3. PHẦN IIỊ NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.8. Bố trắ thắ nghiệm phân tắch kháng thể F4 pili ở gà miễn dịch
Phân tắch 01: đáp ứng miễn dịch ở gà thắ nghiệm.
đáp ứng miễn dịch ở gà gây miễn dịch ựược phân tắch bằng ELISẠ Bảng 03-08. Sơ ựồ ELISA phát hiện kháng thể F4 ở huyết thanh gà.
Các ựối chứng Mẫu huyết thanh xét nghiệm lô 01
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A CC CC D0 D56 D112 D168 D224 B CC CC D7 D63 D119 D175 D0 C đC+1 đC+1 D14 D70 D126 D182 D7 D đC+2 đC+2 D21 D77 D133 D189 D14 E đC -1 đC -5 D28 D84 D140 D196 D21 F đC -2 đC -6 D35 D91 D145 D203 D28 G đC -3 đC -7 D42 D98 D154 D210 D35 H đC -4 đC -8 D49 D105 D161 D217 D42
Tổng số 528 mẫu huyết thanh gà qua 33 tuần gồm 396 mẫu huyết thanh gà thắ nghiệm và 132 mẫu huyết thanh gà ựối chứng, sử dụng phản ứng Ab-
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ẦẦẦẦẦ..39
Elisa ựể phát hiện hiệu giá kháng thể của gà theo các quy trình và ngày lấy mẫu khác nhaụ
Ab-ELISA ựược thực hiện tuần tự theo lô (lô 01, 02, 03 và ựối chứng) và theo ngày (tổng số 14 ựĩa). Kết quả dương tắnh huyết thanh học ựược chuyển sang tham số so sánh tương ựối gọi là RR (Relative ratio), cho phép so sánh mức dương tắnh giữa các ựĩa có cut off khác nhaụ
RR = OD mẫu/ Giá trị ngưỡng
Kết quả so sánh mức dương tắnh ở dạng biểu ựồ cột sẽ phản ánh sự khác nhau về ựáp ứng miễn dịch ở gà theo lô thắ nghiệm và biến ựộng của mức kháng thể ựặc hiệu theo thời gian (ựộ dài miễn dịch).
Phân tắch 02: So sánh ựáp ứng miễn dịch giữa các lô gà thắ nghiệm.
để so sánh hiệu giá kháng thể trong huyết thanh và trong lòng ựỏ trứng giữa các quy trình, tất cả các mẫu huyết thanh và trứng ngày thứ 35 của các lô ựược chọn ựể chuẩn ựộ.
Bảng 03-09. Sơ ựồ ELISA xác ựịnh ựộ chuẩn kháng thể F4 ở huyết thanh
và lòng ựỏ trứng (so sánh các quy trình) 1 2 Lô Mẫu 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A CC CC HT B CC CC đC LđT C đC+1 đC+1 HT D đC+2 đC+2 Lô 01 LđT E đC -1 đC -5 HT F đC -2 đC -6 Lô 02 LđT G đC -3 đC -7 HT H đC -4 đC -8 Lô 03 LđT Hiệu giá 1/x 100 200 400 800 1600 3200 6400 12800 25600 51200
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ẦẦẦẦẦ..40
Phân tắch 03: Biến ựộng kháng thể ở huyết thanh và lòng ựỏ trứng (phân
tắch biến ựộng hiệu giá kháng thể ở huyết thanh/lòng ựỏ trứng của mỗi lô thắ nghiệm theo thời gian).
Bảng 03-10. Sơ ựồ ELISA xác ựịnh ựộ chuẩn kháng thể F4 ở huyết thanh
và lòng ựỏ trứng 1 2 Hiệu giá 1/x 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A CC CC 200 B CC CC 400 C đC+1 đC+1 800 D đC+2 đC+2 1600 E đC -1 đC -5 3200 F đC -2 đC -6 6400 G đC -3 đC -7 12800 H đC -4 đC -8 25600
Ngày lấy mẫu D7 D14 D21 D28 D56 D91 D119 D154 D182 D224
Mẫu huyết thanh chuẩn ựộ: Mỗi bộ mẫu của 1 quy trình chọn 10 (ựủ 1 ựĩa ELISA chuẩn ựộ) mẫu tương ứng với D7, D14, D21, D28, D56, D91, D119, D154, D182 và D224.
Mẫu lòng ựỏ trứng chuẩn ựộ: tương ứng với ngày ở bộ mẫu huyết thanh. Tiến hành chuẩn ựộ theo sơ ựồ mẫu ở bảng 03-10. Như vậy mỗi quy trình, tiến hành 2 ựĩa chuẩn ựộ, 1 cho huyết thanh, 1 ựĩa cho lòng ựỏ trứng.
Phân tắch 04: Hiệu giá kháng thể ở sản phẩm trứng sấy khô.
Hoàn nguyên sản phẩm lòng ựỏ trứng ựã sấy khô, chuẩn ựộ kháng thể ựánh giá so sánh với hiệu giá kháng thể trước khi sấỵ
Hoàn nguyên: Cân 3 gam bột trứng sấy khô, hoàn nguyên trong 10 ml dung dịch PBS.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ẦẦẦẦẦ..41
Tuỳ thuộc vào lượng bột trứng sấy khô trong thành phẩm mà xác ựịnh hiệu giá ban ựầu của dung dịch hoàn nguyên. Thắ dụ: 1g bột sấy khô nguyên chất khi hoàn nguyên trong 10 ml PBS có ựộ pha loãng ban ựầu là 3/10 vì 3 gam lòng ựỏ trứng sau khi sấy ựược 1 gam bột khô. Tương tự nếu sản phẩm ựược làm từ hỗn hợp 1 gam bột trứng + 9 gam tá dược thì ựộ pha loãng ban ựầu theo cách hoàn nguyên này ựược tắnh là 3/100) trước khi thực hiện Elisa cần ựưa dung dịch hoàn nguyên về cùng ựộ pha loãng khởi ựiểm (1/50 và 1/100 tuỳ theo thiêt kế của Elisa), nghĩa là 33 ộl dung dịch hoàn nguyên của bột trứng 1/10 + 67 ộl PBS cho ựộ pha loãng lòng ựỏ trứng khởi ựiểm là 1/100.
Tiến hành ELISA chuẩn ựộ như ở bảng 03-09 hoặc 03-10.