Đánh giá quy trình sản xuất cao hy thiêm làm nguyên liệu sản xuất thuốc hy đan

Ở nước ta, định hướng phát triển thuốc từ dược liệu đã và đang được Cục Quản lý dược – Bộ Y tế đưa ra lộ trình và hướng dẫn cho các doanh nghiệp sản xuất thuốc bởi Việt Nam là quốc gia c

SẢN XUẤT THUỐC HY ĐAN

LUẬN VĂN DƯỢC SĨ CHUYÊN KHOA CẤP I

HÀ NỘI 2015

SẢN XUẤT THUỐC HY ĐAN

LUẬN VĂN DƯỢC SĨ CHUYÊN KHOA CẤP I

CHUYÊN NGÀNH: CND & BC

MÃ SỐ:

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Văn Hân

Nơi thực hiện: Trường ĐH Dược Hà Nội

Công ty CP Dược VTYT Thanh Hóa Thời gian thực hiện: Tháng 1 đến tháng 5 năm 2015

Theo Quyết định số 42/QĐ-DHN

HÀ NỘI 2015

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Hân – Bộ môn Công nghiệp dược, trường ĐH Dược Hà Nội đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ và chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình tác giả thực hiện đề tài

Tôi xin trân trọng cám ơn Lãnh đạo Công ty CP dược VTYT Thanh hóa, lãnh đạo nhà máy Đông dược, các phòng ban chức năng của công ty

đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi tìm hiểu và nghiên cứu, hướng dẫn và chỉ bảo tận tình giúp tôi hoàn thành khóa luận

Xin trân trọng cám ơn Ban giám hiệu, Phòng sau đại học, các thầy cô trường ĐH Dược Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu

Trong quá trình nghiên cứu và viết luận văn, tôi còn nhận được sự giúp đỡ rất nhiệt tình và những ý kiến đóng góp của TS Phương Thiện Phương – Khoa Hóa phân tích tiêu chuẩn Viện dược liệu Tôi xin chân thành cám ơn sự giúp đỡ quý báu đó

Và xin gửi cảm ơn gia đình, các bạn bè đồng nghiệp đã ủng hộ, chia

sẻ và động viên tôi trong học tập cũng như trong cuộc sống

Dù đã có rất nhiều cố gắng, song đề tài còn có thể có những thiếu sót Kính mong nhận được sự chia xẻ và nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của các thầy cô giáo, các bạn đồng nghiệp

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Tác giả đề tài

Nguyễn Xuân Thành

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Cây Hy thiêm 3

1.1.1 Nguồn gốc và tên khoa học 3

1.1.2 Đặc điểm hình thái 3

1.3.3 Phân bố và bộ phận dùng 4

1.2 Thành phần hóa học của cây hy thiêm 4

1.3 Công dụng và tác dụng sinh học của hy thiêm 8

1.3.1 Công dụng 8

1.3.2 Tác dụng sinh học 12

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Nguyên liệu 15

2.2 Dung môi và hóa chất 15

2.3 Thiết bị và phương tiện nghiên cứu 15

2.3.1 Thiết bị sử dụng cho kiểm nghiệm 15

2.3.2 Hệ thống chiết xuất của nhà máy sản xuất thuốc đông dược, công suất 130-170 kg/mẻ: 16

2.4 Phương pháp thực nghiệm: 18

2.4.1 Phương pháp xác định độ ẩm của dược liệu 18

2.4.2 Xác định khối lượng riêng biểu kiến 18

2.4.3 Phương pháp chiết xuất hy thiêm 18

2.4.4 Phương pháp định tính acid clorogenic và rutin trong dược liệu bằng

sắc ký lớp mỏng: 19

2.4.5 Phương pháp định lượng clorogenic acid và rutin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 20

2.5 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 23

2.5.1 Xây dựng TCCS dược liệu Hy thiêm 23

2.5.2 Đánh giá ảnh hưởng của độ mịn dược liệu 24

2.5.3 Đánh giá ảnh hưởng của số lần chiết xuất 24

2.5.4 Đánh giá ảnh hưởng của thời gian chiết xuất 24

2.5.5 Đánh giá 2 phương pháp cô đặc 25

2.5.6 Đề xuất quy trình sản xuất cao hy thiêm 25

2.5.7 Triển khai sản xuất cao Hy thiêm 25

2.6 Thời gian và địa điểm thực hiện nghiên cứu 25

CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 26

3.1 Xây dựng TCCS dược liệu Hy thiêm 26

3.2 Đánh giá ảnh hưởng của độ mịn dược liệu 31

3.3 Đánh giá ảnh hưởng của số lần chiết xuất 32

3.4 Đánh giá ảnh hưởng của thời gian chiết xuất 33

3.5 Đánh giá 2 phương pháp cô đặc 35

3.6 Đề xuất quy trình sản xuất cao hy thiêm 36

3.7 Triển khai sản xuất cao Hy thiêm 36

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 38

4.1 Về nguồn nguyên liệu Hy thiêm 38

4.2 Về xây dựng các tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu và cao Hy thiêm 38

4.3 Về quy trình chiết xuất Hy thiêm 39

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39

Kết luận 39

Đề xuất 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH SÁCH CÁC KÝ HIỆU, CHŨ VIẾT TĂT

