Phân loại một số loài cá khoang cổ và hải quỳ tại khánh hòa dựa trên đặc điểm hình thái và di truyền

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LOẠI MỘT SỐ LOÀI CÁ KHOANG CỔ VÀ HẢI QUỲ TẠI KHÁNH HÒA DỰA TRÊN ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ DI TRUYỀN Gi

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHÂN LOẠI MỘT SỐ LOÀI CÁ KHOANG CỔ VÀ HẢI QUỲ

TẠI KHÁNH HÒA DỰA TRÊN ĐẶC ĐIỂM

HÌNH THÁI VÀ DI TRUYỀN

Giảng viên hướng dẫn : ThS Nguyễn Thị Hải Thanh

TS Đặng Thúy Bình Sinh viên thực hiện : Lương Thị Tường Vi

Mã số sinh viên : 53132012

Khánh Hòa: 2015

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

BỘ MÔN SINH HỌC

-o0o -

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHÂN LOẠI MỘT SỐ LOÀI CÁ KHOANG CỔ VÀ HẢI QUỲ

TẠI KHÁNH HÒA DỰA TRÊN ĐẶC ĐIỂM

HÌNH THÁI VÀ DI TRUYỀN

GVHD: ThS Nguyễn Thị Hải Thanh

TS Đặng Thúy Bình SVTH: Lương Thị Tường Vi

MSSV: 53132012

Khánh Hòa, tháng 06/2015

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp, em xin gửi lời cảm ơn đến Viện Công nghệ sinh học

và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang đã tạo môi trường thuận lợi về cơ sở vật chất cho em trong suốt quá trình thực hiện đồ án

Đặc biệt em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến ThS Nguyễn Thị Hải Thanh, ThS Vũ Đặng Hạ Quyên và TS Đặng Thúy Bình đã tận tình hướng dẫn, dạy bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi để cho em hoàn thành tốt đồ án này

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Sinh học và Công nghệ sinh học đã giảng dạy và cung cấp kiến thức cho em trong bốn năm học qua

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, anh chị, bạn bè và người thân đã quan tâm, hỗ trợ và động viên em hoàn thành tốt bài đồ án

Trong quá trình thực hiện không thể nào tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp để đồ án trở nên hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Nha Trang, ngày 20 tháng 06 năm 2015

Sinh viên thực hiện

Lương Thị Tường Vi

thu được 6 loài cá khoang cổ thuộc 1 giống Amphiprion và 7 loài hải quỳ thuộc 6 giống,

4 họ và 2 bộ Nghiên cứu đã sử dụng gen 16S mtDNA để kiểm chứng phân loại hình thái và xây dựng mối quan hệ phát sinh chủng loại của 6 loài cá khoang cổ thu tại Khánh Hòa Đồng thời nghiên cứu cũng sử dụng đoạn gen ribosome ITS1 – 5.8S – ITS2 để

nghiên cứu di truyền của hai loài hải quỳ Stichodactyla tapetum và Macrodactyla

doreensis Dữ liệu trong nghiên cứu này có thể được sử dụng làm nguồn dữ liệu đầu vào

để nghiên cứu đa dạng sinh học và mối quan hệ cộng sinh giữa cá khoang cổ và hải quỳ

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC BẢNG viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 4

1.1 Tổng quan về vùng nghiên cứu 4

1.2 Tổng quan về cá khoang cổ và hải quỳ 5

1.2.1 Tổng quan về cá khoang cổ 5

1.2.2 Tổng quan về hải quỳ 7

1.3.1 Phân loại bằng hình thái 9

1.3.2 Phân loại bằng di truyền 9

1.4 Các nghiên cứu trong và ngoài nước 12

1.4.1 Nghiên cứu về cá khoang cổ trong và ngoài nước 12

1.4.2 Nghiên cứu về hải quỳ trong và ngoài nước 14

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.2 Phương pháp nghiên cứu 16

2.2.1 Phân loại hình thái 16

2.2.2 Phân loại di truyền 20

2.2.3 Phân tích dữ liệu và xây dựng mối quan hệ phát sinh chủng loại 23

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Phân loại hình thái 27

3.1.1 Thành phần loài cá khoang cổ và hải quỳ thu tại Khánh Hòa 27

3.1.2 Đặc điểm hình thái cá khoang cổ và hải quỳ thu tại Khánh Hòa 29

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68

4.1 Kết luận 68

4.2 Kiến nghị 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO 70

PHỤ LỤC 75

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

A Số lượng tia và gai vây hậu môn

Bp Base pairs

BT Độ tin cậy (bootstrap)

C Số lượng tia và gai vây đuôi

H Chiều cao thân cá

IUCN International Union for Conservation of Nature

L Chiều dài toàn thân

LS Chiều dài chuẩn

T Chiều dài đầu

LM Chiều dài mõm

lD Chiều dài vây lưng

lA Chiều dài vây hậu môn

lP Chiều dài vây ngực

lV Chiều dài vây bụng

mt DNA Mitochondrial deoxyribonucleic acid

Mm Milimeter

µL Microliter

µM Micromol

P Số lượng tia và gai vây ngực

PCR Polymerase Chain Reaction

rRNA Ribosomal ribonucleic acid

tRNA Transfer ribonucleic acid

WWF World Wide Fund For Nature

V Số lượng tia và gai vây bụng

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 – Bản đồ tỉnh Khánh Hòa – Việt Nam 4

Hình 1.2 – Cấu trúc chung của hải quỳ 8

Hình 1.3 – Hai phương pháp dùng để phân loại: 9

Hình 1.4 – So sánh hệ gen ty thể và hệ gen nhân 10

Hình 2.1 – Hình thái bên ngoài của cá khoang cổ 17

Hình 2.2 – Các chỉ số đo trong phân loại cá khoang cổ 18

Hình 2.3 –Các chỉ số đếm trong phân loại cá khoang cổ 18

Hình 2.4 - Các chỉ tiêu đo của hải quỳ 19

Hình 2.5 – Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu di truyền cá khoang cổ 20

Hình 2.6 – Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 21

Hình 3.1a,b – Hình dáng và màu sắc cá khoang cổ hồng chỉ trắng Amphiprion perideraion 29

Hình 3.1c – Đặc điểm hình thái cá khoang cổ hồng chỉ trắng Amphiprion perideraion 30

Hình 3.2a – Hình dáng và màu sắc cá khoang cổ vàng Amphiprion sandaracinos 32

Hình 3.2b – Đặc điểm hình thái cá khoang cổ vàng Amphiprion sandaracinos 32

Hình 3.3a, b, c, d – Hình dáng và màu sắc của một số loài cá khoang cổ đen đuôi vàng Amphiprion clarkii 34

Hình 3.3e – Đặc điểm hình thái cá khoang cổ đen đuôi vàng Amphiprion clarkii 35

Hình 3.4a – Hình dáng và màu sắc cá khoang cổ đỏ Amphiprion frenatus 37

Hình 3.4b – Đặc điểm hình thái cá khoang cổ đỏ Amphiprion frenatus 38

Hình 3.5 – Hình dáng và màu sắc của một số loài cá khoang cổ yên ngựa Amphiprion polymnus 39

Hình 3.5e – Đặc điểm hình thái cá khoang cổ yên ngựa Amphiprion polymnus 40

Hình 3.6a,b – Hình dáng và màu sắc của một số loài cá khoang cổ nemo Amphiprion ocellaris 42

Hình 3.6c – Đặc điểm hình thái cá nemo Amphiprion ocellaris 43

Hình 3.7a, b, c – Hình dáng và màu sắc hải quỳ bong bóng Entacmaea quadricolor 45 Hình 3.7d – Đặc điểm hình thái hải quỳ bong bóng Entacmaea quadricolor 45

Hình 3.8 a, b – Hình dạng và màu sắc của hải quỳ thảm nhỏStichodactyla tapetum 46

Hình 3.8c – Đặc điểm hình thái hải quỳ thảm nhỏ Stichodactyla tapetum 47

Hình 3.9 – Hình dáng và màu sắc hải quỳ thảm Stichodactyla haddoni 48

Hình 3.9 c – Đặc điểm hình thái hải quỳ thảm Stichodactyla haddoni 49

Hình 3.10 d – Đặc điểm hình thái hải quỳ thân đỏ Macrodactyla doreensis 51

Hình 3.11a, b– Hình dáng và màu sắc của hải quỳ ống Pachycerianthus magnus 52

Hình 3.11 c – Đặc điểm hình thái hải quỳ ống Pachycerianthus magnus 53

Hình 3.12 – Hình dáng và màu sắc hải quỳ thanh long Cryptodendrum adhaesivum 54 Hình 3.12 c – Đặc điểm hình thái hải quỳ thanh long Cryptodendrum adhaesivum 55

Hình 3.13 a, b – Hình dáng và màu sắc hải quỳ cúc Heteractis aurora 56

Hình 3.13 c – Đặc điểm hình thái hải quỳ cúc Heteractis aurora 57

Hình 3.14 – Kết quả điện di DNA tổng số của các loài cá khoang cổ 58

Hình 3.15 – Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 16S mtDNA các mẫu cá khoang cổ 58

