lỏng hiệu năng cao (HPLC)
- Mẫu chuẩn: pha acid clorogenic chuẩn và rutin chuẩn trong methanol để được cỏc dung dịch chuẩn hỗn hợp cú nồng độ chớnh xỏc khoảng: (acid clorogenic: 5 àg/ml và rutin: 5 àg/ml); (acid clorogenic: 20 àg/ml và rutin: 20 àg/ml); (acid clorogenic: 50 àg/ml và rutin: 50 àg/ml); (acid clorogenic: 100 àg/ml và rutin: 100 àg/ml); (acid clorogenic: 200 àg/ml và rutin: 200 àg/ml); lọc qua màng lọc 0,45 àm.
- Mẫu thử cao đặc: Cõn 0,5 g cao đặc vào bỡnh nún 100 ml, thờm chớnh xỏc 50 ml methanol, cõn khối lượng bỡnh, lắc siờu õm 30 phỳt, để nguội. bổ sung lượng MeOH hao hụt cho vừa đủ khối lượng cõn trước, lọc qua giấy lọc rồi lọc qua màng lọc kớch cỡ 0,45àm.
- Mẫu thử dược liệu: Cõn 3g bột dược liệu vào bỡnh nún 100 ml, thờm chớnh xỏc 50 ml methanol, cõn khối lượng bỡnh, lắc siờu õm 30 phỳt, để nguội. bổ sung lượng MeOH hao hụt cho vừa đủ khối lượng cõn trước, lọc qua giấy lọc rồi lọc qua màng lọc kớch cỡ 0,45àm.
Điều kiện sắc ký:
- Cột ODS-3 intersil (4.6mm x 250mm x 5mcm) - Pha động : Gradient
21
Bảng 2: Điều kiện sắc ký lỏng hiệu năng cao
Thời gian Dung dịch H3PO4 0,5%
Methanol
(HPLC) Kiểu rửa giải
0 75 25 Gradient 20 60 40 Gradient 40 40 60 Gradient 49 40 60 Đẳng dũng 50 75 25 Gradient - Detector PDA: 255 nm - Thể tớch tiờm mẫu: 20 mcl - Tốc độ dũng: 1.0 ml/min - Tiến hành
- Kiểm tra tớnh thớch hợp của hệ thống sắc ký: Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn hỗn hợp cú nồng độ chớnh xỏc khoảng 50 àg/ml đó chuẩn bị ở trờn, độ lệch chuẩn tương đối của cỏc diện tớch đỏp ứng từ 6 lần tiờm lặp lại khụng được lớn hơn 2,0% đối với cả hai hoạt chất.
- Tiờm riờng biệt cỏc dung dịch chuẩn hỗn hợp, tiến hành sắc ký, ghi lại cỏc sắc ký đồ và phổ đồ 3D của cỏc pớc chuẩn. Thiết lập đường chuẩn của acid clorogenic và đường chuẩn của rutin về mối tương quan giữa nồng độ dung dịch ( àg/ml) và diện tớch pic tương ứng theo phương trỡnh: y1= a1x1+b1 đối với acid clorogenic; y2= a2x2+b2 đối với acid clorogenic. (y: là diện tớch pớc, x là nồng độ àg/ml).
- Tiến hành sắc ký với dung dịch thử. Ghi lại sắc ký đồ và phổ đồ 3D của cỏc pớc thử.
22
- Định tớnh: yờu cầu pớc của mẫu thử cú thời gian lưu và dải phổ hấp thụ 3D (từ bước súng 210 nm đến 400 nm) của pớc trựng với pớc của dung dịch chuẩn.
- Định lượng: Tớnh nồng độ (àg/ml) của acid clorogenic (X1: nồng độ acid clorogenic trong mẫu cao đặc (àg/ml); X2: nồng độ acid clorogenic trong mẫu dược liệu (àg/ml))và nồng độ rutin (X3: nồng độ rutin trong mẫu cao đặc (àg/ml); X4: nồng độ rutin trong mẫu dược liệu (àg/ml)) cú trong dung dịch thử (dung dịch thử từ mẫu cao đặc và dung dịch thử từ mẫu dược liệu) dựa vào đường chuẩn của acid clorogenic và đường chuẩn của rutin. Từ nồng độ tỡm được của acid clorogenic và rutin cú trong cao đặc, dược liệu. Tớnh hàm lượng (%) của cỏc hoạt chất này cú trong cao đặc và trong dược liệu theo cỏc cụng thức sau:
- Hàm lượng acid clorogenic trong cao được tớnh theo cụng thức:
X1*50*100*100 X1.1 (%) =
106*mcđ*(100-C1) Trong đú:
- X1: nồng độ acid clorogenic trong cao đặc (àg/ml) - mcđ: khối lượng của cao đặc (g)
- C1: độ ẩm của cao đặc (%).
- Hàm lượng acid clorogenic trong dược liệu được tớnh theo cụng thức:
X2*50*100*100 X1.2 (%)=
106*mdl*(100-C2) Trong đú:
23 - mdl: khối lượng của dược liệu (g) - C2: độ ẩm của dược liệu (%).
- Hàm lượng rutin trong cao được tớnh theo cụng thức:
X3*50*100*100 X1.3 (%)=
106*mcđ*(100-C1) Trong đú:
- X3: nồng độ rutin trong cao đặc (àg/ml) - mcđ: khối lượng của cao đặc (g)
- C1: độ ẩm của cao đặc (%).
- Hàm lượng rutin trong dược liệu được tớnh theo cụng thức:
X4*50*100*100 X1.4 (%)=
106*mdl*(100-c2) - Trong đú:
- X4: nồng độ rutin trong dược liệu (àg/ml) - mdl: khối lượng của dược liệu (g)
- c2: độ ẩm của dược liệu (%).