AC : Acid clorogenic BuOH : Buthanol

CHCl3 : Cloroform

DL : Dược liệu EtOAc : Ethyl acetat EtOH : Ethanol HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao TLC : Sắc ký lớp mỏng

MeOH : Methanol

SP : Sản phẩm

TB : Trung bình TLC : Sắc ký lớp mỏng

TT : Thứ tự tt/kl : Thể tích/ khối lượng tt/tt : Thể tích/ thể tích

GĐ : Giai đoạn

HS : Hiệu suất

HL : Hàm lượng

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

Trang Bảng 1: Danh mục thiết bị sử dụng cho kiểm nghiệm, phân tích 15 Bảng 2 : Điều kiện sắc ký lỏng hiệu năng cao 21 Bảng3: Hàm lượng hoạt chất trong các mẫu hy thiêm 30 Bảng 4: Ảnh hưởng của độ mịn dược liệu đến hiệu suất và chất

lượng cao

32

Bảng 5: Hiệu suất chiết của từng lần chiết 33 Bảng 6: Ảnh hưởng của thời gian chiết xuất 34 Bảng 7: Đánh giá 02 phương pháp cô đặc 35

Bảng 8: Hiệu suất chiết xuất và hàm lượng hoạt chất trong sản

phẩm theo quy trình chiết xuất đề xuất

37

Hình 1 Sắc ký đồ TLC của các mẫu dược liệu Hy thiêm 27 Hình 2 Sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử dược liệu Hy thiêm 29

Sơ đồ 1 Hệ thống chiết xuất của nhà máy sx thuốc Đông dược

Công ty cổ phần Dược VTYT Thanh Hóa 17

Sơ đồ 2 Sơ đồ quy trình chiết xuất cao Hy thiêm 19

ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, không chỉ Việt Nam mà trên thế giới, với xu hướng “trở về thiên nhiên” thì việc sử dụng các thuốc từ dược liệu của người dân ngày càng tăng hơn so với việc sử dụng thuốc tân dược Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), khoảng 80% dân số tại các quốc gia đang phát triển, việc chăm sóc sức khoẻ ít nhiều có liên quan đến YHCT hoặc thuốc từ dược thảo truyền thống để bảo vệ sức khoẻ Thế giới đang có xu hướng định hình lại phương pháp nghiên cứu tìm ra các thuốc mới Thay vì chỉ chú trọng đến việc tổng hợp hóa học trong phòng thí nghiệm với nhiều khó khăn và nhiều độc tính, các nhà khoa học dược, các tập đoàn dược phẩm lớn hiện đang chú trọng vào sàng lọc từ thiên nhiên để tìm ra các hoạt chất sinh học mới có dược tính mạnh hơn, ít độc hơn Hướng tân dược hóa thuốc đông dược đã và đang phát triển mạnh ở nhiều nước có nền công nghiệp dược phẩm tiên tiến như Mỹ, Pháp, Nhật Bản, Hàn Quốc, Ấn Độ và đặc biệt là ở Trung Quốc

Ở nước ta, định hướng phát triển thuốc từ dược liệu đã và đang được Cục Quản lý dược – Bộ Y tế đưa ra lộ trình và hướng dẫn cho các doanh nghiệp sản xuất thuốc bởi Việt Nam là quốc gia có tiềm năng lớn về dược liệu trong khu vực Đông Nam Á Dược liệu thuốc Nam sẽ đưa ngành dược Việt Nam hội nhập quốc tế bởi thị trường tiêu thụ dược liệu và các sản phẩm dược liệu là rộng lớn với thói quen, truyền thống phòng và chữa bệnh bằng Y học cổ truyền của nhân dân, đồng thời do không dùng lý luận phức tạp nên thuốc Nam dễ dàng được chứng minh tác dụng trên cơ sở khoa học hiện đại Từ nghiên cứu hóa thực vật đến nghiên cứu tác dụng dược lý thực nghiệm và lâm sàng đều có thể thực hiện được nhằm xác định rõ thành phần, cơ chế, tác dụng của thuốc Điều này phù hợp quan điểm của các nước phát triển trong việc phát triển thuốc mới

Năm bắt xu hướng và tình hình trên, công ty cổ phần dược VTYT Thanh Hóa đã hoàn thành xây dựng nhà máy sản xuất thuốc từ dược liệu đạt tiêu chuẩn ”Thực hành tốt sản xuất thuốc - GMP – WHO” từ tháng 4 năm 2013 Công ty đã và đang từng bước nghiên cứu, phát triển các sản phẩm thuốc từ dược liệu, trong đó viên hoàn trị phong tê thấp Hy đan - một trong những sản phẩm truyền thống, gắn liền với thương hiệu đang được là sản phẩm đang công ty tập trung nghiên cứu nâng cao chất lượng sản phẩm với định hướng kiểm soát chất lượng dược liệu ban đầu, chất lượng và hiệu quả quy trình sản xuất