Hình 3.16 – Cây phát sinh loài từ phương pháp Neighbor - Joining với độ lặp lại 1000 lần dựa trên gen 16S mt DNA của các loài cá khoang cổ tại Khánh Hòa – Việt Nam 62 Hình 3.17 – Kết quả điện di tổng số và sản phẩm PCR đoạn gen ITS1 – 5.8S – ITS2 rDNA hai mẫu hải quỳ 64

Hình 3.18 – Cây phát sinh loài từ phương pháp Neighbor - Joining với độ lặp lại 1000 lần dựa trên gen ITS1 – 5.8S – ITS2 rDNA của các loài hải quỳ tại Khánh Hòa – Việt Nam 66

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 – Trình tự gen 16S mtDNA của các loài cá khoang cổ 24

Bảng 2.2 – Trình tự gen ITS1 – 5.8S – ITS2 rDNA của các loài hải quỳ 25

Bảng 3.1 – Kết quả thu mẫu cá khoang cổ 27

Bảng 3 2– Danh sách các loài cá Khoang cổ phổ biến ở Khánh Hòa – Việt Nam 27

Bảng 3.3 – Kết quả thu mẫu hải quỳ 28

Bảng 3.4 – Danh sách các loài hải quỳ thu được ở Khánh Hòa – Việt Nam 28

Bảng 3.5 – Các chỉ tiêu đo hình thái của hải quỳ 44

Bảng 3.6 – Độ tương đồng của 7 trình tự 16S mtDNA từ 6 loài cá khoang cổ tại Khánh Hòa – Việt Nam với trình tự Genbank 59

Bảng 3.7 – Sự khác biệt về trình tự 16S mt DNA giữa các loài cá khoang cổ ở Khánh Hòa 60

Bảng 3.8 –Độ tương đồng của trình tự đoạn gen ITS1 – 5.8S – ITS2 của 2 loài hải quỳ thu tại Khánh Hòa – Việt Nam với dữ liệu từ Genbank 65

Bảng 3.9 – Sự khác biệt về trình tự ITS1 – 5.8S – ITS2 rDNA của các loài hải quỳ 65

MỞ ĐẦU

Nằm bên bờ Tây của Biển Đông, Việt Nam là quốc gia có đường bờ biển dài 3260 km với nguồn tài nguyên sinh vật biển đa dạng, phong phú Vùng biển Việt Nam có khoảng

11000 loài sinh vật cư trú trong hơn 20 kiểu hệ sinh thái điển hình Trong đó có khoảng 1222

km2 rạn san hô, phân bố rộng rãi từ Bắc tới Nam, tập trung diện tích lớn ở miền Trung và miền Nam – Việt Nam với độ đa dạng sinh học cao (Đỗ Công Thung, 2011)

Các rạn san hô được xem là môi trường sống vô cùng quan trọng, ảnh hưởng đến sự tồn tại và phát triển của nhiều loài trong hệ sinh thái biển Trong đại dương, rạn san hô chỉ chiếm 1% nhưng chúng hỗ trợ khoảng 25% các loài sinh vật biển sinh sống ở nơi này, đây là nơi cư trú, nơi sinh đẻ và là nơi ươm nuôi ấu trùng của nhiều loài cá biển (Johnny, 2014) Mỗi năm san hô chỉ dài ra khoảng 1cm, để hình thành nên một hệ rạn san hô chúng cần phải trải qua thời gian hàng trăm năm Đây là nơi sinh sản của các loài sinh vật biển, để rồi chúng phát tán ra xung quanh, làm tăng trưởng nguồn lợi thủy sản

và đa dạng sinh học (Barnes và ctv, 1999)

Tuy nhiên, hiện nay các hệ sinh thái trong rạn san hô trên thế giới đang phải đối diện với nhiều mối đe dọa liên quan đến sự sống còn Trong đó, mối đe dọa lớn nhất, khó kiểm soát nhất và gây ra nhiều mất mát nhất chính là sự tác động biến đổi khí hậu (Munday và ctv, 2008) Điều này đã và đang tạo ra nhiều biến động lớn trong lòng đại dương, cụ thể là sự suy giảm đa dạng sinh học một số loài sống trong rạn san hô Những năm gần đây, sự tác động của biến đổi khí hậu ngày càng mạnh mẽ, nhiệt độ và nồng độ acid trong đại dương tăng lên làm tăng nguy cơ xảy ra hiện tượng tẩy trắng san hô (Philip

và ctv, 2008) Điều này đồng nghĩa với nơi trú ẩn và nguồn thức ăn của một số sinh vật biển sống ở rạn san hô bị suy giảm Trong đó cá khoang cổ và hải quỳ là hai loài chịu nhiều ảnh hưởng nhất bởi chúng có mối quan hệ cộng sinh bắt buộc (Fautin và Allen, 1992) Hải quỳ được xem là nơi cư trú, nơi bảo vệ cá khoang cổ trước kẻ thù, nhờ đó

mà loài cá này được sống an toàn trong đại dương Ngược lại, cá khoang cổ ăn những sinh vật nhỏ làm hại tới hải quỳ, ngoài ra cá còn cung cấp dinh dưỡng cho hải quỳ thông qua những chất thải của mình (Fautin và Allen, 1992) Dưới ảnh hưởng của biến đổi khí hậu, đặc biệt là sự gia tăng nhiệt độ và quá trình acid hóa đại dương đã đe dọa nghiêm trọng đến sự sinh trưởng và phát triển của cá khoang cổ và hải quỳ Khi nồng độ acid trong đại dương tăng lên sẽ ảnh hưởng đến khả năng phát hiện các tín hiệu hóa học cần

thiết của cá khoang cổ để tìm đến vật chủ hải quỳ Vì vậy cá khoang cổ dễ bị đe dọa bởi

kẻ thù của mình khi không có hải quỳ bảo vệ, đồng thời cá ít có cơ hội được sinh sản dễ dẫn đến nguy cơ bị tuyệt chủng Khi nhiệt độ tăng cao, tảo cộng sinh với hải quỳ bị tiêu diệt, nguồn cung cấp dinh dưỡng quan trọng cho hải quỳ bị ảnh hưởng đe dọa đến sự sống còn của chúng Mặt khác, hải quỳ là loài động vật nhạy cảm, dễ bị ảnh hưởng bởi

sự biến động của nhiệt độ và các yếu tố vật lí khác (Munday, 2008) Biến đổi khí hậu càng tác động mạnh mẽ đến đại dương thì cá khoang cổ và hải quỳ càng dễ bị đẩy đến

cá khoang cổ và hải quỳ nhằm bảo tồn sự đa dạng và nguồn lợi sinh vật biển này, góp phần tăng trưởng kinh tế cho du lịch và kinh doanh cá cảnh trong và ngoài nước

Các chỉ tiêu hình thái là cơ sở ban đầu rất quan trọng để phân loại sinh vật Tuy nhiên, những đặc điểm hình thái, dưới sự tác động của môi trường và biến dị cá thể có thể gây nhầm lẫn trong công tác phân loại Đặc biệt, hải quỳ là loài rất đa dạng về màu sắc, kích cỡ và có rất ít các cấu trúc rõ nét vì thế việc phân loại hải quỳ chỉ dựa vào hình thái là một khó khăn lớn Do đó, phương pháp này cần được kết hợp với phương pháp phân loại bằng chỉ thị sinh học phân tử để có độ chính xác cao hơn

Nhận thấy sự đa dạng sinh học của cá khoang cổ và hải quỳ ở rạn san hô là tiền đề

cho sự phát triển bền vững, đề tài “Phân loại một số loài cá khoang cổ và hải quỳ tại

Khánh Hòa dựa trên đặc điểm hình thái và di truyền” được thực hiện nhằm cung cấp

những dẫn liệu về hình thái và di truyền của một số loài cá khoang cổ và hải quỳ ở Khánh Hòa, làm cơ sở cho các nghiên cứu đánh giá đa dạng sinh học bằng việc xây dựng mã vạch DNA (DNA barcoding)

 Mục đích của đề tài

Nghiên cứu này là một trong những nội dung thuộc mô hình nghiên cứu về ảnh hưởng của biến đổi khí hậu trong rạn san hô, mục đích chủ yếu là xác định thành phần loài cá khoang cổ và hải quỳ để nghiên cứu mối quan hệ cộng sinh giữa chúng

Nghiên cứu sử dụng phương pháp phân loại dựa trên đặc điểm hình thái và di truyền, nhằm xây dựng cơ sở dữ liệu về hình thái và di truyền các loài cá khoang cổ và hải quỳ ở Khánh Hòa Đây là những dẫn liệu đầu vào về đa dạng loài, hệ thống phân loại các loài

cá khoang cổ và hải quỳ, làm cơ sở cho công tác bảo tồn và quản lý nguồn lợi

 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Các loài cá khoang cổ và hải quỳ được thu tại địa bàn tỉnh Khánh Hòa Các nghiên cứu hình thái và di truyền được sử dụng để phân loại và xây dựng cây phát sinh chủng loại của các loài cá khoang cổ và hải quỳ tại Khánh Hòa – Việt Nam

