Định loại các loài cá bơn phổ biến tại khánh hòa dựa trên đặc điểm hình thái, di truyền và ước tính thời gian phân hóa loài

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐỊNH LOẠI CÁC LOÀI CÁ BƠN PHỔ BIẾN TẠI KHÁNH HỊA DỰA TRÊN ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, DI TRUYỀN VÀ ƯỚC TÍNH THỜI GIAN PHÂN HĨA LỒI Giảng viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: Mã số sinh viên: TS Đặng Thúy Bình Phạm Thiên Phú 56131191 Khánh Hòa − 2018 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG BỘ MÔN SINH HỌC ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐỊNH LOẠI CÁC LOÀI CÁ BƠN PHỔ BIẾN TẠI KHÁNH HÒA DỰA TRÊN ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, DI TRUYỀN VÀ ƯỚC TÍNH THỜI GIAN PHÂN HĨA LỒI GVHD: TS Đặng Thúy Bình SVTH: Phạm Thiên Phú MSSV: 56131191 Khánh Hòa, tháng năm 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết đề tài: “Định loại loài cá bơn phổ biến Khánh Hòa dựa đặc điểm hình thái, di truyền ước tính thời gian phân hóa lồi” cơng trình nghiên cứu cá nhân tơi chưa cơng bố cơng trình khoa học khác thời điểm Nha Trang, ngày 19 tháng năm 2018 Sinh viên Phạm Thiên Phú i LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập nghiên cứu đề tài trường Đại học Nha Trang, em xin chân thành cảm ơn quan tâm nhà trường, giúp đỡ tận tình thầy cô giáo, đặc biệt thầy cô giáo cán thuộc Viện Công nghệ Sinh học Môi trường truyền kiến thức kinh nghiệm quý báu cho em năm học vừa qua Với tình cảm chân thành lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn đến TS Đặng Thúy Bình (Viện Cơng nghệ Sinh học & Mơi trường) định hướng tận tình hướng dẫn cho em suốt trình thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến NCS Vũ Đặng Hạ Quyên, ThS Trương Thị Oanh ThS Trần Quang Sáng (Viện Công nghệ Sinh học & Môi trường) ThS Đồn Vũ Thịnh (Khoa Cơng Nghệ Thơng Tin) động viên dìu dắt em suốt trình nghiên cứu, thực đề tài viết luận văn tốt nghiệp Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, bạn bè anh chị phòng thí nghiệm sinh học phân tử quan tâm, giúp đỡ hỗ trợ em suốt thời gian thực để em hoàn thành đồ án tốt nghiệp Mặc dù, em cố gắng để hoàn thiện đồ án thời gian kiến thức hạn chế, nên q trình thực đồ án tránh khỏi thiếu sót Em mong nhận đóng góp ý kiến quý báu thầy, cô giáo để đồ án hoàn thiện hơn.Em xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, ngày 19 tháng năm 2018 Sinh viên Phạm Thiên Phú ii TĨM TẮT Thành phần lồi cá bơn Việt Nam phong phú đa dạng Đây lồi cá có giá trị thương phẩm sử dụng làm thực phẩm phổ biến người dân ven biển Bộ cá bơn (Pleuronectiformes) Việt Nam ghi nhận có tới 97 lồi, thuộc 33 giống, họ Vùng biển Khánh Hòa nơi có mật độ cá bơn tập trung cao Tuy nhiên năm vừa qua, nghề khai thác thủy sản ven bờ tỉnh Khánh Hòa phát triển mức với lượng chất thải độc hại gia tăng làm suy giảm nghiêm trọng nguồn lợi Mặt khác, chưa có nghiên cứu di truyền sâu vào khảo sát mối quan hệ phát sinh chủng loại ước tính thời gian phân hóa lồi thuộc cá bơn (Pleuronectiformes) khu vực Chính vậy, nghiên cứu tiến hành định loại số loài cá bơn phổ biến Khánh Hòa dựa vào đặc điểm hình thái di truyền (sử dụng gen CO1 mtDNA) Nghiên cứu ghi nhận 16 loài thuộc 10 giống, họ Cây phát sinh loài cho thấy đồng dạng loài cá nghiên cứu mức giống, nhiên, mức độ họ, họ cá bơn vỉ (Bothidae) xếp với loài thuộc họ cá bơn sọc (Soleidae) họ cá bơn cát (Paralichthyidae) Thời gian phân hóa cá bơn so sánh với dẫn liệu hóa thạch ước tính cách khoảng 72,58 triệu năm trước (Ma), thuộc kỷ Cretaceous, Upper Cretaceous, tầng Campanian Thời gian phân hóa lồi cá bơn liên quan đến hình thành đặc điểm phân loại (vây ngực, xương trước nắp mang, hình thành