Từ tình hình thực tiễn như trên, nhằm góp phần nâng cao chất lượng sản phẩm Hy đan đồng thời tiết kiệm tối đa chi phí sản xuất, nâng cao sức

cạnh tranh của sản phẩm thuốc Hydan, đề tài “Đánh giá quy trình chiết xuất cao mềm Hy thiêm định chuẩn làm nguyên liệu sản xuất thuốc Hy đan” được thực hiện với những mục tiêu:

1 Xây dựng được tiêu chuẩn dược liệu Hy thiêm làm nguyên liệu chiết xuất cao Hy thiêm phục vụ cho sản xuất thuốc Hydan

2 Đánh giá một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình chiết xuất Hy thiêm

và đề xuất quy trình chiết xuất với các thông số tối ưu trên hệ thống thiết bị của nhà máy sản xuất thuốc đông dược

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Cây Hy thiêm

1.1.1 Nguồn gốc và tên khoa học

Cây thuốc hy thiêm được dùng phổ biến hiện nay trong y học cổ

truyền và công nghiệp dược ở Việt Nam có tên khoa học Siegesbeckia

orientalis L thuộc họ Cúc - Asteraceae Còn có tên gọi khác là cỏ đĩ, chó

đẻ hoa vàng [1] [2] [4] Giải thích tên gọi khác nhau này theo Đỗ Tất Lợi

[3], cây hy thiêm ban đầu được dùng tại nước Sở (miền nam Trung Quốc) dân địa phương gọi lợn là hy, gọi cỏ có vị đắng cay có độc là thiêm Vì vị của cây này có mùi như con lợn nên gọi là hy thiêm Tên cứt lợn là tên dịch nghĩa Việt của câu này, do vậy cần phân biệt với các loại khác cũng được

gọi là cứt lợn như Ageratum conyzoides hay Lantana camara Tên gọi cỏ đĩ

là do cây này có chất dính vào người đi qua nó

1.1.2 Đặc điểm hình thái

Hy thiêm là cây thân thảo (cỏ), sống hàng năm, cao từ 30 - 90 cm Phân nhiều cành nằm ngang có lông, lá mọc đối hình quả trám, có khi tam giác hay hình thoi mũi mác, dài 4 - 10 cm, rộng 3 - 6 cm, cuống ngắn phiến lá men theo cuống, đầu nhọn mép lá có răng cưa không đều và đôi khi chia đều ở phía cuống, 3 gân chính mảnh, mặt dưới lá hơi có lông Cụm hoa hình ngù có lá, đầu màu vàng có cuống dài từ 1 - 2 cm, mảnh, có lông Năm lá bắc ngoài to, hình thìa mặt trong có lông dính, mặt ngoài có tuyến,

lá bắc trong hình trái xoan ngược, hoa màu vàng, 5 cái ngoài là hoa cái hình lưỡi, những hoa khác lưỡng tính hình ống, không có mào lông, tràng

có lưỡi ngắn Quả bế hình trứng có 5 cạnh, góc nhẵn tròn ở đỉnh, gốc thuôn dần, nhẵn, màu đen [4]

1.3.3 Phân bố và bộ phận dùng

Ở Việt Nam cây hy thiêm phân bố rộng cả về kinh độ và vĩ độ Thường mọc rải rác ở trung du, miền núi và đồng bằng từ các tỉnh Lào Cai đến Nghệ An, có gặp ở một số tỉnh Tây Nguyên Hy thiêm thuộc loại cây thảo, thường mọc ở những nơi đất tương đối ẩm và màu mỡ, trên các nương rẫy

Ở những khu đất ẩm màu mỡ trên các bãi sông, triền sông, trong các thung lũng, nương rẫy, ruộng hoang, ruộng trồng ngô hoặc trong vườn nhà màu

mỡ thường gặp hy thiêm mọc hoang [3]

Vùng trung du, đồng bằng Bắc Trung bộ của Việt Nam, hy thiêm thường mọc vào đầu mùa xuân (tháng 1 - 2); ra hoa kết quả từ tháng 3 - 6, cây lụi vào cuối mùa hè (tháng 7 - 8) Miền núi cao trên 800 m trở lên so với mặt biển, hàng năm cây mọc vào cuối mùa xuân (tháng 3 - 4); ra hoa kết quả vào mùa thu (tháng 9 - 10), tàn lụi vào đầu mùa đông (tháng 11 - 12) [5]

Hạt hy thiêm trong tự nhiên có thời gian ngủ nghỉ dài dưới đất, cây mọc theo thời vụ trong điều kiện độ ẩm của đất cao 80 - 90% trở lên, nhiệt

độ không khí từ 25 - 270

C Tỷ lệ cây mọc ngoài tự nhiên rất thấp, ước tính khoảng 2 - 3% [4]