 Nội dung nghiên cứu

 Thu mẫu và phân loại các loài cá khoang cổ và hải quỳ ở Khánh Hòa dựa trên đặc điểm hình thái

 Phân loại các loài cá khoang cổ và hải quỳ bằng chỉ thị sinh học phân tử

 Xây dựng cây phát sinh loài của các loài cá khoang cổ và hải quỳ tại Khánh Hòa

 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Nghiên cứu góp phần khảo sát sự đa dạng các loài cá khoang cổ và hải quỳ tại Khánh Hòa Dữ liệu này được sử dụng để phục vụ cho các nghiên cứu về đa dạng thành phần loài cá khoang cổ và hải quỳ, làm tiền đề cho việc nghiên cứu mối quan hệ cộng sinh giữa hai loài này, là cơ sở nghiên cứu tác động của biến đổi khí hậu đến đa dạng sinh học ở rạn san hô Từ đó có những biện pháp để bảo vệ nguồn lợi các cá khoang cổ và hải quỳ trước sự tác động của biến đổi khí hậu

Hình 1.1 – Bản đồ tỉnh Khánh Hòa – Việt Nam

Ninh Vân

Cả tỉnh có khoảng 40 con sông dài từ 10 km trở lên, tạo thành một mạng lưới sông phân bố dày đặc, dọc bờ biển, cứ khoảng 5 - 7 km có một cửa sông (Nguyễn Thế Biên

và ctv, 2006) Các con sông lớn ở Khánh Hòa phải kể đến: sông Cái Nha Trang, sông Dinh, sông Tô Hạp; riêng khu trung tâm thành phố Nha Trang nằm giữa hai con sông là sông Cái và sông Bé (Thư viện tỉnh Khánh Hòa, 2010)

 Nguồn lợi sinh vật biển

Với những lợi thế về vị trí địa lí và khí hậu ôn hòa, tỉnh Khánh Hòa có nguồn tài nguyên đa dạng phong phú, đặc biệt là nguồn tài nguyên biển Độ đa dạng sinh học các loài sinh vật biển cao, có tới 350 loài san hô đang quần tụ và phát triển, chiếm 45% loài được tìm thấy trên thế giới Sống cùng với hệ sinh thái này là trên 2000 loài sinh vật đáy

và cá cùng nhiều hải sản có giá trị kinh tế cao như tôm hùm, bào ngư, trai ngọc, hải sâm (Mai Chi, 2013)

Khánh Hòa trước đây là nơi chịu ít sự tác động của biến đổi khí hậu hơn các tỉnh khác Nhưng hiện nay, biến đổi khí hậu đã và đang ảnh hưởng trực tiếp đến Khánh Hòa

Ở Khánh Hoà đã bắt đầu xuất hiện một số dấu hiệu cảnh báo sự thay đổi của khí hậu: giá trị tuyệt đối của nhiệt độ cao đến 39.20 C, mực nước biển cũng có xu thế gia tăng, bước đầu xác định được những vùng nhạy cảm, có nguy cơ bị ảnh hưởng cao do tác động của khí hậu biến đổi (Nguyễn Tác An và Nguyễn Kỳ Phùng, 2014) Chính điều này đã tác động đến hệ sinh thái, đặc biệt là rừng ngập mặn, san hô, cỏ biển… ở các khu vực ven biển, đầm vịnh, hải đảo; đồng thời làm giảm thiểu nguồn lợi thủy sản và ảnh hưởng đến độ đa dạng các loài cá biển nơi đây

1.2Tổng quan về cá khoang cổ và hải quỳ

1.2.1 Tổng quan về cá khoang cổ

 Phân loại và phân bố

Cá khoang cổ (còn gọi là cá Hề) thuộc họ cá Thia (Pomacentridae) - họ lớn nhất trong bộ cá Vược (Perciformes).Trên thế giới hiện nay có khoảng 29 loài đã được phân

loại, trong đó 28 loài thuộc giống Amphiprion và 1 loài thuộc giống Premnas (Fautin và

Allen, 1992) Cá khoang cổ đa số sống ở vùng biển nhiệt đới, trong đó khoảng 70% hiện diện ở khu vực Ấn Độ - Tây Thái Bình Dương (Myers, 1991)

Tại Việt Nam xác định có 7 loài cá khoang cổ, toàn bộ cá khoang cổ phân bố tại Việt

Nam đều thuộc giống Amphiprion Cá khoang cổ phân bố nhiều ở vùng biển miền Trung,

mà chủ yếu là ở tỉnh Khánh Hòa, chúng cư trú trong một số hòn đảo của Nha Trang như hòn Tằm, hòn Miếu, hòn Mun, hòn Tre… (Hà Lê Thị Lộc, 2009)

 Đặc điểm sinh học

Cá khoang cổ là loài có kích thước nhỏ, màu sắc đẹp thường sử dụng làm cá cảnh Tùy thuộc vào từng loài khác nhau mà chúng có màu sắc khác nhau như màu cam, hồng, đỏ, nâu hay màu đen Đa số chúng có từ một đến ba sọc trắng trên cơ thể (có thể xuất hiện màu xám) với viền xung quanh có màu tối (thường là màu viền đen) (Allen, 1972)

Cá khoang cổ là loài lưỡng tính, lúc mới sinh tất cả đều mang giới tính đực Về sau, khi đạt đến một kích thước nhất định, cá thể đực thành thục sinh dục lớn nhất trong đàn

sẽ tự biến đổi giới tính của mình để thành cá thể cái, sau đó kết đôi với một cá thể đực khác Nếu cá thể cái bị chết hoặc biến mất vì một lí do nào đó, cá thể đực lớn nhất và trội nhất trong đàn sẽ biến đổi giới tính để thay thế cá thể cái, tuy nhiên có những cá thể vẫn giữ mãi giới tính đực cho đến khi chết (Allen, 1972) Cá thể cái thường to hơn cá thể đực và cá thể đực có nhiệm vụ bảo vệ lãnh thổ

Theo Hattori (1991) sự chuyển đổi giới tính của cá khoang cổ diễn ra theo ba chiều hướng sau: (1) Cá thể đực chưa trưởng thành => cá thể cái chưa trưởng thành => cá thể cái trưởng thành (2) Cá thể đực chưa trưởng thành => cá thể đực trưởng thành => cá thể cái trưởng thành (3) Cá thể đực chưa trưởng thành => cá thể đực trưởng thành

cho cá khoang cổ sinh sống, chúng bảo vệ cá khoang cổ tránh khỏi những động vật ăn thịt nhờ vào các xúc tu có tiết chất độc của mình, nhờ đó mà cá khoang cổ được bảo vệ an toàn, tránh được sự tấn công của các loài ăn thịt khác (Fautin và Allen, 1992)

Kích thước của cá khoang cổ phụ thuộc vào vật chủ hải quỳ mà chúng sống cộng sinh Cá sống với hải quỳ kích thước lớn sẽ tăng trưởng nhanh hơn cá sống với hải quỳ kích thước nhỏ (Fautin, 1991) Màu sắc của cá thay đổi tùy theo giai đoạn phát triển của

cơ thể, vị trí địa lí và phụ thuộc vào vật chủ hải quỳ, cùng một loài cá khoang cổ nhưng sống với các loại hải quỳ có màu sắc khác nhau sẽ khác nhau Vì vậy, cá khoang cổ có màu sắc vô cùng đa dạng và phong phú (Fautin và Allen, 1992)

1.2.2 Tổng quan về hải quỳ

 Phân loại, phân bố

Hải quỳ (hải quỳ biển - sea anemone) là một nhóm động vật ruột khoang rất đơn giản, có quan hệ gần gũi với san hô, sứa, thủy tức… chúng thuộc bộ Actiniaria, ngành ruột khoang (Cnidaria), lớp san hô (Anthozoa) Hiện có khoảng 1200 loài hải quỳ được tìm thấy ở những độ sâu khác nhau trên khắp các đại dương của thế giới, trong đó phân

bố đa dạng nhất ở ven các bờ biển nhiệt đới (Estefânia và ctv, 2014)

 Cấu trúc và đặc điểm sinh học

Hải quỳ chủ yếu có dạng hình ống, cơ thể của chúng rất đơn giản, phía dưới là đĩa bám thường dùng để bám vào các giá thể, phía trên là đĩa miệng chứa miệng ở vị trí

trung tâm và xung quanh có các xúc tu xếp thành nhiều vòng (Hình 1.2) Xúc tu của hải

quỳ rất mềm, có khả năng co giãn mạnh, trên xúc tu có nhiều tiêm mao và các tế bào gai, các xúc tu này thường được hải quỳ sử dụng để bắt mồi, kiếm thức ăn và tự vệ trước

kẻ thù (Fautin và Allen, 1994) Trên đĩa miệng của hải quỳ có hai loại xúc tu: endocoelic

là các xúc tu nằm bên trong đĩa miệng, sắp xếp tỏa tròn bao gồm hai hoặc nhiều vòng xúc tu kéo dài tới tận rìa đĩa miệng; exocoelic là các xúc tu ở ngoài rìa đĩa miệng, thường dài hơn các xúc tu endocoelic, một loài hải quỳ có thể có một hoặc cả hai loại xúc tu này (Fautin, 2008) Trên thân hải quỳ có thể có các nốt sần (verrucae), sự hiện diện hay vắng mặt của nốt sần là một chỉ tiêu quan trọng để định danh chúng (Fautin, 2008) Phương thức sinh sản chủ yếu của hải quỳ là sinh sản hữu tính tuy nhiên chúng cũng

có thể sinh sản sinh dưỡng vô tính (Klinkenberg, 2015), đặc tính này rất hữu ích cho hải quỳ đặc biệt khi chúng bị mắc kẹt vào một tảng đá không có các loài của giới tính khác Một số loài có thể tách ra một phần nhỏ của thân chúng sau đó phát triển thành một hải

quỳ hoàn thiện Một số loài có thể nhân bản theo hai hướng cùng một lúc, từ từ tách đôi theo chiều dọc, kết quả của cả hai phương pháp đều cho hai cá thể giống hệt nhau về hình thái và di truyền (Klinkenberg, 2015)

