Sơ đồ tiến hành Tách chiết DNA tổng số PCR Điện di
kiểm tra kết quả
Đọc kết quả
Gửi giải trình tự
Xử lí số liệu, xây dựng cây phát sinh loài
Hình 2.5 – Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu di truyền cá khoang cổ
2.2.2.1 Phân loại cá khoang cổ bằng di truyền
Tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số của cá khoang cổ được tách chiết từ 20mg mẫu cơ từng cá thể bằng bộ kit Thermo Scientific Dream Taq DNA Polymerase (Thermo Scientific), quy trình thực hiện hai bộ kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất (phụ lục 1a). Bảo quản DNA của cá khoang cổ trong tủ đông -400 C.
PCR
Đoạn gen 16S mt DNA cá khoang cổ được khuếch đại với cặp mồi:
16Sbr: 5’- CCGGTCTGAACTCAGATCACGT- 3’ (Palumbi và ctv, 1991). Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích 25µL bao gồm:
Buffer (1X) 2,5 µL dNTP (10µM) 0,5 µL
16Sar (10µM) 1 µL 16Sbr (10µM) 1 µL Taq Polymerase (5U/ µL) 0,125 µL Mẫu DNA 5 µL H2O 14,875
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Biến tính ban đầu tại 940C trong 3 phút; sau đó là 38 chu kì của 940C trong 30 giây, nhiệt độ lai 480C trong 30 giây, 720C trong 1 phút cuối cùng là bước kéo dài tại 720C trong 7 phút.
Hình 2.6 – Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Điện di kiểm tra kết quả
Sản phẩm được điện di trên gel agarose 1.5% nhuộm Ethidium bromide để kiểm tra kết quả.
Cách chuẩn bị gel agarose 1.5%
Cân 0,6g agarose cho vào 40ml đệm TBE 1X chứa trong bình tam giác 100ml. Đun sôi trong lò vi sóng cho đến khi agarose tan hoàn toàn.
Để nguội đến 60-700C rồi chuyển sang bình tam giác 100ml thứ 2 (bình này có sẵn trong tủ riêng dùng để pha gel chạy điện di).
Thêm 1,5 µL Ethidium bromide (EtBr), lắc nhẹ tránh tạo bọt và trộn đều Ethidium bromide vào gel agarose.
Đổ gel ra khuôn đã lắp sẵn lược (lược 8 giếng hoặc lược 15 giếng).
Khi gel nguội và đông cứng lại rút nhẹ nhàng các bản lược ra theo phương thẳng đứng, tránh làm rách các giếng.
Chạy điện di
Cho gel đã chuẩn bị vào bể điện di và thêm đệm TBE 1X cho đến khi ngập bản gel, dùng micropipette trộn đều 3 µL mẫu với 1 µL loading dye 6X rồi cho vào các giếng của gel. Hút 3 µL DNA Ladder (thang marker DNA) vào một giếng sau đó tiến hành chạy điện di với nguồn điện 90V, 400mA trong 20 phút.
Đọc kết quả
Bản gel điện di được soi trên thiết bị UV Transilluminator. Sản phẩm của quá trình khuếch đại đối với cá khoang cổ là các band DNA có kích thước khoảng 650bp.
Giải trình tự DNA
Sản phẩm PCR được gửi đến công ty THNHH Nam Khoa – thành phố Hồ Chí Minh giải trình tự. Phản ứng giải trình tự được tiến hành theo nguyên tắc Dey – labelles dideoxy terminator với các đoạn mồi tương tự như phản ứng PCR theo chương trình luân nhiệt sau: 960C trong 20 giây, 500C trong 20 giây, cuối cùng là 600C trong 4 phút. Sản phẩm sau đó được phân tích bằng thiết bị ABI Prism 3.700 DNA Analyser (Applied Biosystems). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2.2.2 Phân loại hải quỳ bằng di truyền
Tách chiết DNA tổng số
Hải quỳ được tách chiết DNA tổng số từ 25mg mẫu cơ ở đĩa bám hoặc từ xúc tu bằng bộ kit Qiagen, quy trình thực hiện bộ kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất (phụ lục 1b). Bảo quản DNA của hải quỳ trong tủ đông -400 C.
PCR
Đoạn gen ribosome ITS1 – 5.8S – ITS2 rDNA của hải quỳ được khuếch đại với cặp mồi:
18S seaanemone: 5’- GGCGACCCGCTGAATTCAAGCATAT - 3’
28S seaanemone: 5’- GCTTTGGGCTGCAGTCCCAAGCAACCCACTC - 3’ (Wilmer và ctv, 2008)
Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích 25µL bao gồm: Buffer (1X) 2,5 µL
dNTP (10µM) 0,5 µL 18S seaanemone (10µM) 1 µL
28S seaanemone (10µM) 1 µL Taq Polymerase (5U/ µL) 0,125 µL Mẫu DNA 5 µL H2O 14,875
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Biến tính ban đầu tại 940C trong 2 phút; sau đó là 35 chu kì của 940C trong 20 giây, nhiệt độ lai 550C trong 20 giây, 650C trong 45 giây cuối cùng là bước kéo dài tại 650C trong 5 phút.
Điện di kiểm tra kết quả
Cách chuẩn bị gel agarose 1.5% và chạy điện di giống phần phân loại cá khoang cổ bằng di truyền.
Đọc kết quả: Bản gel điện di được soi trên thiết bị UV Transilluminator. Sản phẩm của quá trình khuếch đại đối với hải quỳ là các band DNA có kích thước khoảng 800bp (Wilmer và ctv, 2008).
Giải trình tự DNA
Tương tự trong phần phân loại cá khoang cổ bằng di truyền.