1.2 Thành phần hóa học của cây hy thiêm

Các nghiên cứu về cây hy thiêm cho thấy, thành phần hóa học chính của

cây này (và các loài cùng chi Siegesbeckia) gồm các terpenoid và

flavonoid Các terpenoid gồm chủ yếu là diterpenoid thuộc nhóm pimaran các glycosid của chúng và các sesquiterpen

ent-Năm 2004, Xiang và cộng sự phát hiện 8 hợp chất ent-pimaran diterpenoid và diterpenoid glycosid mới cùng với các diterpen đã biết [20] Cũng nhóm tác giả này vào năm tiếp theo đã phân lập được 5 chất thuộc

nhóm sesquiterpenoid Gần đây, Wang và cộng sự đã tìm ra 6 hợp chất pimaran diterpenoid mới từ dịch chiết ethanol hy thiêm [24]

ent-Các nghiên cứu cũng khẳng định, thành phần hóa học của hy thiêm Việt nam có chủ yếu diterpenoid (darutosid, orientin, orientalid) và flavonoid Nguyen Hai Nam đã phân lập được hai diterpen từ hy thiêm đặt tên là kirenol và pubetalin và đã chứng minh độc tính trên tế bào ung thư của 2 chất này [19] Lê Thị Kiều Nhi đã phân lập được trong hy thiêm Việt nam

có flavonoid và các terpenoid (darutosid) Trong đó rhamnoglucosid (rutin), một hoạt chất tự nhiên có nhiều ứng dụng điều trị, với hàm lượng xác định được là 0,0185% tính theo dược liệu khô Trong phân đoạn n-butanol, hàm lượng này là 2,65% [9] Năm 2004, Phan Minh Giang phát hiện một ent-pimaran glucosid mới trong cây hy thiêm và đặt tên là hythiemosid B [15]

Theo Võ Văn Chi [1], toàn cây hy thiêm có chất đắng daturosid, orientin (diterpen lacton) và 3,7 dimethyl quercetin

Theo Viện Dược liệu [4], hy thiêm có chứa daturosid (chất này thuỷ phân cho glucose và darutugenol), orientin, orientalid và 3,7 dimethylquercetin: Theo Phạm Trương Thị Thọ, Phạm Duy Mai [8], trong lá hy thiêm

S.orientalis L chứa Daturosid và darutigenol Bằng phương pháp chiết

tách, các tác giả đã tách được 2 nhóm chất, trong đó nhóm I có tác dụng chống viêm liều cao, nhóm II có tác dụng rõ ràng chống viêm trên chuột, đây có thể là hoạt chất chống viêm của hy thiêm

Một số tác giả nước ngoài; Nam Koo Dong, Kim Ja Hoan [14] cho rằng trong hy thiêm có một chất đắng không phải là ancaloid hay glucozid gọi là darutin dẫn xuất của acid salicylic Các tác giả đã tách được 5 diterpenoids

từ cây hy thiêm lông Siegesbeekia pubescens Makino:

Rutin

HythiemosidB Pubetalin

Kirenol

Ent -Pimarane Diterpenoids

1.3 Công dụng và tác dụng sinh học của hy thiêm

1.3.1 Công dụng

Theo y học cổ truyền, hy thiêm có vị đắng, tính hàn, hơi có độc, qui vào hai kinh can và thận Hy thiêm có tác dụng khử phong thấp, lợi gân cốt [3] Dược liệu này được dùng khá phổ biến trong đông y để điều trị phong thấp, tê bại, khớp sưng nóng đỏ và đau nhức, đau lưng mỏi gối, mụn nhọt,

lở ngứa, có kinh nguyệt không đều

Vị thuốc hy thiêm có trong nhiều bài thuốc y học cổ truyền Theo Đỗ Tất Lợi [3], hy thiêm được sử dụng chủ yếu để chữa các bệnh phong tê thấp hoặc thấp khớp Một số bài thuốc tiêu biểu được áp dụng phổ biến trong dân gian như sau:

* Chữa phong tê thấp

- Theo Hải Thượng Lãn Ông, nếu phong đau nên dùng:

Hy thiêm 80g, Vỏ Chân chim 80g, rễ Cỏ chỉ 80g, rễ Sung súc 80g, rễ cây Bươm bướm 60g, cây Bấn đỏ 40g, cây Bấn trắng 40g, Ô dược 40g, Cỏ xước 40g, rễ Bưởi bung 40g, Cỏ roi ngựa 24g, cây Bạc thau, cỏ Nụ áo, Ngò đất

Nếu là phong tê: dùng các vị nêu trên + rau Đắng đất

- Theo kinh nghiệm cổ truyền:

Trị phong thấp: Hy thiêm thảo 100g, Thiên niên kiện 50g, ngày uống

2 lần trước khi ăn

Trị phong thấp, tê mỏi, đau nhức xương: dùng cao mềm Hy thiêm 30g, bột Hy thiêm 20g, bột Thiên niên kiện 10g, bột Xuyên khung 5g làm thành viên như hạt ngô đồng Ngày uống 2 lần sau bữa ăn, mỗi lần 4 - 5 viên

Chữa miệng méo, mắt xếch, phong thấp đau nhức: dùng Hy thiêm thảo 10g bột, chưng 9 lần luyện mật làm viên bằng hạt ngô uống 2 lần/ngày với rượu nóng

Chữa phong tê thấp thân nhiệt, hay chân tê bại, đau lưng, buốt xương, đau các khớp, lưng gối đau mỏi: dùng hy thiêm rửa sạch phơi khô, rưới rượu và mật vào, đồ lên rồi phơi, lại tẩm, đồ và phơi 9 lần, sấy khô, tán nhỏ, viên với mật, uống mỗi ngày 10-15g Hoặc dùng Hy thiêm 50g, Ngưu tất 20g, Thổ phục linh 20g, Lá lốt 10g làm bột ngày uống 3 lần, mỗi lần 10-15g