Hình 1.2 – Cấu trúc chung của hải quỳ

Hải quỳ thường dành phần lớn thời gian bám chặt vào đất đá dưới đáy biển hoặc trên các rạn san hô chờ đợi con mồi Chúng chỉ rời khỏi đó khi bị tấn công hoặc môi trường sống thay đổi và khó kiếm thức ăn bằng cách trượt trên đĩa bám Thân của hải quỳ thường chôn sâu hoặc ẩn vào cát, bùn, khe nứt trong đá hoặc rạn san hô Khi thủy triều xuống thấp các khe nứt, mặt dưới của tảng đá…vẫn mát và ẩm ướt giúp hải quỳ duy trì được sự sống (Fautin và Allen, 1994)

Hải quỳ là loài có sự thay đổi về hình thái, chúng là một trong những thành viên đa dạng nhất của lớp san hô, có sự đa dạng rất lớn trong giải phẫu, hình thái thân và hình thái các xúc tu Hình thức bên ngoài của hải quỳ có thể ngắn hay dài, mảnh hay dày, nhọn hay tù, hình cầu hoặc hình cây (Rodriguez và ctv 2014) Khi trong nước chúng xòe các xúc tu ra như một bông hoa, khi ra khỏi nước thường co các xúc tu rụt vào trong cơ thể để tránh bị khô (Klinkenberg, 2015)

 Tập tính sống

Trong tự nhiên, hải quỳ thường sống cộng sinh với một số loài sinh vật khác như ốc, tôm, tảo…và đặc biệt là cá khoang cổ Hải quỳ lấy dinh dưỡng hằng ngày từ tảo cộng sinh với chúng (zooxanthellae) và tiêu thụ chất thải từ động vật sống chung như cá khoang cổ Các mối quan hệ cộng sinh này luôn đem lại lợi ích cho đôi bên, để cùng nhau tồn tại và phát triển trong đại dương (Fautin, 2008; Fautin và Allen, 1992)

1.3 Phương pháp phân loại bằng hình thái và di truyền

Hình 1.3 – Hai phương pháp dùng để phân loại:(1) Phương pháp phân loại bằng hình thái;

(2) Phương pháp phân loại bằng di truyền

(Nguồn: http://ibol.org/about-us/what-is-dna-barcoding/)

1.3.1 Phân loại bằng hình thái

Phương pháp phân loại dựa trên những đặc điểm hình thái bên ngoài được sử dụng phổ biến, dựa vào những quan sát trực tiếp từ bên ngoài: cấu tạo, hình dạng và màu sắc của cơ thể Sau đó tiến hành đo và đếm các chỉ tiêu phân loại: kích thước toàn thân và từng bộ phận trên cơ thể … Phương pháp này cần thu thập nhiều dữ liệu có liên quan đến việc phân loại, sau đó so sánh giữa những cá thể để tìm ra những điểm chung và những điểm khác biệt, từ đó có những cơ sở để rút ra kết luận phân loại (Vũ Trung Tạng

và Nguyễn Đình Mão, 2005)

Phương pháp phân loại dựa vào hình thái có nhiều thuận lợi vì các dấu hiệu dễ dàng nhìn thấy, thao tác đơn giản, dễ thực hiện và nhanh chóng Tuy nhiên, phương pháp này không giải quyết được triệt để mọi vấn đề của khoa học hiện đại Phân tích hình thái truyền thống không phải lúc nào cũng cung cấp đầy đủ thông tin chính xác Hình thái bên ngoài của những loài gần giống nhau có thể gây ra nhầm lẫn, đòi hỏi người thực hiện phải có kinh nghiệm Nếu mẫu bị hư hỏng hoặc đang trong giai đoạn chưa phát triển sẽ gây khó khăn cho công tác phân loại (Vũ Trung Tạng và Nguyễn Đình Mão, 2005) Do đó cần thiết phải có một số phương pháp khác bổ sung để tăng độ tin cậy của quá trình phân loại, trong đó việc kết hợp với phương pháp di truyền được cho là có độ tin cậy, độ nhạy và tính chính xác cao (Hillis, 1987)

1.3.2 Phân loại bằng di truyền

1.3.2.1 Hệ gen nhân, hệ gen ty thể và các chỉ thị chọn lọc

Hệ gen (genome) là toàn bộ các gen trong tế bào của cơ thể sinh vật, chứa toàn bộ thông tin di truyền đặc trưng cho từng loài, cho từng cá thể trong loài Trong một tế bào của cơ thể, song song tồn tại 2 hệ gen bao gồm hệ gen nhân (nuclear genome) và hệ gen

ty thể (mitochondrial genome, đối với động vật) hoặc lạp thể (chloroplast, đối với thực

vật) Hai hệ gen này đều có sản phẩm riêng, hoạt động có tính chất vừa độc lập, vừa tương tác Genome của tế bào đa phần nằm ở trong nhân (khoảng 99%), tuy nhiên nhân không phải là nơi duy nhất chứa vật chất di truyền, trong ty thể, lạp thể… cũng có gen của riêng mình (Chial và Craig, 2008)

Hệ gen trong nhân thường có kích thước lớn hơn 3 tỷ base pairs (khoảng 3,3 tỷ base pairs ở người) và phân bố trên các nhiễm sắc thể dạng thẳng Hệ gen trong ty thể thì nhỏ hơn (16.569 base pairs ở người) và tồn tại độc lập ở dạng vòng khép kín (Chial

và Craig, 2008) (Hình 1.4)

Hình 1 4 – So sánh hệ gen ty thể và hệ gen nhân

Trong tế bào, DNA ty thể (mtDNA) chiếm 1 đến 5% DNA của tế bào, gồm các gen không có đoạn intron Ở người, mtDNA chứa 37 gen, tất cả các gen này là rất cần thiết cho các hoạt động bình thường của ty thể (Chial và Craig, 2008) Trong đó 13 gen mã hóa cho các protein là các enzyme tham gia vào quá trình phosphoryl hóa oxy hóa, đây là một quá trình sử dụng oxy và đường đơn để tạo ra các loại đường adenosine triphosphate (ATP), nguồn năng lượng chính của tế bào Ngoài ra còn có 2 gen RNA ribosome, 22 gen RNA vận chuyển, một vùng không mã hoá (non-coding region) và một số tiểu phần khác chúng góp phần tạo nên những protein hoạt động (Wolstenholme, 1992)

Do có kích thước nhỏ, lại chứa gen tối cần thiết cho hoạt động sống của tế bào, nên ty thể được xem là đối tượng lý tưởng để khảo sát sự biến đổi trong hệ gen, phục vụ cho các nghiên cứu về giám định, phân loại và lập phả hệ quần thể Các gen trong ty thể lại có hệ số biến đổi nhanh hơn hệ gen nhân 10-15 lần, nên rất thuận lợi cho nghiên cứu về tiến hoá Các gen ty thể trong các loài có quan hệ gần về sinh học có sự bảo tồn rất cao, do vậy, bất cứ sự thay đổi nhỏ nào cũng là dấu hiệu giá trị trong giám định và phân loại Các chỉ thị (marker) của DNA

ty thể thường được sử dụng là các gen mã hóa 12S rRNA, 16S rRNA, cytochrome b,

cytochrome oxydase, tRNA và một số vùng không mã hóa như vùng liên gen trnF-cox3, atp6-trnM, cox1-cox2, cox3-trnK, nad1-trnP (Grande và ctv, 2008)

Tuy nhiên, việc sử dụng DNA ty thể cũng có một số giới hạn, kích thước của DNA

ty thể nhỏ, nên chỉ thể hiện một phần vật chất di truyền Vì vậy nên sử dụng kết hợp các chỉ thị phân tử khác để có kết quả với độ chính xác cao (Hebert và ctv, 2004) Các marker DNA ty thể được sử dụng kết hợp với marker DNA nhân như 18S, 5.8S, 28S… được sử dụng trong một số trường hợp để cho thấy mối quan hệ tiến hóa rõ hơn (Schander và ctv, 2005)

