụ Mẫu phân ựược bảo quản trong hộp lạnh và chuyển về phòng thắ nghiệm.
Phương pháp nuôi cấy, phân lập và giám ựịnh vi khuẩn Ẹcoli
Mẫu phân mới chuyển về phòng thắ nghiệm ựược nuôi cấy, phân lập giám ựịnh ựặc tắnh sinh vật hóa học và giám ựịnh PCR như thường quy và ựược tóm
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ẦẦẦẦẦ..27
tắt ở sơ ựồ hình 03-01.
Hình 03-01. Sơ ựồ phân lập và giám ựịnh vi khuẩn Ẹcoli
3.4.2.Phương pháp PCR xác ựịnh chủng F4 Ẹcoli Quy trình tách DNA vi khuẩn Quy trình tách DNA vi khuẩn
- Canh khuẩn nuôi cấy sau 16-18h/370C, lắc 220 vòng/ phút, - Lấy 50ộl canh khuẩn ly tâm 3000v/phút ở 40C, bỏ dịch lấy cặn, - Hòa tan cặn bằng 250 ộl nước cất, dùi thủng lỗ ống ựựng mẫu, - đun cách thủy 5 phút/1000C,
- Lập tức chuyển ống vi khuẩn ựã ựun vào ựá lạnh, giữ 3 phút, - Ly tâm 4000v/phút trong 4 phút ở 40C,
- Giữ trên ựá lạnh, dịch trong chứa DNA dùng làm sợi mẹ trong PCR.
Chuẩn bị mồi (Primer)
để xác ựịnh sự có mặt của gene mã hóa pili F4, các ựộc tố ựường ruột LT, Sta và STb, phương pháp PCR sử dụng cặp mồi ựặc hiệu có trình tự
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ẦẦẦẦẦ..28
nucleotide ở bảng 03-01.
Bảng 03-01. Trình tự nucleotide của các cặp mồi và sản phẩm nhân gene
Gene Trình tự nucleotide Sản phẩm (bp)
F4 GCA CAT GCC TGG ATG ACT GGTG
CGT CCG CAG AAG TAA CCC ACCT
499
LT ATT TAC GGC GTT ACT ACT CTC
TTT TGG TCT CGG TAC GAT AGT
272
STa TCC GTG AAA CAA CAT GAC GG
ATA ACA TCC AGC ACA GGC AG
158
STb GCC TAT GCA TCT ACA CAA TC
TGA GAA ATG GAC AAT GTC CG
133
Chuẩn bị Primer: Dung dịch mẹ primer 100 ộM (10 x nồng ựộ cho PCR) ựược chuẩn bị trong dung dịch TE pH 8,0, bảo quản ở -30OC. Trước khi tiến hành PCR, chuẩn bị dung dịch primer theo tỷ lệ 1/10 trong TE, dung dịch làm việc có nồng ựộ 10 ộM, dùng 1 ộl primer mỗi loại cho 25 ộl phản ứng.
Thành phần PCR
Chuẩn bị (trên ựá lạnh) trong mỗi phản ứng 25 ộl PCR trong ống PCR 0,2 ml thành mỏng bằng cách tuần tự thêm các chất và dung lượng như ở bảng 03-02; chạy máy PCR theo chương trình và chu trình nhiệt như bảng 03-03.
Bảng 03-02. Thành phần phản ứng PCR
TT Thành phần phản ứng Nồng ựộ Thể tắch (ộl)
1 Dnase-, Rnase- Free water Cat. #P119C, Promega 8,5
2 Sợi mẹ DNA 2
3 Mồi xuôi (các loại) 10 ộM 1
4 Mồi ngược (các loại) 10 ộM 1
5 Gotaq Green MasterMix 2x (Cat. # M5122, Promega) 12,5
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ẦẦẦẦẦ..29
Bảng 03-03. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR
Giai ựoạn Bước Tên Nhiệt ựộ (0C) Thời gian (phút) Số chu kỳ
A 1 Biến tắnh 94 5 1 1 Biến tắnh 94 1 2 Gắn mồi 52 1 B 3 Tổng hợp chuỗi 72 1 30 C 1 Tổng hợp chuỗi 72 10 1 D 1 Dừng 4 đến khi nhỏ gel 1
điện di sản phẩm PCR trên gel Agarose
- Thêm 0,8 gam Agarose (Cat. #A9539 Sigma-Aldrich) vào 40 ml dung dịch 1 x TAE (Cat. #24710-030, Gibco),
- đun sôi trong Microwave, 2 phút tạo dung dịch Agarose 2%,
- để nguội dung dịch tới 600C; ựổ gel vào khuôn nằm ngang ựã có gel- lược; ựể yên 20 phút cho tới khi gel ựông cứng; tháo bỏ lược.
- đặt gel Agarose vào khoang chạy, thêm dung dịch chạy ựiện di TAE 1 X ựến khi ngập gel.
- Nhỏ mẫu vào trong các giếng tương ứng của gel (không cần thêm