Chữa bại liệt nửa người, theo danh y Lê Kinh Hạp đời Tự Đức đã ghi đơn cao Hy thiêm , Máu mào gà [3]

Chữa sốt rét cơn lâu ngày, đờm đọng hoặc tức đầy không muốn ăn: Dùng Hy thiêm tươi giã nhỏ, chế nước sôi vào, vắt lấy nước cốt uống một chén (30ml), uống nhiều thì nôn ra đờm

* Trị viêm khớp

- Chữa viêm khớp dạng thấp: Hy thiêm 16g, rễ Vòi voi 16g, Thổ phục linh 16g, Ngưu tất 12g, rễ Huyết đằng 12g, Sinh địa 12g, Nam độc lực 10g,

rễ cây Cà gai leo 10g, rễ cây Cúc áo 10g, Huyết dụ 10g

- Chữa viêm đa khớp dạng thấp: dùng Hy thiêm thảo 2g sắc nước cốt gia thêm đường đen, cô lại thành cao, lần uống 1 chén trà nhỏ, ngày uống 2 lần

- Chữa giai đoạn sớm của viêm đa khớp dạng thấp, đau nhức khớp:

Hy thiêm 16g, Ngưu tất 16g, Thổ phục linh 12g, Ké đầu ngựa 12g, cành Dâu 12g, Cà gai leo 12g, Tỳ giải 12g, Lá lốt 10g [3]

Theo Viện dược liệu, hy thiêm còn được dùng để chữa một số bệnh khác như:

* Chữa cao huyết áp

Hy thiêm 8g, Ngưu tất 6g, Thảo quyết minh 6g, Hoàng cầm 6g, Trạch tả 6g, Chi tử 4g, Long đởm thảo 4g sắc uống ngày một thang hoặc dùng dạng chè thuốc (Tài nguyên cây thuốc Việt Nam)

- Hy thiêm thảo, Hoè hoa mỗi thứ 5 chỉ sắc uống Lại có tác dụng an thần, cũng có thể dùng nó trong suy nhược thần kinh, mất ngủ (Lâm Sàng Thường Dụng Trung Dược Thủ Sách)

* Chữa chàm: (Nhị rượu thang gia giảm)

Hy thiêm 12g, Hoàng bá 12g, Ké đầu ngựa 12g, Bình phù 12g, Bạch tiên bì 12g, Thương truật 8g, Phòng phong 8g

* Trị ung nhọt sung độc, các chứng lở dữ

Đinh nhọt sưng độc, vào tết Đoan ngọ hái Hy thêm thảo phơi khô tán bột, lần uống nửa lượng với rượu nóng, khi mồ hôi ra là đạt, rất có hiệu quả (Tập Giản Phương)

* Trị ăn vào bị nôn mửa ra

Dùng Hy thiêm thảo sấy khô tán bột luyện mật làm viên uống với nước nóng (Bách Nhất Tuyên Phương)

* Những người bị chó cắn, cọp cắn, nhện cắn…

Giã nát Hy thiêm thảo mà đắp đều khỏi cả (bản thảo thập di) [4]

Hiện tại trên, trên thị trường có rất nhiều chế phẩm có chứa dịch chiết

Hy thiêm thiêm dưới các dạng bào chế hiện đại và cũng chủ yếu điều trị các bệnh về khớp như thống phong, viêm khớp dạng thấp như:

1 Traly Gout (Hy thiêm thảo, dây đau xương, thổ phục linh, hổ trượng căn,

ba kích, tỳ giải, đào nhân, hoàng bá)

2 Gút Tuệ linh (Hy thiêm thảo, dây đau xương, nhũ hương, nhân sâm,

hoàng bá, đỗ trọng, đào nhân, nghệ vàng, thục địa, thổ phục linh, tỳ giải)

3 Hoàng Thấp Linh (bạch thược, Hy thiêm, sói rừng, nhũ hương,

pregnilolon, L-carnitin fumarat, magnesium)

4 Phong tê thấp (Hà thủ ô đỏ, thổphục linh,phòng kỷ, hy thiêm, thương nhĩ

tử, thiên niên kiện) - Thuốc nước uống của Công ty TNHH Dược phẩm Fito Pharma

5 Tuzamin (Tục đoạn, phòng phong, hy thiêm, độc hoạt, tần giao, bạch

thược, ngưu tất, thiên niên kiện ) Viên nang Công ty CP Dược Trung ương Mediplantex

6 Viên phong thấp Fengshi-OPC (Mã tiền chế, hy thiêm, ngũ gia bì, tam

thất - Viên nang Công ty CP dược phẩm OPC

7 Vương thảo thấp khớp hoàn (Tục đoạn, phòng phong, hy thiêm, độc

hoạt, tần giao, bạch thược, ngưu tất, thiên niên kiện ) Công ty TNHH dược phẩm Thiên Thảo