1.3.2.2 Ứng dụng kĩ thuật di truyền trong phân loại

Phương pháp phân loại dựa vào di truyền là một phương pháp hiện đại, tiếp cận nhanh chóng và chính xác Khác với việc phân tích DNA hỗn hợp, việc phân tích một gen xác định có lợi thế và tiện dụng hơn Kỹ thuật di truyền mã vạch DNA - barcoding (Hebert và ctv, 2003) tập trung phân tích trên một đoạn ngắn của hệ gen, sử dụng một cặp mồi chung để khuếch đại đoạn DNA mục tiêu, rồi dựa trên dữ liệu di truyền thu được để xác định các loài một cách nhanh chóng và chính xác

Những tiến bộ mới trong lĩnh vực sinh học phân tử cho phép so sánh một số lượng lớn các loài có quan hệ gần gũi có thể sử dụng trong phân tích phát sinh loài (Chial và Craig, 2008) Phương pháp di truyền hiện đại có thể cung cấp cơ sở khoa học cho việc bảo tồn các hệ sinh thái, cùng với quần thể các loài phân bố trong khu hệ sinh thái và tính đa dạng di truyền của chúng (Ovenden và ctv, 2013; Willette và ctv, 2014)

Các chỉ thị sinh học phân tử đã được nghiên cứu và ứng dụng như là một công cụ hỗ trợ đắc lực cho công tác định danh loài Các chỉ thị sinh học phân tử dùng trong định danh và nghiên cứu di truyền thường là những trình tự có tính bảo tồn cao và biến dị khác biệt giữa các loài nên các DNA ty thể được xem là những đoạn gen có vai trò quan trọng, được sử dụng nhiều trong chỉ thị sinh học phân tử Theo Teletchea (2009), sử dụng DNA ty thể là công cụ hữu hiệu trong phân loại các loài cá, ngoài ra chúng còn được áp dụng cho nhiều loài động vật khác như giáp xác, động vật lưỡng cư… Các nghiên cứu về di truyền cá khoang cổ cũng chứng minh sự hữu ích của DNA ty thể, Litsios và ctv (2014) đã sử dụng gen 16S mtDNA nghiên cứu thành công sự phát sinh loài của các loài cá khoang cổ Một số nghiên cứu khác áp dụng các chỉ thị gen ty thể nghiên cứu di truyền các loài cá khoang cổ cũng chỉ ra rằng sử dụng gen ty thể rất hiệu

quả để định danh và nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa của cá khoang cổ (Santini và ctv, 2006; Li và ctv, 2015)

Tuy nhiên, trên thực tế, sử dụng một cặp mồi chung khuếch đại đoạn gen trong DNA

ty thể có thể định danh được đến loài ở hầu hết các ngành thuộc hệ thống phân loại động vật ngoại trừ ngành ruột khoang Cnidaria (Herbert và ctv, 2004) Do đó việc sử dụng các gen ty thể để định danh các loài hải quỳ là không hiệu quả

Trong hệ gen nhân có một tổ hợp gen quan trọng gọi là tổ hợp ADN ribosome (rDNA), bao gồm các khung gen do 18S - ITS1 – 5.8S - ITS2 - 28S hợp thành Mỗi một

hệ gen có nhiều khung gen nối tiếp nhau Bất kỳ sự thay đổi nào của các gen quan trọng cũng dẫn đến sự biến đổi hệ gen có tính chất đặc trưng của loài vì vậy bất kì gen ribosome nào (18S, 5.8S, 28S) hay vùng giao gen (ITS1, ITS2) đều được sử dụng trong phân tích phân loại (Wilmer, 2008)

Các nghiên cứu di truyền cũng phát hiện ra rằng DNA ty thể phát triển chậm trong hải quỳ và các loài khác trong ngành ruột khoang (Hebert và ctv, 2003), sự tiến hóa của DNA ty thể chậm hơn so với những động vật biển khác 100 lần hoặc hơn (Hellberg, 2007) Nghiên cứu của Shearer và ctv (2002) cho thấy, không giống như tất cả các loài sinh vật đa bào khác, mức độ đột biến trong gen nhân ở lớp anthozoan (lớp san hô) cao hơn nhiều so với ở các gen ty thể Vì vậy phức hợp các gen ribosome trong nhân 18S - ITS1 - 5.8S - ITS2 - 28S được xem là lý tưởng để xác định tới mức loài trong ngành ruột khoang Cnidaria (Commas 1991; Odorico và Miller 1997) Sergiovà ctv (2014) đã

sử dụng các chỉ thị gen 16S mtDNA và 18S rDNA, 28S rDNA nghiên cứu di truyền các loài hải quỳ Kết quả cho thấy chỉ thị gen 16S mtDNA không thể hiện rõ sự phân tách

di truyền của hải quỳ ngoại trừ bộ Ceriantharia; các chỉ thị gen ribosome còn lại hỗ tợ

tốt cho nghiên cứu di truyền hải quỳ hơn gen ty thể

1.4 Các nghiên cứu trong và ngoài nước

1.4.1 Nghiên cứu về cá khoang cổ trong và ngoài nước

 Nước ngoài

Cá khoang cổ và vật chủ của chúng (hải quỳ) đã được chú ý và nuôi làm cảnh từ cuối thế kỉ XIX, tuy nhiên những hiểu biết về đặc điểm sinh học của chúng mãi tới gần giữa thế kỉ XX mới được nghiên cứu Allen (1972) đã nghiên cứu và phân loại cá khoang cổ dựa trên đặc điểm hình thái như tỉ lệ cơ thể, số lượng tia gai ở các vây, hình dạng vẩy ở đầu… Trong đó, chỉ tiêu hình thái quan trọng để phân loại những loài cá này là dựa vào màu sắc của chúng Cũng vào năm đó, Allen phát hành cuốn sách “The Anemonefishs”,

mô tả đặc điểm sinh học của 21 loài cá khoang cổ Năm 1975, Allen tái bản lần thứ hai cuốn sách này và bổ sung 5 loài cá Khoang cổ mới

Nghiên cứu hoàn thiện nhất về phân loại cá khoang cổ dựa vào đặc điểm hình thái được ghi nhận là của Fautin và Allen (1992) Hai tác giả đã phân loại được tổng cộng

28 loài cá khoang cổ thuộc giống Amphiprion, cung cấp đầy đủ thông tin về đặc điểm

hình thái, tập tính sống, sinh sản và phân bố của chúng

Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu phân loại cá khoang cổ dựa vào chỉ thị di truyền Trong đó, Elliott và ctv đã sử dụng gen cytochrome b và gen 16S rRNA

phân loại 6 loài cá khoang cổ đại diện cho 4 phân giống (Subgenus) cơ bản là Actinicola,

Paramphiprion, Phalerebus và Amphiprion (trong đó 5 loài thuộc giống Amphiprion, 1

loài giống Premnas) Ông đã xây dựng cây phân loại và cung cấp mối quan hệ di truyền

giữa các loài cá khoang cổ nằm trong 4 phân giống đại diện cho 28 loài cá khoang cổ đã được biết trên thế giới (Elliott và ctv, 1999)

Năm 2006, Santini và ctv đã nghiên cứu sự tiến hóa của 23 loài cá khoang cổ tại Ý, trong đó ông đã xây dựng cây phân loại dựa trên gen 16S mtDNA và phân tích sự tiến hóa của các loài cá khoang cổ

Boonphakdee và Sawangwong cũng sử dụng hai đoạn gen cytochrome b và 16S rRNA để phân loại cá khoang cổ ở Thái Lan bằng PCR – RELP (Restriction Endonuclease Length Polymorphism) Nghiên cứu này đã phân loại được 7 loài cá

khoang cổ, trong đó, 6 cá thể thuộc giống Amphiprion và 1 cá thể thuộc giống Premnas (Boonphakdee và Sawangwong, 2008)

Trong khi đó Steinke và ctv (2009) đã sử dụng gen cytochrome c oxidase tiểu đơn vị

I (COI) phân loại được 3 loài Amphiprion akallopsisos, A perideraion và A sandarcinos

Litsios đã nghiên cứu di truyền, xây dựng cây phát sinh loài của 28 loài cá khoang cổ từ đảo Galapagos dựa trên gen ty thể Nghiên cứu đã cung cấp những dữ liệu về mối quan

hệ phát sinh loài của các loài cá khoang cổ đồng thời nghiên cứu được mối quan hệ hỗ trợ cộng sinh giữa hải quỳ và cá khoang cổ (Litsios và ctv, 2012)

Gần đây nhất, Li và ctv nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài dựa trên gen ty thể của 7

loài cá khoang cổ thuộc giống Amphiprion và 1 loài thuộc giống Premnas đại diện cho 4

phân giống trong hệ thống phân loại của cá khoang cổ Kết quả nghiên cứu của Li giống với nghiên cứu của Elliott (1999), ông đã cung cấp những dữ liệu về sự tiến hóa phát sinh loài của các loài cá khoang cổ nằm trong 4 phân giống cơ bản (Li và ctv, 2015)

