- Cỏc nghiờn cứu chiết xuất hy thiờm được tiến hành tại Nhà mỏy sản xuất thuốc Đụng dược – cụng ty CP dược VTYT Thanh Húa từ thỏng 2/2010 đến thỏng 4/2015.
- Cỏc nghiờn cứu về phương phỏp định tớnh, định lượng được nghiờn cứu và khảo sỏt tại: Bộ mụn Cụng nghiệp dược trường ĐH dược Hà Nội; Khoa phõn tớch húa học Viện dược liệu; Phũng kiểm tra chất lượng GLP - cụng ty CP dược VTYT Thanh Húa, từ thỏng 1 đến thỏng 5/2015
26
CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1. Xõy dựng TCCS dược liệu Hy thiờm
- Qua những khảo sỏt về nguồn nguyờn liệu và xõy dựng quy trỡnh chiết xuất hy thiờm thấy chất lượng dược liệu đầu vào cho quy trỡnh sản xuất là yếu tố quan trọng hàng đầu ảnh hưởng đến kết quả sản xuất.
- Tiờu chuẩn dược liệu hy thiờm bao gồm đầy đủ cỏc chỉ tiờu quy định trong DĐVN IV, bao gồm:
Độ ẩm: khụng lớn hơn 12% Tạp chất: Khụng quỏ 1%
Tỷ lệ lỏ trong dược liệu: Khụng ớt hơn 40% Tỷ lệ vụn nỏt: Khụng quỏ 5,0%
- Trong khuụn khổ luận văn, tiến hành xõy dựng tiờu chuẩn cho dược liệu hy thiờm về cỏc chỉ tiờu định tớnh và định lượng hai hoạt chất là acid clorogenic và rutin.
Định tớnh bằng sắc ký lớp mỏng TLC
Tiến hành sắc ký lớp mỏng với cỏc điều kiện như ở mục 2.4.4.
Dung dịch đối chiếu: Cõn chớnh xỏc 1 mg cỏc chất chuẩn rutin (Merck) và acid clorogenic (Merck), hũa tan hoàn toàn trong 1 ml MeOH, lọc qua màng lọc 0,45 m thu được cỏc dung dịch chấm sắc ký.
Dung dịch thử: Cõn đỳng 3g dược liệu hy thiờm đó xay nhỏ (bao gồm mẫu hy thiờm nghiờn cứu và mẫu hy thiờm chuẩn của Viện Dược liệu) cho vào bỡnh nún 50ml, thấm ẩm dược liệu bằng dung mụi chiết:
- Chiết bằng dung mụi MeOH: cho khoảng 20 ml vào bỡnh nún, lắc đều rồi siờu õm 30 phỳt khi chiết bằng MeOH (20ml).
27
- Chiết bằng nước: cho khoảng 20 ml nước cất và đun sụi trong 10 phỳt. Sau khi chiết xong, lọc dịch chiết qua giấy lọc, bay hơi dung mụi thu được cắn MeOH hoặc cắn nước. Hũa tan cắn trong 2 ml MeOH, lọc qua màng lọc 0,45 m được dịch chấm sắc ký.
Tiến hành: chấm riờng biệt lờn bản mỏng 15 l mỗi dung dịch thử và dung dịch chất đối chiếu trờn bản mỏng, cỏch mộp dưới của bản mỏng khoảng 1 cm. Triển khai sắc ký trong bỡnh kớn đến khi dung mụi chạy cỏch mộp trờn của bản mỏng khoảng 1 cm. Lấy bản mỏng ra, sấy nhẹ bằng mỏy sấy cho khụ.
Quan sỏt cỏc vết trờn bản mỏng (sắc ký đồ) bằng mắt thường, dưới ỏnh sang UV ở 254 nm (khụng phun thuốc thử) và 365 nm (phun thuốc thử acid boric/ acid oxalic (2:1).