8 Xi xian feng shi wa (Hy thiêm thảo, L.,radix clematidis, Ramulus Mori, radix Stephaniae tetrandrae), viên hydan (Hy thiêm, vỏ ngũ gia bì chân chim, mã tiền chế) …

Trong y học Trung Quốc, Hy thiêm được dùng phối hợp với các cây thuốc khác để điều trị ung thư, chảy máu não kèm theo chứng liệt Ở một số nơi,

Hy thiêm được dùng với tác dụng gây liền sẹo ở bên ngoài và bên trong cơ thể, dịch ép rễ Hy thiêm trị vết thương, cao toàn phần có tác dụng kháng khuẩn, trị tổn thương da, bệnh hoa liễu và nấm da, làm thuốc tẩy và chống nôn [4] Tại Bangladesh, Hy thiêm là một trong các cây thuốc được dùng phổ biến để phòng và điều trị các bệnh liên quan đến tim mạch [106]

1.3.2 Tác dụng sinh học

* Tác dụng chống viêm

Nghiên cứu trên chuột cống trắng cho thấy lá Hy thiêm có tác dụng ức chế khá mạnh viêm cấp tính trên mô hình gây phù bàn chân chuột và ức chế viêm mạn tính, gây teo tuyến ức chuột cống non Hơn nữa, hy thiêm còn có tác dụng giảm tỷ lệ  - globulin trong huyết thanh khi dùng phối hợp trong bài thuốc gồm hy thiêm, mộc qua, thiên niên kiện và ngưu tất [4] Kirenol phân lập từ hy thiêm đã được chứng minh có tác dụng chống viêm, giảm đau tại chỗ trên chuột thực nghiệm [22] Hiện nay, cơ chế chống viêm của hy thiêm chưa được xác định, tuy nhiên có tác giả chứng minh hy thiêm ức chế không rõ rệt COX-2 và iNOS (inducible nitric oxide synthase) [17], [23]

Theo Đoàn Thị Nhu [6], lá hy thiêm có tác dụng ức chế rõ rệt giai đoạn viêm cấp tính và ức chế yếu giai đoạn viêm mãn tính thực nghiệm Độc tính cấp của hy thiêm tương đối thấp (77,5g/kg trọng lượng) Do đó có thể bào chế các thuốc điều trị bệnh khớp

* Tác dụng chống oxi hóa

Dịch chiết methanol và ethyl acetat của hy thiêm có hiệu quả chống oxy hóa (đặc biệt là dịch chiết methanol) [20] Hy thiêm thiêm chống oxi hóa trên cả gốc tự do OH* và O2

* Trên anion O2

-*

, dịch chiết trong nước có tác dụng mạnh hơn còn trên OH* phân đoạn butanol có hiệu quả cao Đặc biệt khi nghiên cứu sâu về cơ chế chống oxi hóa trên O2-*, có tác giả còn thấy, phân đoạn butanol chống oxi hóa mạnh trên dịch treo mô não đồng thể và màng hồng cầu [18]

* Tác dụng ức chế miễn dịch

Dịch chiết ethanol của hy thiêm thể hiện tác dụng ức chế miễn dịch in vitro và in vivo trên chuột nhắt trắng với liều thử nghiệm 0,25 – 0,5 và 1,0 mg/mỗi 7 ngày trong vòng 28 ngày Dịch chiết ethanol hy thiêm có tác dụng làm giảm nồng độ IgG, IgGI và IgG2b [13]

* Tác dụng chống dị ứng

Dịch chiết nước hy thiêm có tác dụng chống dị ứng do ức chế sản xuất IgE từ lympho B, giải phóng histamin từ tế bào mast và kháng histamin [4],[17]

* Độc với tế bào u hắc sắc tố

Hai chất pubetalin và kirenol được phân lập từ phân đoạn ethyl acetat

hy thiêm thể hiện độc tính rất mạnh đối với dòng tế bào u hắc sắc tố B16 ở chuột [19]

* Tác dụng trên chuyển hóa lipid

Tác dụng của hy thiêm đối với chuyển hóa lipid ở động vật thí nghiệm

đã được nghiên cứu Dược liệu gây giảm cả 3 chỉ số : cholesterol máu, tỷ

số / lipoprotein máu và mức lipid toàn phần trong máu động vật thí nghiệm [8], [4]

* Tác dụng kháng khuẩn

Khi phân lập và thử tác dụng sinh học, Lê Thị Kiều Nhi đã chứng minh rutin (quercetin-3-rhamnoglucosid) có hoạt tính kháng khuẩn (trên vi khuẩn gram dương) và kháng nấm (nhưng không có tác dụng trên nấm Candida albicans) [9]

* Tác dụng điều trị gout

Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thùy Dương, cao toàn phần hy thiêm với liều 600mg/kg và phân đoạn n-butanol với liều 120mg/kg có tác

dụng làm giảm nồng độ acid uric huyết thanh chuột nhắt trắng và chuột cống trắng Tại nồng độ 10g/1ml hỗn hợp phản ứng, phân đoạn n-butanol thể hiện khả năng ức chế hoạt tính xanthin oxidase Phân đoạn n-butanol hy thiêm cho tác dụng chống viêm và giảm đau thực nghiệm trên chuột [9]