 Trong nước

Ở Việt Nam, năm 1993, báo cáo của WWF (Quỹ quốc tế bảo vệ thiên nhiên) về

“Nghiên cứu tính đa dạng sinh học, sử dụng nguồn lợi ở Hòn Mun - Nha Trang” cho

thấy sự hiện diện của 4 loài cá khoang cổ là Amphiprion clarkii, A frenatus, A

perideraion và A polymnus Đào Tấn Hổ và ctv, sau 8 chuyến điều tra đã bổ sung một

loài cá khoang cổ ở vùng biển Nha Trang là loài Amphiprion sandaracinos (Đào Tấn

Hổ và ctv, 2000)

Từ năm 2000, các nhà khoa học thuộc Phòng Công nghệ sinh học nuôi trồng, Viện Hải dương học Nha Trang đã tiến hành nghiên cứu các đặc điểm sinh học và cho sinh

sản nhân tạo thành công loài cá khoang cổ cam (Amphiprion ocellaris), cung cấp được

2.000 con giống có kích cỡ khoảng 3 - 4cm

Năm 2005, Hà Lê Thị Lộc đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu cơ sở sinh học phục vụ

cho sinh sản cá khoang cổ (Amphiprion sp.) vùng biển Khánh Hòa” trong Luận án Tiến

Sĩ Ngư Loại Học của mình Hà Lê Thị Lộc đã nghiên cứu và phân loại hai loài

Amphiprion clarkii và Amphiprion frenatus dựa trên các đặc điểm hình thái

Astakhov đã khảo sát thành phần loài cá khoang cổ và hải quỳ ở Việt Nam, ông đã xác

định sự hiện diện 5 loài cá khoang cổ ở vùng biển Khánh Hòa gồm Amphiprion clarkii, A

frenatus, A polymnus, A perideraion và A sandaracinos Tại đảo Côn Sơn có 4 loài cá

khoang cổ: A frenatus, A polymnus, A perideraion và A sandaracinos và đảo Bạch Long

Vĩ có 4 loài cá khoang cổ: Amphiprion clarkii, A polymnus, A perideraion và A

sandaracinos (Astakhov, 2001; Astakhov và ctv, 2008; Astakhov, 2012)

Hiện nay trong nước vẫn chưa có công bố nào về nghiên cứu phân loại cá khoang

cổ dựa vào chỉ thị sinh học phân tử

1.4.2 Nghiên cứu về hải quỳ trong và ngoài nước

 Nước ngoài

Về mặt hình thái, Fautin (2008) đã phân loại 19 loài hải quỳ ở vịnh Moreton - phía đông Australia dựa trên phân tích mô học và các đặc điểm bên ngoài như màu sắc, hình thái thân, sự hiện diện hay vắng mặt của các nốt sần trên thân, hình dạng và sự sắp xếp các xúc tu trên đĩa miệng, số lượng xúc tu… Một năm sau đó, Fautin (2009) đã phân loại 16 loài hải quỳ thuộc 7 họ ở Singapore Năm 2012, Kostina đã nghiên cứu 6 loài hải quỳ thuộc 5 họ: Edwardsiidae, Andvakiidae, Condylanthidae, Actiniidae, Metridiidae dựa trên 56 mẫu có ở vịnh Amursky (Nhật Bản) được thực hiện bởi

Zhirmunsky từ năm 1981 đến 2007 Ông đã cung cấp những dữ liệu về hình thái, phân

bố địa lí và nơi sống phổ biến của các loài này Nghiên cứu hoàn thiện nhất về hình thái hải quỳ được ghi nhận là của Fautin và Allen (1994), hai tác giả đã phát hành cuốn sách

“Anemone Fishes and Their Host Sea Anemones” cung cấp những dữ liệu về đặc điểm hình thái, nơi sống, tập tính sống của 37 loài hải quỳ và 24 loài cá khoang cổ

Về di truyền, Wilmer và ctv sử dụng đoạn gen ribosome khuếch đại thành công

6 loài hải quỳ đại diện từ vịnh Moreton: Anemonea sp., Heteractis malu, Stichodactyla

haddoni, Entacmaea quadricolor, Macrodactyla doreensis, Oulactis muscosa (Wilmer

và ctv, 2008) Cũng vào năm này, các nhà khoa học Mỹ do Daly (2008) đứng đầu đã nghiên cứu các mối quan hệ phát sinh loài trong hải quỳ Nghiên cứu này đã phân tích

48 loài hải quỳ từ hai gen ty thể (12S, 16S) và hai gen nhân (18S, 28S) Kết quả chỉ ra rằng sự tiến hóa phân tử trong DNA ty thể hải quỳ phát triển chậm bất thường, tuy nhiên gen 12S hỗ trợ xác định các mối quan hệ trong hải quỳ tốt hơn gen 16S và dữ liệu từ cả hai gen 18S và 28S hỗ trợ rất tốt cho việc nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài trong hải quỳ

 Trong nước

Tại Việt Nam, Astakhov (2001) nghiên cứu khảo sát thành phần các loài hải quỳ và

xác định vùng biển Khánh Hòa có sự hiện diện của 9 loài hải quỳ gồm Cryptodendrum

adhaesivum, Entacmaea quadricolor, Macrodactyla doreensis, Heteractis aurora, H crispa, H magnifica, H malu, Stichodactyla haddoni, và S mertensii Hải quỳ còn được

sử dụng trong một số các nghiên cứu cộng sinh với cá khoang cổ của Hà Lê Thị Lộc Ngoài các nghiên cứu trên thì chưa có công bố nào đáng kể về hình thái và di truyền của

hải quỳ

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Cá khoang cổ và hải quỳ được thu mua tại các tiệm bán cá cảnh ở tỉnh Khánh Hòa

từ 10/11/2014 đến 30/4/2015 Mẫu sau khi thu mua được vận chuyển về phòng thí nghiệm và tiến hành phân loại bằng hình thái ngay khi mẫu còn tươi

Tiến hành cắt mô cơ cá và hải quỳ, cố định trong cồn 960 và bảo quản lạnh ở -200 C

để phục vụ cho các nghiên cứu về di truyền Thay cồn cho các mẫu cá và hải quỳ trong

ba ngày liên tiếp để loại bỏ các tạp chất và sắc tố để bảo quản mẫu được lâu hơn

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Sơ đồ nghiên cứu chung:

2.2.1 Phân loại hình thái

2.2.1.1 Phân loại cá khoang cổ bằng hình thái

Cá sau khi thu về phòng thí nghiệm được quan sát tổng thể bên ngoài cơ thể cá, sau

đó tiến hành đo các chỉ tiêu hình thái (mm), cân trọng lượng (g) cơ thể, đếm các chỉ tiêu phân loại Cá khoang cổ được phân loại theo khóa phân loại và mô tả của Allen (Allen,1975; Allen và ctv, 2005)

Thu mẫu cá khoang cổ và hải quỳ

Phân loại cá khoang cổ và hải quỳ bằng hình thái

 Đo các chỉ tiêu hình thái

 Đếm các chỉ tiêu phân loại

 Quan sát các chỉ tiêu hình thái đặc trưng

Phân loại cá khoang cổ và hải quỳ bằng di truyền

 Tách chiết DNA tổng số

 PCR

 Điện di kiểm tra kết quả

 Gửi mẫu giải trình tự

 Xử lí số liệu di truyền và xây dựng cây phát sinh

Hình 2.1 – Hình thái bên ngoài của cá khoang cổ (Allen, 1975)

 Đo các chỉ tiêu hình thái

Dùng tay hoặc kẹp để kéo căng các vây cá lên, sau đó dùng thước kẹp kĩ thuật có độ chính xác 0,02mm đo các chỉ tiêu hình thái của cá khoang cổ

Cách đo

Dùng thước kẹp đo các chỉ tiêu hình thái sau:

- Chiều dài toàn thân cá (L): đo từ mõm trên của cá đến điểm cuối của vây đuôi

- Chiều dài chuẩn (LS): đo từ mõm trên của cá đến cuống đuôi

- Chiều cao thân cá (H): đo phần cao nhất của thân cá, là khoảng cách ở điểm cao nhất giữa lưng và bụng

- Chiều dài đầu (T): đo từ mõm trên của cá đến điểm mút của xương nắp mang

- Chiều dài gốc vây lưng (lD): đo từ điểm khởi đầu đến điểm kết thúc gốc vây lưng (từ tia vây đầu tiên đến tia vây cuối cùng của gốc vây lưng)

- Chiều dài gốc vây hậu môn (lA): đo từ điểm khởi đầu đến điểm kết thúc vây hậu môn (từ tia vây thứ nhất đến tia vây hậu môn cuối cùng)

- Chiều dài gốc vây ngực (lP): đo từ điểm khởi đầu gốc vây ngực đến cuối vây ngực

- Chiều dài gốc vây bụng (lV): đo từ điểm khởi đầu gốc vây bụng đến cuối vây bụng

Dùng kích hiển vi soi nổi có thang đo để đo các chỉ tiêu sau:

- Chiều dài mõm (LM): đo từ mõm trên của cá đến viền trước của mắt

Hình 2.2 – Các chỉ số đo trong phân loại cá khoang cổ (Allen 1975)

- Đường kính mắt (DE): đo ở phần chính giữa mắt (đường kính ngang hoặc dọc của vành mắt)