Kết quả:
Hỡnh 1. Sắc ký đồ TLC của cỏc mẫu dược liệu hy thiờm
(Siegesbeckia orientalis L.) Ghi chỳ:
28
A: Hỡnh ảnh quan sỏt ở UV 254
B: Hỡnh ảnh quan sỏt ở UV 365 - sau khi phun thuốc thử axit boric/ axit oxalic (2:1)
Trong đú:
Dc1: Hy thiờm (mẫu thử là DL Viện dược liệu) - chiết bằng nước Dc2: Hy thiờm (mẫu thử là DL Viện dược liệu) - chiết bằng MeOH C1: Chất đối chiếu Rutin
C2: Chất đối chiếu clorogenic acid
T1n: Hy thiờm (mẫu thử là nguyờn liệu của cụng ty) - chiết bằng nước T1m: Hy thiờm (mẫu nguyờn liệu của cụng ty) - chiết bằng MeOH T2n: Hy thiờm (mẫu DL mua tại nhà thuốc Sơn Lõm) - chiết bằng nước T2m: Hy thiờm (mẫu DL mua tại nhà thuốc Sơn Lõm) - chiết bằng MeOH
- Sắc ký đồ của cỏc mẫu thử Dc1; và Dc2; T1n; T2n; T1m; T2m cú 02 vết chớnh cú cựng màu và cựng Rf với sắc ký đồ của dung dịch acid clorogenic và rutin đối chiếu.
Định tớnh bằng sắc ký lỏng HPLC:
Với kết quả định tớnh bằng TLC và qua khảo sỏt sơ bộ bằng HPLC, chỳng tụi tiến hành thử cỏc dung mụi và điều kiện khỏc nhau lựa chọn ra điều kiện HPLC để định tớnh acid clorogenic và rutin trong dược liệu hy thiờm.
29 min 0 10 20 30 40 mAU -2 0 2 4 6 8 10
DAD1 A, Sig=255,4 Ref =of f (RUTIN\THUC0004.D)
1 1 .0 9 3 2 8 .7 3 2
acid clorogenic chuan nong do 50 mcg/ml
rutin chuan nong do 50 mcg/ml
min 0 5 10 15 20 25 30 35 40 mAU -5 0 5 10 15 20 25 30
DAD1 A, Sig=255,4 Ref =of f (RUTIN\THUC0007.D)
rutin mau thu acid clorogenic mau thu
Are a: 2 42.3 01 1 1 .0 3 8 2 8 .5 8 8
Hỡnh 2: Sắc ký đồ của mẫu chuẩn hỗn hợp (bờn trờn) và mẫu thử dược liệu hy thiờm
- Sắc ký đồ thu được cho 2 pic tỏch rừ ràng, nhiễu nền thấp, thể hiện qua sắc ký đồ của mẫu chuẩn, mẫu thử của hai chất acid clorogenic và rutin . Trờn cỏc sắc ký đồ của mẫu thử đều cú pic cú thời gian lưu trựng với thời gian lưu (tR) của pic acid clorogenic trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn là 11,1 phỳt, trong khi thời gian lưu của rutin dài hơn, là 28,6 phỳt. Với thời gian lưu và điều kiện tỏch như trờn cú thể thấy đõy là điều kiện phự hợp để định tớnh cỏc hoạt chất này trong dược liệu.
30
Định lượng:
- Kết quả định lượng thành phần acid clorogenic và rutin bằng phương phỏp HPLC trong cỏc mẫu hy thiờm như sau:
Bảng 3 : Hàm lượng hoạt chất trong cỏc mẫu hy thiờm
TT Tờn mẫu HL % acid clorogenic
tớnh theo KL khụ
HL % Rutin tớnh theo KL khụ
1 DL cụng ty 0,074% 0,045%
2 DL Sơn Lõm 0,069% 0,041%
3 DL viện dược liệu 0,070% 0,043%
Trung bỡnh 0,071% 0,043%
Nhận xột:
Hàm lượng acid clorogenic trong cỏc mẫu thử nằm trong khoảng từ 0,069% đến 0,074 %.
Hàm lượng rutin trong cỏc mẫu thử nằm trong khoảng từ 0,041% đến 0,045%.
- Để ổn định nguyờn liệu đầu vào cho sản xuất cao hy thiờm, giới hạn hàm lượng acid clorogenic trong dược liệu quy định trong tiờu chuẩn khụng được thấp hơn 0,065% và giới hạn hàm lượng rutin trong dược liệu quy định trong tiờu chuẩn khụng được thấp hơn 0,0350%
Từ cỏc khảo sỏt trờn, đưa ra tiờu chuẩn cho dược liệu hy thiờm là:
Độ ẩm: khụng lớn hơn 12%
Tạp chất khỏc: Khụng quỏ 1%
Tỷ lệ lỏ trong dược liệu: Khụng ớt hơn 40% Tỷ lệ vụn nỏt: Khụng quỏ 5,0%
31
+ Định tớnh: acid clorogenic và rutin bằng TLC
+ Định lượng: Hàm lượng acid clorogenic trong dược liệu khụng được thấp hơn 0,065% và hàm lượng rutin trong dược liệu khụng được thấp hơn 0,035% tớnh theo dược liệu khụ.