* Các tác dụng khác

Hy thiêm cũng được chứng minh có tác dụng hạ huyết áp, an thần, hạ đường huyết, kháng acetylcholin và rút ngắn thời gian tiêu fibrin [8], [4]

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu

Là cây hy thiêm được thu mua ở Hòa Bình – hiện đang là nguồn nguyên liệu hy thiêm chính của công ty

2.2 Dung môi và hóa chất

- Chất chuẩn acid clorogenic (HL: 99,97% ), rutin (HL: 99,95%) đạt tiêu chuẩn phân tích được Viện Kiểm Nghiệm Thuốc TW cung cấp

- Bản mỏng silicagel GF254 (bản mỏng tráng sẵn của hãng Merck)

- Methanol, ethanol, n-butanol, n-hexan, ethyl acetat, aceton, acetonitril, toluen, acid acetic, … dùng trong định tính, định lượng đạt tiêu chuẩn phân tích (PA) Methanol, ethanol, bột natri hydroxyd, dùng trong chiết xuất đạt tiêu chuẩn công nghiệp được mua tại công ty hóa chất Đức Giang (Hà Nội) Các dung môi được cất lại trước khi dùng cho chiết xuất

2.3 Thiết bị và phương tiện nghiên cứu

2.3.1 Thiết bị sử dụng cho kiểm nghiệm

Tất cả các dụng cụ thiết bị đều được chuẩn hóa theo tiêu chuẩn GLP bao

gồm:

Bảng 1: Danh mục thiết bị sử dụng cho kiểm nghiệm, phân tích

1 Cân phân tích Mettler AG 135 Thụy sỹ

6 Tủ sấy áp suất giảm OV-02/jeitech/ Hàn quốc Hàn quốc

8 Các dụng cụ cần thiết khác ( Thùng, rây các kích

cỡ, môi inox, ống đong )

2.3.2 Hệ thống chiết xuất của nhà máy sản xuất thuốc đông dược, công suất 130-170 kg/mẻ:

Là thiết bị chiết nóng có áp suất với dung môi là nước

- Nồi hơi 2.500 kg hơi/giờ

- Máy nghiền dược liệu

- Nồi chiết áp suất dung tích 2000 lít – áp suất làm việc 1kg/cm2

- Bình lắng xoáy dung tích 2000 lít

- Bộ phận cô tuần hoàn áp suất giảm: P = - 0,2 đến - 0,6 kg/cm2, dung tích 1,5m3

- Nồi cô hở cách thủy, dung tích 750 lít: 03 thiết bị

- Nồi cô hở kiểm soát nhiệt (có thể lật để ra sản phẩm cuối) 350 lít

2.4 Phương pháp thực nghiệm:

2.4.1 Phương pháp xác định độ ẩm của dược liệu

Xác định độ ẩm của các mẫu thử theo phụ lục 9.6 DĐVN 4 “Xác

định mất khối lượng do làm khô”

Khối lượng dược liệu đem sấy: 2 – 5 g,

Nhiệt độ sấy: 100 oC; thời gian sấy 4 giờ

Tỷ lệ % độ ẩm của mẫu được tính theo công thức:

m1: là số gam mẫu thử ban đầu

m2: là số gam mẫu thử sau sấy

m: là số g mẫu đã cân đem thử

2.4.2 Xác định khối lượng riêng biểu kiến

- Khối lượng riêng có liên quan đến sự phân bố không gian của chất trong một nguyên liệu

- Khối lượng riêng của chất rắn được biểu thị bằng số g/cm3

- Xác định khối lượng riêng biểu kiến của dược liệu đưa vào chiết xuất để

xác định thể tích chiếm chỗ của lượng dược liệu đưa vào chiết xuất

Cách xác định: Cân khối lượng một thể tích dược liệu nhất định từ đó xác

định được khối lượng riêng tương đối của các mẫu dược liệu có kích thước khác nhau

2.4.3 Phương pháp chiết xuất hy thiêm

Sơ đồ 2:Sơ đồ quy trình chiết xuất hy thiêm

2.4.4 Phương pháp định tính acid clorogenic và rutin trong dược liệu bằng sắc ký lớp mỏng:

- Pha tĩnh: Silica gel GF254 (Merck) đã được hoạt hóa ở nhiệt độ 1050C trong 60 phút trước khi dùng

- Hệ dung môi triển khai: EtOAc: CH3COOH: HCOOH: H2O (10:1:1:1)

Dung dịch đối chiếu: Là dung dịch của chất chuẩn Acid clorogenic và

Rutin trong MeOH có nồng đồ thích hợp

Dung dịch thử: Chiết mẫu thử dược liệu trong dung môi chiết, lọc dịch

chiết qua giấy lọc, bay hơi dung môi thu được cắn MeOH hoặc cắn nước Hòa tan cắn trong 2 ml MeOH, lọc qua màng lọc 0,45 m được dịch chấm sắc ký

Hy thiêm

Cắt đoạn 3-5 cm

Nước 800 lít

Tiến hành: chấm riêng biệt lên bản mỏng dung dịch thử và dung dịch chất

đối chiếu trên Triển khai sắc ký trong bình kín đến khi dung môi chạy cách mép trên của bản mỏng khoảng 1 cm Lấy bản mỏng ra, sấy nhẹ bằng máy sấy cho khô