 Đếm các chỉ tiêu phân loại

Dùng tay hoặc kẹp để kéo căng các vây cá lên đếm các tia vây cứng và tia vây mềm

có trên các vây của cá khoang cổ Các chữ đầu của tên tiếng Anh được dùng để kí hiệu cho vây

D (Dorsal): số lượng tia và gai vây lưng

V (Ventral): số lượng tia và gai vây bụng

A (Anal) : số lượng tia và gai vây hậu môn

P (Pelvic): số lượng tia và gai vây ngực

C (Caudal): số lượng tia và gai vây đuôi

Số tia gai cứng được kí hiệu bằng chữ số La Mã, còn số lượng tia vây mềm được kí hiệu bằng chữ số thường cách nhau bằng dấu phẩy, dao động giữa các mẫu ghi cách nhau bằng dấu gạch nối

Đếm số vẩy đường bên, số vẩy từ đường bên đến gốc vây hậu môn và số vẩy từ đường bên đến gốc vây lưng

Hình 2.3 –Các chỉ số đếm trong phân loại cá khoang cổ (theo Allen 1975)

2.2.1.2 Phân loại hải quỳ bằng hình thái

Hải quỳ là loài động vật có sự thay đổi hình dáng bên ngoài khi rời khỏi nước, vì vậy cần phân loại hình thái sơ bộ ngay tại nơi thu mẫu, sau đó vận chuyển hải quỳ chứa trong nước biển về phòng thí nghiệm Cho hải quỳ cùng nước biển vào chậu hoặc lọ có kích thước phù hợp với hải quỳ, đợi vài tiếng đồng hồ, khi hải quỳ trở về hình dạng ban đầu, lộ rõ những đặc điểm hình thái thì tiến hành quan sát cẩn thận hơn các đặc điểm riêng của từng loài hải quỳ, tiến hành đo các đặc điểm hình thái (mm), cân trọng lượng (g) Hải quỳ được phân loại theo khóa phân loại và mô tả của Fautin và Allen (1994), Fautin (2008) và Stampar và ctv (2014)

 Quan sát các chỉ tiêu phân loại

Quan sát những đặc điểm đặc trưng trên đĩa miệng và trên thân

- Đĩa miệng: quan sát màu sắc, họa tiết đặc trưng có trên đĩa miệng

- Xúc tu: quan sát hình dạng, kích cỡ, màu sắc của xúc tu Sự sắp xếp của xúc tu trên đĩa miệng: các xúc tu sắp xếp dày đặc hay thưa thớt, sắp xếp xa hay gần miệng, sắp xếp theo hàng hay không

- Thân: quan sát trên thân có các nốt sần (verrucae) hay không, sự sắp xếp và hình dạng của chúng

 Đo các đặc điểm hình thái

- Đường kính đĩa miệng: đo từ đầu bên này đến đầu bên kia của đĩa miệng (phần rộng nhất trên đĩa miệng)

- Đường kính đĩa bám: đo khoảng cách lớn nhất giữa hai đầu của đĩa bám

- Chiều dài thân: đo từ phía dưới đĩa miệng đến chân đĩa bám (phần cao nhất của thân)

- Chiều dài xúc tu: đo từ gốc đến đỉnh của xúc tu; chiều dài trung bình các xúc tu được tính bằng công thức: chiều dài của n xúc tu/n

Hình 2.4 - Các chỉ tiêu đo của hải quỳ (Fautin và Allen, 1994)

2.2.2 Phân loại di truyền

Đọc kết quả

Gửi giải trình tự

Xử lí số liệu, xây dựng cây phát sinh loài

Hình 2.5 – Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu di truyền cá khoang cổ

2.2.2.1 Phân loại cá khoang cổ bằng di truyền

 Tách chiết DNA tổng số

DNA tổng số của cá khoang cổ được tách chiết từ 20mg mẫu cơ từng cá thể bằng bộ kit Thermo Scientific Dream Taq DNA Polymerase (Thermo Scientific), quy trình thực hiện hai bộ kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất (phụ lục 1a) Bảo quản DNA của cá khoang cổ trong tủ đông -400 C

 PCR

Đoạn gen 16S mt DNA cá khoang cổ được khuếch đại với cặp mồi:

16Sar: 5’- CGCCTGTTTATCAAAAACAT- 3’

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Biến tính ban đầu tại 940C trong 3 phút; sau đó là 38 chu kì của 940C trong 30 giây, nhiệt độ lai 480C trong 30 giây, 720C trong 1 phút cuối cùng là bước kéo dài tại 720C trong 7 phút

Hình 2.6 – Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

 Điện di kiểm tra kết quả

Sản phẩm được điện di trên gel agarose 1.5% nhuộm Ethidium bromide để kiểm tra kết quả

Cách chuẩn bị gel agarose 1.5%

 Cân 0,6g agarose cho vào 40ml đệm TBE 1X chứa trong bình tam giác 100ml

 Đun sôi trong lò vi sóng cho đến khi agarose tan hoàn toàn

 Để nguội đến 60-700C rồi chuyển sang bình tam giác 100ml thứ 2 (bình này

có sẵn trong tủ riêng dùng để pha gel chạy điện di)

 Thêm 1,5 µL Ethidium bromide (EtBr), lắc nhẹ tránh tạo bọt và trộn đều Ethidium bromide vào gel agarose

 Đổ gel ra khuôn đã lắp sẵn lược (lược 8 giếng hoặc lược 15 giếng)

 Khi gel nguội và đông cứng lại rút nhẹ nhàng các bản lược ra theo phương thẳng đứng, tránh làm rách các giếng

Chạy điện di

Cho gel đã chuẩn bị vào bể điện di và thêm đệm TBE 1X cho đến khi ngập bản gel, dùng micropipette trộn đều 3 µL mẫu với 1 µL loading dye 6X rồi cho vào các giếng của gel Hút 3 µL DNA Ladder (thang marker DNA) vào một giếng sau đó tiến hành chạy điện di với nguồn điện 90V, 400mA trong 20 phút

960C trong 20 giây, 500C trong 20 giây, cuối cùng là 600C trong 4 phút Sản phẩm sau đó được phân tích bằng thiết bị ABI Prism 3.700 DNA Analyser (Applied Biosystems)

2.2.2.2 Phân loại hải quỳ bằng di truyền

 Tách chiết DNA tổng số

Hải quỳ được tách chiết DNA tổng số từ 25mg mẫu cơ ở đĩa bám hoặc từ xúc tu bằng

bộ kit Qiagen, quy trình thực hiện bộ kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất (phụ lục 1b) Bảo quản DNA của hải quỳ trong tủ đông -400 C

28S seaanemone (10µM) 1 µL

Taq Polymerase (5U/ µL) 0,125 µL

Mẫu DNA 5 µL

H2O 14,875

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Biến tính ban đầu tại 940C trong 2 phút; sau đó là 35 chu kì của 940C trong 20 giây, nhiệt độ lai 550C trong 20 giây, 650C trong 45 giây cuối cùng là bước kéo dài tại 650C trong 5 phút

 Điện di kiểm tra kết quả

Cách chuẩn bị gel agarose 1.5% và chạy điện di giống phần phân loại cá khoang cổ bằng di truyền

Đọc kết quả: Bản gel điện di được soi trên thiết bị UV Transilluminator Sản phẩm của quá trình khuếch đại đối với hải quỳ là các band DNA có kích thước khoảng 800bp (Wilmer và ctv, 2008)

 Giải trình tự DNA

Tương tự trong phần phân loại cá khoang cổ bằng di truyền

2.2.3 Phân tích dữ liệu và xây dựng mối quan hệ phát sinh chủng loại

 Kết nối trình tự và phân tích dữ liệu

Các trình tự gen 16S mtDNA của các loài cá khoang cổ và gen ITS1 – 5.8S – ITS2 rDNA của hải quỳ được kết nối bằng chương trình Sequencher 4.1.4 (www.genecodes.com) và kiểm chứng với dữ liệu Genbank bằng chương trình BLAST (www.blast.ncbi.nlm.nih.gov/) Các trình tự được dóng hàng bằng phần mềm BioEdit 7.2.5 (Hall, 1999), sau đó trình tự được kiểm tra, chỉnh sửa bằng mắt thường, xác định mức độ tương đồng và sự khác biệt di truyền của các loài cá khoang cổ và hải quỳ

Sự khác biệt di truyền của các cặp trình tự các loài cần so sánh được tính theo công thức sau:

Phân tích di truyền được tiến hành với trình tự gen 16S của DNA ty thể các mẫu

cá khoang cổ, bao gồm 7 trình tự của nghiên cứu hiện tại ở Khánh Hòa, Việt Nam

và 12 trình tự từ Genbank

Cây phát sinh loài được xây dựng bằng phần mềm MEGA 6 (Tamura và ctv, 2013) dựa trên thuật toán Neighbor – Joining với giá trị bootstrap (độ tin cậy) (BT) 1000 lần,

độ lặp lại ngẫu nhiên được áp dụng để xác định tính chính xác của thuật toán

LoàiChrysiptera cyanea và Chrysiptera rollandi được sử dụng làm nhóm ngoại, thông

tin về loài, khu vực nghiên cứu, nguồn tham khảo và mã số Genbank được trình bày

ở Bảng 2.1

Bảng 2.1 – Trình tự gen 16S mtDNA của các loài cá khoang cổ

STT Loài Địa điểm thu

mẫu

Mã số Genbank

Tác giả

(orange)

Khánh Hòa Nghiên cứu hiện tại

(*) Loài có trình tự gen làm nhóm ngoại

 Xây dựng mối quan hệ phát sinh chủng loại của các loài hải quỳ

Phân tích di truyền được tiến hành với trình tự gen ITS1 – 5.8S – ITS2 của DNA ribosome các mẫu hải quỳ, bao gồm 2 trình tự của nghiên cứu hiện tại ở Khánh Hòa, Việt Nam và 5 trình tự từ Genbank

Cây phát sinh loài được xây dựng bằng phần mềm MEGA 6 (Tamura và ctv, 2013) dựa trên thuật toán Neighbor – Joining với giá trị bootstrap (độ tin cậy) (BT) 1000 lần,

độ lặp lại ngẫu nhiên được áp dụng để xác định tính chính xác của thuật toán Loài

Leptogorgia virgulata được sử dụng làm nhóm ngoại, thông tin về loài, khu vực nghiên

cứu, nguồn tham khảo và mã số Genbank được trình bày ở Bảng 2.2

Bảng 2.2 – Trình tự gen ITS1 – 5.8S – ITS2 rDNA của các loài hải quỳ

STT Loài Địa điểm thu

mẫu

Mã số Genbank

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Phân loại hình thái

3.1.1 Thành phần loài cá khoang cổ và hải quỳ thu tại Khánh Hòa

A clarkii A frenatus A sandaracinos A polymnus A perideraion A ocellaris

Danh sách các loài được trình bày ở Bảng 3.2

Bảng 3 2– Danh sách các loài cá khoang cổ phổ biến ở Khánh Hòa – Việt Nam

thường gọi

perideraion

Khoang

cổ hồng

Amphiprion sandaracinos

Amphiprion frenatus

Actinicola Amphiprion

ocellaris

Cá nemo

 Hải quỳ

Qua 7 đợt thu mẫu liên tục trong 3 tháng (1/2/2015 – 30/4/2014), bước đầu nghiên cứu xác định vùng biển Khánh Hòa hiện diện 7 loài hải quỳ thuộc 6 giống, 4 họ, 2 bộ

Số lượng cá thể của mỗi loài trong các đợt được thể hiện ở Bảng 3.3

Bảng 3.3 – Kết quả thu mẫu hải quỳ

Ngày

thu

mẫu

Số lượng cá thể của mỗi loài

S tapetum S haddoni E quadricolor M doreensis H aurora P magnus C adhaesivum

Danh sách các loài hải quỳ ở Khánh Hòa được trình bày ở Bảng 3.4

Bảng 3.4 – Danh sách các loài hải quỳ thu được ở Khánh Hòa – Việt Nam

Actiniaria Actiniidae Entacmaea Entacmaea

quadricolor

Hải quỳ bong bóng

doreensis

Hải quỳ chân đỏ

Thalassianthidae Cryptodendrum Cryptodendrum

adhaesivum

Hải quỳ thanh long

Stichodactylidae Stichodactyla Stichodactyla

tapetum

Hải quỳ tím

Stichodactyla haddoni

3.1.2 Đặc điểm hình thái cá khoang cổ và hải quỳ thu tại Khánh Hòa

 Cá khoang cổ

1 Amphiprion perideraion (Bleeker, 1855)

Tên tiếng Anh: Pink anemonefish, Salmon clownfish

Tên tiếng Việt: Cá khoang cổ hồng chỉ trắng, cá khoang cổ tím

Theo FishBase http://www.fishbase.org (cập nhật tháng 12/2014) A perideraion có hệ

thống phân loại như sau:

Giống: Amphiprion (Bloch và Schneider, 1801)

Loài: Amphiprion perideraion (Bleeker, 1855)

Hình 3.1a, b – Hình dáng và màu sắc cá khoang cổ hồng chỉ trắng Amphiprion perideraion

(hình a: cá thể đực, cân nặng 1.81g; hình b: cá thể cái, cân nặng 4.15g)

I, 5 Số vẩy đường bên từ 34 – 42 vẩy Số vẩy từ đường bên đến gốc vây lưng là 4 – 6

vẩy, từ đường bên đến gốc vây hậu môn là 15 – 19 vẩy (phụ lục 2 – Bảng 1a, b)

A perideraion có thân màu hồng đến hồng nhạt, đầu màu hồng sẫm, nhạt dần khi về sau

đuôi và từ lưng xuống bụng Toàn cơ thể phủ vẩy, ngoại trừ mõm và phần dưới ổ mắt Trên thân có hai đường sọc trắng: một sọc trắng bắt đầu từ điểm giữa hai mắt, chạy dọc theo sống lưng kéo dài tới cuống đuôi; một sọc trắng nhỏ đặc trưng nằm phía sau hai mắt

Theo Allen (1975), cá thể A perideraion khi đạt đủ kích thước (khoảng trên 35mm)sẽ

có sự khác biệt về màu sắc giữa cá thể đực và cá thể cái Cá thể đực có một viền hẹp màu cam sáng trên phần rìa tia mềm vây lưng và hai viền ở rìa trên, rìa dưới vây đuôi Còn ở cá thể cái, phần rìa có màu hơi hồng hay trong suốt Cá thể cái thường có kích

thước lớn hơn cá thể đực A perideraion là loài duy nhất mà Allen có thể tìm thấy được

sự khác biệt về màu sắc giữa cá thể đực và cá thể cái

Theo quan sát của chúng tôi, loài A perideraion thu tại Nha Trang có sự khác biệt

về màu sắc và trọng lượng giữa cá thể đực (Hình 3.2a) và cái (Hình 3.2b) giống với mô

tả của Allen (1975)

Hình 3.1 c – Đặc điểm hình thái cá khoang cổ hồng chỉ trắng Amphiprion perideraion

1 – Thân có màu hồng đến hồng nhạt 2 – Một sọc trắng ở phần đầu, nằm sau mắt 3 –

Mõm và phần dưới ổ mắt không có vẩy, sọc trắng bắt đầu từ điểm giữa hai mắt; 4 – Có một sọc hẹp, màu trắng nhạt dọc trên lưng

 Nhận xét

Loài A perideraion nghiên cứu hiện tại thu được có những đặc điểm hình thái đặc trưng cho loài A perideraion cơ bản giống với mô tả của Allen (1975), Allen và ctv (2005) Theo Allen (1975), loài A perideraion có đặc điểm hình thái như sau:

D: IX – X, 16 – 17; A: II, 13 – 14; P: 16 – 18; V: I, 5 Chiều dài chuẩn gấp 2.1 – 2.7 chiều cao thân, gấp 3.0 – 3.4 chiều dài đầu Chiều dài mõm 3.2 – 4 mm, đường kính mắt

3 – 4 mm Số vẩy đường bên 32 – 43 vẩy; số vẩy từ đường bên đến gốc vây lưng là 3 –

4 vẩy, từ đường bên đến gốc vây hậu môn là 19 – 20 vẩy

Loài A perideraion ở vùng biển Nha Trang có đặc điểm hình thái giống với mô tả

của Allen (1975), nhưng có sự khác nhau ở một số điểm: số lượng tia mềm vây hậu môn, chiều dài mõm và đường kính mắt Đa số các chỉ tiêu này trong nghiên cứu hiện tại nằm trong khoảng rộng hơn so với mô tả của Allen (1975) Có lẽ để giải thích sự khác biệt

đó là do các loài cá thu được trong nghiên cứu hiện tại ở các giai đoạn phát triển khác nhau vì vậy các kích thước đo hình thái có sự chênh lệch

Về màu sắc: loài A perideraion thu ở vùng biển Khánh Hòa hoàn toàn giống với mô

tả của Allen (1975) và Allen và ctv (2005)

Kích thước lớn nhất được ghi nhận của loài A perideraion là 100 mm (Lieske và

Myers, 1994) Kích thước lớn nhất nghiên cứu hiện tại thu được là 72.9 mm và nhỏ nhất

là 38.82 mm

 Phân biệt với một số loài tương tự (Allen, 1975)

A nigripes có hình thái tương tự loài A perideraion tuy nhiên A perideraion có 9 –

10 vây lưng có tia cứng còn A nigripes có 11 tia cứng Ngoài ra A perideraion dễ bị nhầm với A akallopisos và A sandaracinos nhưng cả hai loài này đều không có sọc trắng ngay sau mắt như A perideraion

2 Amphiprion sandaracinos(Allen, 1972)

Tên tiếng Anh: Orange anemonefish, Yellow clownfish

Tên tiếng Việt: Cá khoang cổ vàng

Theo FishBase http://www.fishbase.org (cập nhật tháng 12/2014) A sandaracinos có hệ

thống phân loại như sau:

Giống: Amphiprion (Bloch và Schneider, 1801)

Loài: Amphiprion sandaracinos (Allen, 1972)