3. PHẦN IIỊ NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.2. Phương pháp PCR xác ựịnh chủng F4 Ẹcoli
Quy trình tách DNA vi khuẩn
- Canh khuẩn nuôi cấy sau 16-18h/370C, lắc 220 vòng/ phút, - Lấy 50ộl canh khuẩn ly tâm 3000v/phút ở 40C, bỏ dịch lấy cặn, - Hòa tan cặn bằng 250 ộl nước cất, dùi thủng lỗ ống ựựng mẫu, - đun cách thủy 5 phút/1000C,
- Lập tức chuyển ống vi khuẩn ựã ựun vào ựá lạnh, giữ 3 phút, - Ly tâm 4000v/phút trong 4 phút ở 40C,
- Giữ trên ựá lạnh, dịch trong chứa DNA dùng làm sợi mẹ trong PCR.
Chuẩn bị mồi (Primer)
để xác ựịnh sự có mặt của gene mã hóa pili F4, các ựộc tố ựường ruột LT, Sta và STb, phương pháp PCR sử dụng cặp mồi ựặc hiệu có trình tự
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ẦẦẦẦẦ..28
nucleotide ở bảng 03-01.
Bảng 03-01. Trình tự nucleotide của các cặp mồi và sản phẩm nhân gene
Gene Trình tự nucleotide Sản phẩm (bp)
F4 GCA CAT GCC TGG ATG ACT GGTG
CGT CCG CAG AAG TAA CCC ACCT
499
LT ATT TAC GGC GTT ACT ACT CTC
TTT TGG TCT CGG TAC GAT AGT
272
STa TCC GTG AAA CAA CAT GAC GG
ATA ACA TCC AGC ACA GGC AG
158
STb GCC TAT GCA TCT ACA CAA TC
TGA GAA ATG GAC AAT GTC CG
133
Chuẩn bị Primer: Dung dịch mẹ primer 100 ộM (10 x nồng ựộ cho PCR) ựược chuẩn bị trong dung dịch TE pH 8,0, bảo quản ở -30OC. Trước khi tiến hành PCR, chuẩn bị dung dịch primer theo tỷ lệ 1/10 trong TE, dung dịch làm việc có nồng ựộ 10 ộM, dùng 1 ộl primer mỗi loại cho 25 ộl phản ứng.
Thành phần PCR
Chuẩn bị (trên ựá lạnh) trong mỗi phản ứng 25 ộl PCR trong ống PCR 0,2 ml thành mỏng bằng cách tuần tự thêm các chất và dung lượng như ở bảng 03-02; chạy máy PCR theo chương trình và chu trình nhiệt như bảng 03-03.
Bảng 03-02. Thành phần phản ứng PCR
TT Thành phần phản ứng Nồng ựộ Thể tắch (ộl)
1 Dnase-, Rnase- Free water Cat. #P119C, Promega 8,5
2 Sợi mẹ DNA 2
3 Mồi xuôi (các loại) 10 ộM 1
4 Mồi ngược (các loại) 10 ộM 1
5 Gotaq Green MasterMix 2x (Cat. # M5122, Promega) 12,5
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ẦẦẦẦẦ..29
Bảng 03-03. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR
Giai ựoạn Bước Tên Nhiệt ựộ (0C) Thời gian (phút) Số chu kỳ
A 1 Biến tắnh 94 5 1 1 Biến tắnh 94 1 2 Gắn mồi 52 1 B 3 Tổng hợp chuỗi 72 1 30 C 1 Tổng hợp chuỗi 72 10 1 D 1 Dừng 4 đến khi nhỏ gel 1
điện di sản phẩm PCR trên gel Agarose
- Thêm 0,8 gam Agarose (Cat. #A9539 Sigma-Aldrich) vào 40 ml dung dịch 1 x TAE (Cat. #24710-030, Gibco),
- đun sôi trong Microwave, 2 phút tạo dung dịch Agarose 2%,
- để nguội dung dịch tới 600C; ựổ gel vào khuôn nằm ngang ựã có gel- lược; ựể yên 20 phút cho tới khi gel ựông cứng; tháo bỏ lược.
- đặt gel Agarose vào khoang chạy, thêm dung dịch chạy ựiện di TAE 1 X ựến khi ngập gel.
- Nhỏ mẫu vào trong các giếng tương ứng của gel (không cần thêm loading dye vì Gotaq Green MasterMix ựã có dye); nhỏ thang DNA 1 giếng (Cat. #15628-019, Invitrogen).
- Chạy ựiện di ở 100 Vol trong 30 phút.
- Nhuộm gel trong Ethidium Bromide (Cat. #E-1385, Sigma-Aldrich) 5ộg/ml trong 10 phút.
- Kiểm tra sản phẩm PCR trên ựèn UV, chụp ảnh.