Quan sát các vết trên bản mỏng (sắc ký đồ)

Kết quả : Sắc ký đồ của dung dịch thử phải cho vết cùng màu, cùng Rf với

vết của acid clorogenic và rutin trong dung dịch đối chiếu

2.4.5 Phương pháp định lượng clorogenic acid và rutin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

- Mẫu chuẩn: pha acid clorogenic chuẩn và rutin chuẩn trong methanol để

được các dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ chính xác khoảng: (acid clorogenic: 5 µg/ml và rutin: 5 µg/ml); (acid clorogenic: 20 µg/ml và rutin:

20 µg/ml); (acid clorogenic: 50 µg/ml và rutin: 50 µg/ml); (acid clorogenic:

100 µg/ml và rutin: 100 µg/ml); (acid clorogenic: 200 µg/ml và rutin: 200 µg/ml); lọc qua màng lọc 0,45 µm

- Mẫu thử cao đặc: Cân 0,5 g cao đặc vào bình nón 100 ml, thêm chính xác

50 ml methanol, cân khối lượng bình, lắc siêu âm 30 phút, để nguội bổ sung lượng MeOH hao hụt cho vừa đủ khối lượng cân trước, lọc qua giấy lọc rồi lọc qua màng lọc kích cỡ 0,45µm

- Mẫu thử dược liệu: Cân 3g bột dược liệu vào bình nón 100 ml, thêm chính

xác 50 ml methanol, cân khối lượng bình, lắc siêu âm 30 phút, để nguội bổ sung lượng MeOH hao hụt cho vừa đủ khối lượng cân trước, lọc qua giấy lọc rồi lọc qua màng lọc kích cỡ 0,45µm

Điều kiện sắc ký:

- Cột ODS-3 intersil (4.6mm x 250mm x 5mcm)

- Pha động : Gradient

Bảng 2: Điều kiện sắc ký lỏng hiệu năng cao

Thời gian Dung dịch H 3 PO4

- Tiêm riêng biệt các dung dịch chuẩn hỗn hợp, tiến hành sắc ký, ghi lại các sắc ký đồ và phổ đồ 3D của các píc chuẩn Thiết lập đường chuẩn của acid clorogenic và đường chuẩn của rutin về mối tương quan giữa nồng độ dung dịch ( µg/ml) và diện tích pic tương ứng theo phương trình: y1= a1x1+b1 đối với acid clorogenic; y2= a2x2+b2 đối với acid clorogenic (y: là diện tích píc,

x là nồng độ µg/ml)

- Tiến hành sắc ký với dung dịch thử Ghi lại sắc ký đồ và phổ đồ 3D của các píc thử

- Định tính: yêu cầu píc của mẫu thử có thời gian lưu và dải phổ hấp thụ 3D (từ bước sóng 210 nm đến 400 nm) của píc trùng với píc của dung dịch chuẩn

- Định lượng: Tính nồng độ (µg/ml) của acid clorogenic (X1: nồng độ acid clorogenic trong mẫu cao đặc (µg/ml); X2: nồng độ acid clorogenic trong mẫu dược liệu (µg/ml))và nồng độ rutin (X3: nồng độ rutin trong mẫu cao đặc (µg/ml); X4: nồng độ rutin trong mẫu dược liệu (µg/ml)) có trong dung dịch thử (dung dịch thử từ mẫu cao đặc và dung dịch thử từ mẫu dược liệu) dựa vào đường chuẩn của acid clorogenic và đường chuẩn của rutin Từ nồng độ tìm được của acid clorogenic và rutin có trong cao đặc, dược liệu Tính hàm lượng (%) của các hoạt chất này có trong cao đặc và trong dược liệu theo các công thức sau:

- Hàm lượng acid clorogenic trong cao được tính theo công thức:

X1*50*100*100

X1.1 (%) =

106*mcđ*(100-C1)

Trong đó:

- X1: nồng độ acid clorogenic trong cao đặc (µg/ml)

- mcđ: khối lượng của cao đặc (g)

- mdl: khối lượng của dược liệu (g)

- C2: độ ẩm của dược liệu (%)

- Hàm lượng rutin trong cao được tính theo công thức:

X3*50*100*100

X1.3 (%)=

106*mcđ*(100-C1)

Trong đó:

- X3: nồng độ rutin trong cao đặc (µg/ml)

- mcđ: khối lượng của cao đặc (g)

- X4: nồng độ rutin trong dược liệu (µg/ml)

- mdl: khối lượng của dược liệu (g)

- c2: độ ẩm của dược liệu (%)

2.5 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Xây dựng TCCS dược liệu Hy thiêm

Xác định hàm lượng acid clorogenic và rutin từ 3 - 6 mẫu dược liệu khác nhau Từ đó xây dựng TCCS cho dược liệu Hy thiêm, trong đó có chỉ tiêu hàm lượng acid clorogenic và rutin

Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn của dược liệu hy thiêm :

Xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu hy thiêm dựa trên các chỉ tiêu chung được quy định tại Dược điển Việt Nam IV, trong đó có chỉ tiêu định tính và định lượng: