Kết nối trình tự và phân tích dữ liệu
Các trình tự gen 16S mtDNA của các loài cá khoang cổ và gen ITS1 – 5.8S – ITS2 rDNA của hải quỳ được kết nối bằng chương trình Sequencher 4.1.4 (www.genecodes.com) và kiểm chứng với dữ liệu Genbank bằng chương trình BLAST (www.blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Các trình tự được dóng hàng bằng phần mềm BioEdit 7.2.5 (Hall, 1999), sau đó trình tự được kiểm tra, chỉnh sửa bằng mắt thường, xác định mức độ tương đồng và sự khác biệt di truyền của các loài cá khoang cổ và hải quỳ.
Sự khác biệt di truyền của các cặp trình tự các loài cần so sánh được tính theo công thức sau:
Số nucleotide khác biệt
Sự khác biệt di truyền = x 100%
Tổng số nucleotide dóng hàng
Phân tích di truyền được tiến hành với trình tự gen 16S của DNA ty thể các mẫu cá khoang cổ, bao gồm 7 trình tự của nghiên cứu hiện tại ở Khánh Hòa, Việt Nam và 12 trình tự từ Genbank.
Cây phát sinh loài được xây dựng bằng phần mềm MEGA 6 (Tamura và ctv, 2013) dựa trên thuật toán Neighbor – Joining với giá trị bootstrap (độ tin cậy) (BT) 1000 lần, độ lặp lại ngẫu nhiên được áp dụng để xác định tính chính xác của thuật toán. LoàiChrysiptera cyanea và Chrysiptera rollandi được sử dụng làm nhóm ngoại, thông tin về loài, khu vực nghiên cứu, nguồn tham khảo và mã số Genbank được trình bày ở Bảng 2.1.
Bảng 2.1 – Trình tự gen 16S mtDNA của các loài cá khoang cổ
STT Loài Địa điểm thu
mẫu
Mã số Genbank
Tác giả 1 A. perideraion Khánh Hòa Nghiên cứu hiện tại 2 A. rubrocinctus Thụy Sĩ KJ833753.1 Litsios và ctv, 2014 3 A. clarkii (black) Khánh Hòa Nghiên cứu hiện tại 4 A. clarkii
(orange)
Khánh Hòa Nghiên cứu hiện tại
5 A. clarkii Thụy Sĩ KF264159.1 Litsios và ctv, 2014 6 A. sandaracinos Khánh Hòa Nghiên cứu hiện tại 7 A. allardi Thụy Sĩ KF264152.1 Litsios và ctv, 2014 8 A. pacificus Thụy Sĩ KF264174.1 Litsios và ctv, 2014 9 A. frenatus Khánh Hòa Nghiên cứu hiện tại 10 A. akindynos Thụy Sĩ KF264151.1 Litsios và ctv, 2014 11 A. polymnus Khánh Hòa Nghiên cứu hiện tại 12 A. chagosensis Thụy Sĩ KF819364.1 Litsios và ctv, 2014 13 A. ocelaris Khánh Hòa Nghiên cứu hiện tại 14 A. nigripes Thụy Sĩ KF264170.1 Litsios và ctv, 2014 15 A. sebae Ấn độ HQ020377.1 John và ctv, 2010 16 A. tricinctus Thụy Sĩ KF264186.1 Litsios và ctv, 2014 17 A. percula Thụy Sĩ KF264176.1 Litsios và ctv, 2014 18 A. mccullochi Thụy Sĩ KF264168.1 Litsios và ctv, 2014
19 A. latifasciatus Pháp JF457235.1 Hubert và ctv, 2012 20 Premnas biaculeatus Thụy Sĩ KF264189.1 Litsios và ctv, 2014 21 Chrysiptera cyanea * Mỹ AF114838.1 Elliott và ctv, 1999 22 Chrysiptera rollandi* Mỹ AY098629.1 Tang và ctv, 2004 (*) Loài có trình tự gen làm nhóm ngoại. Xây dựng mối quan hệ phát sinh chủng loại của các loài hải quỳ
Phân tích di truyền được tiến hành với trình tự gen ITS1 – 5.8S – ITS2 của DNA ribosome các mẫu hải quỳ, bao gồm 2 trình tự của nghiên cứu hiện tại ở Khánh Hòa, Việt Nam và 5 trình tự từ Genbank.
Cây phát sinh loài được xây dựng bằng phần mềm MEGA 6 (Tamura và ctv, 2013) dựa trên thuật toán Neighbor – Joining với giá trị bootstrap (độ tin cậy) (BT) 1000 lần, độ lặp lại ngẫu nhiên được áp dụng để xác định tính chính xác của thuật toán. Loài
Leptogorgia virgulata được sử dụng làm nhóm ngoại, thông tin về loài, khu vực nghiên cứu, nguồn tham khảo và mã số Genbank được trình bày ở Bảng 2.2.
Bảng 2.2 – Trình tự gen ITS1 – 5.8S – ITS2 rDNA của các loài hải quỳ
STT Loài Địa điểm thu
mẫu Mã số Genbank Tác giả 1 Stichodactyla tapetum
Khánh Hòa Nghiên cứu hiện tại
2 Heteractis magnifica
Singapore AF050209.1 Nelson và cttv (1999)
3 Macrodactyla doreensis
Khánh Hòa Nghiên cứu hiện tại
4 Urticina crassicornis Nga JQ844117.1 Bocharova (2012) 5 Actinia bermudensis Brazil JN118562.1 Gomes và ctv (2012)
6 Aulactinia marplatensis Mỹ EF026602.1 Acuna và ctv (2008) 7 Bunodosoma cangicum Brazil JN118561.1 Gomes và ctv (2012) 8 Leptogorgia virgulata* Mỹ AY268464.1 LePard và ctv, 2003 (*) Loài có trình tự gen làm nhóm ngoại.
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1 Phân loại hình thái