3.2. Đỏnh giỏ ảnh hưởng của độ mịn dược liệu
- Khi dược liệu quỏ thụ, dung mụi sẽ khú thấm vào dược liệu, hoạt chất khú được chiết vào dung mụi. Khi dược liệu quỏ mịn, bề mặt tiếp xỳc giữa dược liệu và dung mụi tăng lờn, tạo thuận lợi cho chiết xuất nhưng cũng gõy nhiều khú khăn như: dịch chiết cú nhiều tạp do màng tế bào bị phỏ hủy, bột dược liệu dễ dớnh bết vào nhau gõy khú khăn trong quỏ trỡnh rỳt dịch chiết. Do vậy, cần phải khảo sỏt để lựa chọn kớch thước dược liệu phự hợp. - Tiến hành khảo sỏt chiết xuất hy thiờm với cỏc kớch thước khỏc nhau: dược liệu khụ xay qua rõy 10 mm, dược liệu thỏi đoạn 3 – 5 cm.
Sự khỏc nhau Kớch thước
3 – 5 cm
Kớch thước
Dược liệu nghiền thụ
Khối lượng riờng biểu kiến của dược liệu
(kg/m3) 101kg/m
3 145 kg/m3
Tỉ lệ bột mịn < 1mm (%) 3% 12%
- Quy trỡnh khảo sỏt được thực hiện như mục 2.5.2.
- Tiến hành chiết và cụ cao 02 mẻ đối với mỗi loại kớch thước dược liệu trờn với điều kiện chiết: Áp suất nồi chiết 1,0 kg/cm2, thể tớch nước lần chiết thứ nhất và thứ 2 lần lượt là: 1.200 lớt và 800 lớt.
- Kết quả khảo sỏt ảnh hưởng của kớch thước dược liệu tới quy trỡnh chiết xuất được như sau:
32
Bảng 4. Ảnh hưởng của độ mịn dược liệu đến hiệu suất và chất lượng cao
Kớch thước Khối lượng DL (kg) Khối lượng SP (kg) Tỉ lệ cao/dược liệu (%) Hàm lượng AC trong cao (%) Hàm lượng RUTIN trong cao (%) 3-5 cm Mẻ 1 125 16,5 13,2 0,31 0,13 Mẻ 2 125 16,0 12,8 0,30 0,12 Mẻ 3 125 16,7 13,3 0,29 0,12 TB 125 16,4 13,1 0,30 0,12 Dược liệu qua xõy thụ rõy 10 mm Mẻ 1 125 17,1 13,7 0,28 0,11 Mẻ 2 125 16,9 13,5 0,29 0,10 Mẻ 3 125 16,5 13,2 0,28 0,10 TB 125 16,8 13,4 0,28 0,10 Nhận xột:
- Chia nhỏ dược liệu làm tăng khối lượng riờng của dược liệu, cú ý nghĩa trong việc tăng năng suất mẻ chiết (bỡnh chiết nạp được khối lượng dược liệu nhiều hơn nếu dược liệu được chia nhỏ). Khi dược liệu được nghiền mịn, khối lượng cao thụ thu được tăng (khụng đỏng kể), nhưng hàm lượng hoạt chất trong cao lại giảm đi, cú nghĩa là tạp chất tăng lờn.
- Hiệu suất chiết tớnh theo hoạt chất giảm đi khi bột dược liệu quỏ mịn cú thể được giải thớch là do tạp chất khuếch tỏn vào dịch chiết quỏ nhiều, tạo ra mụi trường cú độ nhớt cao làm cản trở hoạt chất khuếch tỏn. Hơn nữa, bột dược liệu quỏ mịn cũn gõy khú khăn cho giai đoạn rỳt dịch chiết: thời gian rỳt dịch chiết kộo dài và khú rỳt kiệt dịch chiết. Điều này cũng làm giảm hiệu suất chiết.
- Như vậy, từ kết quả khảo sỏt trờn thỡ với dược liệu Hy thiờm là loại thõn thảo, kớch thước đưa vào chiết xuất phự hợp là 3-5 cm.
3.3. Đỏnh giỏ ảnh hưởng của số lần chiết xuất
- Tiến hành chiết xuất cỏc mẻ dược liệu 3 lần, mỗi lần 2 giờ. Cụ riờng dịch chiết từng mẻ. Cõn xỏc định khối lượng cao và xỏc định hàm lượng hoạt chất cú trong cao. Kết quả thu được như sau:
33
Bảng 5. Hiệu suất chiết của từng lần chiết
Thời gian 2 giờ/lần KL cao thu được (kg)
Tỉ lệ cao thu được của mỗi lần chiết/tổng lượng cao thu được (%)
HL rutin /cao (%) Mẻ 1 Lần 1 13,5 74,5 0,12 Lần 2 3,9 21,5 0,07 Lần 3 0,7 4,0 0,01 Tổng 18,1 100 Mẻ 2 Lần 1 13,0 73,8 0,11 Lần 2 3,9 22,1 0,06 Lần 3 0,7 4,1 0,01 Tổng 17,6 100 Mẻ 3 Lần 1 13,2 72,5 0,11 Lần 2 4,1 22,5 0,07 Lần 3 0,9 5,0 0,01 Tổng 18,2 100 Nhận xột:
- Khối lượng cao của dịch chiết lần 1 chiếm tới trờn 70 % tổng khối lượng cao của cả 3 lần chiết, lượng cao thu được của chiết lần là rất thấp.
- Hàm lượng rutin trong cao thu được giảm dần theo số lần chiết, đặc biệt cao của dịch chiết lần 3 hàm lượng của rutin dưới 0,01%, điều này cho thấy rutin đó được chiết khỏ kiệt ở lần chiết đầu tiờn, cỏc lần chiết sau hàm lượng rutin thấp và giảm nhiều do bị phõn hủy khi thời gian chiết ở nhiệt độ cao kộo dài.
- Do vậy, chiết xuất 2 lần, dịch chiết lần 1 được xử lý; dịch chiết lần 2 dựng làm dung mụi chiết cho mẻ sau là phự hợp.
3.4. Đỏnh giỏ ảnh hưởng của thời gian chiết xuất
- Thời gian chiết xuất quỏ ngắn sẽ khụng chiết kiệt được hoạt chất cú trong dược liệu. Ngược lại, nếu tiến hành chiết xuất quỏ lõu, dịch chiết sẽ lẫn nhiều tạp chất và gõy tốn kộm về mặt thời gian, nhõn cụng và năng lượng.
34
Do vậy cần phải khảo sỏt để lựa chọn được thời gian chiết xuất đem lại hiệu quả cao nhất.
Tiến hành khảo sỏt thời gian chiết xuất dược liệu với điều kiện: - Mỗi mẻ 125 kg dược liệu được chiết 02 lần.
- Áp suất chiết 1 kg/ cm2;
- Thể tớch dung mụi chiết lần 1 và lần 2 lần lượt là 1200 lớt và 800 lớt, gộp 2 dịch chiết cụ thu cao đặc).
Kết quả thu được như sau:
Bảng 6. Ảnh hưởng của thời gian chiết xuất (mẻ 125 kg)
Mẻ số
Thời gian chiết xuất
Khối lượng cao thu được (kg) Tỉ lệ cao/dược liệu (%) Hàm lượng Rutin /cao (%) 1 1h+1h 13,2 10,56 0,13 2 1h+1h 12,7 10,16 0,12 3 1h+1h 12,9 10,32 0,13 Trung bỡnh 12,9 10,34 0,13 1 2h+1h 15,5 12,40 0,12 2 2h+1h 15,9 12,72 0,12 3 2h+1h 15,3 12,24 0,11 Trung bỡnh 15,56 12,45 0,12 1 3h+1h 17,9 14,32 0,11 2 3h+1h 17,5 14,00 0,12 3 3h+1h 17,6 14,08 0,11 Trung bỡnh 17,6 14,1 0,11 1 4h+1h 17,9 14,32 0,07 2 4h+1h 18,0 14,64 0,06 3 4h+1h 17,8 14,24 0,07 Trung bỡnh 17,9 14,32 0,07
35
Nhận xột:
- Khối lượng cao thụ thu được tăng tỉ lệ với thời gian chiết xuất, nhưng hàm lượng rutin trong cao lại giảm dần. Sau 4 giờ (3h+1h), hiệu suất chiết đạt 14,1 % nhưng sau 5 giờ (4h+1h), hiệu suất chiết chỉ tăng nhẹ trong khi hàm lượng hoạt chất thỡ giảm mạnh. Như vậy thời gian chiết 4 giờ (3 giờ + 1 giờ) là hợp lý. Nếu kộo dài hơn nữa, hoạt chất khụng tăng thờm nhưng tạp chất lại tan nhiều, đồng thời hàm lượng hoạt chất giảm đi thời gian tiếp xỳc nhiệt quỏ lõu, thời gian chiết kộo dài tốn thờm nhõn lực và năng lượng.
3.5. Đỏnh giỏ 2 phương phỏp cụ đặc
- Chiết xuất 03 mẻ (125 kg/mẻ), cụ dịch chiết từng mẻ hoàn toàn bằng thiết bị cụ ỏp suất giảm đến khi thu sản phẩm cuối.
- Chiết xuất 03 mẻ (125 kg/mẻ), cụ dịch chiết từng mẻ hoàn toàn bằng thiết bị cụ ỏp suất hở (cụ ỏp suất thường) đến khi thu sản phẩm cuối.
Kết quả thu được theo bảng sau:
Bảng 7: So sỏnh phương phỏp cụ đặc: ỏp suất giảm và ỏp suất thường
Phương phỏp cụ Tổng thể tớch dịch chiết (lớt) Thời gian cụ (giờ) KL cao thu được HL rutin /cao (%) Áp suất giảm Mẻ 1 1365 7,3 17,8 0,12 Mẻ 2 1340 7,4 17,5 0,13 Mẻ 3 1355 7,3 17,6 0,13 TB 1353 5,33 17,6 0,13 Áp suất thường Mẻ 1 1350 37,5 17,0 0,07 Mẻ 2 1345 37,5 17,1 0,08 Mẻ 3 1355 36,5 16,8 0,07 TB 1350 37,0 16,9 0,07 Nhận xột:
- Kết quả trờn cho thấy: cụ ỏp suất thường thời gian kộo dài hơn rất nhiều đồng thời hàm lượng hoạt chất cũng thấp hơn nhiều so với cụ ỏp suất giảm.
36
- Trung bỡnh mỗi giờ bộ phận cụ ỏp suất giảm bay hơi được khoảng 300 lớt nước trong khi cụ ỏp suất thường chỉ bay hơi được khoảng 30 lớt. Cụng đoạn cụ hở tốn rất nhiều thời gian, tiờu tốn nhiều nhõn lực và năng lượng, làm giảm chất lượng cao thu được.
3.6. Đề xuất quy trỡnh sản xuất cao hy thiờm
Qua khảo sỏt một số yếu tố ảnh hưởng đến chiết xuất cao hy thiờm trờn hệ thống thiết bị hiện cú của nhà mỏy như trờn, chỳng tụi đó từng bước chọn được điều kiện tối ưu như sau:
- Dung mụi chiết xuất : nước sinh hoạt
- Tỉ lệ dung mụi/dược liệu: lần chiết 1 là 1.200 lớt; lần 2 là 800 lớt. - Nhiệt độ chiết xuất : 1000C (ỏp suất nồi chiết 1 kg/cm2).
- Số lần và thời gian chiết : Chiết 02 lần
Lần 1: thời gian chiết là 03 giờ tớnh từ khi nồi đạt ỏp suất chiết. Lần 2: thời gian chiết là 03 giờ tớnh từ khi nồi đạt ỏp suất chiết. Dịch chiết thu được dựng làm dung mụi cho mẻ chiết tiếp theo.
- Cụ dịch chiết bằng hệ thống cụ ỏp suất giảm đến khi cũn khoảng 45% - 50% thể tớch dịch chiết ban đầu.
- Cụ hở ở nhiệt độ 60 - 700C đến khi cao cú thủy phần khoảng 20%.
3.7. Triển khai sản xuất cao Hy thiờm
- Khảo sỏt sự ổn định của quy trỡnh chiết xuất qua 6 mẻ chiết với khối lượng dược liệu là 125 kg/mẻ.
- Lần lượt chiết xuất 06 mẻ dược liệu với điều kiện chiết xuất như mục 3.6. - Hiệu suất chiết xuất và hàm lượng hoạt chất trong sản phẩm của 6 mẻ dược liệu như sau:
37
Bảng 8 : Hiệu suất chiết xuất và hàm lượng hoạt chất trong sản phẩm theo quy trỡnh chiết xuất đề xuất
Mẻ Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 Mẻ 4 Mẻ 5 Mẻ 6 TB
Khối lượng cao đặc (kg) 18,5 17,8 18,2 18,0 17,9 18,4 18,1 Mất khối lượng do làm
khụ (%) 23,0 22,5 23,0 22,3 21,0 22,7 22,5 Hàm lượng rutin (%) 0,12 0,13 0,12 0,12 0,11 0,12 0,11
Nhận xột:
Kết quả như trờn cho quy trỡnh chiết được đề xuất khỏ ổn định với khối lượng cao đặc thu được trung bỡnh là 18,1 kg/mẻ; hàm lượng rutin