mắt) Các liệu nghiên cứu sử dụng cho nghiên cứu đa dạng sinh học, nghiên cứu chun sâu q trình tiến hóa cơng tác bảo tồn lồi cá tầng đáy nói chung cá bơn nói riêng iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT iii MỤC LỤC ivs DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan vùng nghiên cứu 1.2 Tổng quan đối tượng nghiên cứu (bộ cá bơn – Pleuronectiformes) 1.2.1 Giới thiệu cá bơn (Pleuronectiformes) 1.2.2 Tình hình nghiên cứu hình thái cá bơn (Pleuronectiformes) nước nước 1.2.3 Tình hình nghiên cứu di truyền cá bơn .8 1.3 Tổng quan phương pháp nghiên cứu 11 1.3.1 Tổng quan hệ gen ty thể 11s 1.3.2 Ứng dụng thị phân tử nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài 13 1.3.3 Giới thiệu ước tính thời gian phân hóa lồi (divergence time) phương pháp phân tích đồng hồ phân tử (molecular clock) 14 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .16 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 16 2.2 Thu thập định loại loài cá bơn phổ biến Khánh Hòa dựa đặc điểm hình thái 17 2.2.1 Đối tượng, địa điểm phương pháp thu mẫu 17 2.2.2 Định loại loài cá bơn phổ biến dựa vào đặc điểm hình thái .17 2.3 Khuếch đại giải trình tự đoạn gen CO1 mtDNA số loài cá bơn phổ biến vùng biển Khánh Hòa 18 2.3.1 Tách chiết DNA tổng số .18 2.3.2 Kiểm tra DNA tổng số 18 2.3.3 Khuếch đại đoạn gen CO1 mtDNA phản ứng PCR 19 iv 2.3.4 Giải trình tự gen CO1 mtDNA .20 2.4 Xây dựng phát sinh chủng loại ước tính thời gian phân hóa lồi (divergence time) cá bơn 20 2.4.1 Xây dựng phát sinh chủng loại loài cá bơn phổ biến Khánh Hòa sử dụng trình tự gen CO1 mtDNA 20 2.4.2 Ước tính thời gian phân hóa (divergence time) lồi cá bơn 22 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Thu thập định loại loài cá bơn phổ biến Khánh Hòa dựa đặc điểm hình thái 24 3.2 Đặc điểm hình thái lồi thuộc cá bơn (Pleuronectiformes) thu Khánh Hòa 25 3.3 Khuếch đại giải trình tự đoạn gen CO1 mtDNA số lồi cá bơn phổ biến vùng biển Khánh Hòa 32 3.3.1 Tách chiết DNA tổng số .32 3.3.2 Khuếch đại, giải trình tự đoạn gen CO1 mtDNA số lồi cá bơn 32 3.3.3 So sánh tương đồng trình tự với Genbank 33 3.3.4 So sánh khác biệt trình tự gen CO1 mtDNA 16 loài cá bơn phổ biến Khánh Hòa 36 3.4 Xây dựng phát sinh chủng loại cá bơn 38 3.5 Ước tính thời gian phân hóa loài cá bơn 42 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .49 4.1 KẾT LUẬN 49 4.2 KIẾN NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC .59 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Bản đồ hành khu vực tỉnh Khánh Hòa Hình 1.2 Quá trình biến đổi mắt cá bơn Nhật Bản (Paralichthys olivaceus) Hình 1.3 DNA ty thể lồi cá Bơn Mắt Lệch (Crossorhombus azureus) bao gồm 37 gen mã hóa đặc trưng cho 22tRNA, 2rRNA 13 vùng mã hóa protein (Shi cs, 2013) 12 Hình 2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 16 Hình 2.2 Một số đặc điểm hình thái dùng định loại cá bơn 17 Hình 2.3 Các số đếm phân loại cá bơn (Carpenter Niem, 2001) .18 Hình 2.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR sử dụng cặp mồi FishF1 - FishR1 20 Hình 3.1 Tỷ lệ (%) giống, loài thành phần cá bơn thu Khánh Hòa 25 Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm PCR đoạn gen CO1 mtDNA mẫu cá bơn .32 Hình 3.3 Cây phát sinh chủng loại từ phương pháp Maximum Likelihood (mơ hình tiến hóa GTR+G+I) dựa trình tự gen CO1 mtDNA lồi cá bơn phổ biến Khánh Hòa 38 Hình 3.4 Cây ước tính thời gian phân hóa lồi cá bơn dựa trình tự gen CO1 mtDNA 43 Hình 3.5 Đặc điểm khơng có vây ngực họ cá bơn lưỡi bò (Cynoglossidae) 44 Hình 3.6 Sự xuất vây ngực giống thuộc họ cá bơn sọc (Soleidae) 45 Hình 3.7 Đặc điểm khơng có xương trước nắp mang họ cá bơn sọc (Soleidae) họ cá bơn lưỡi bò (Cynoglossidae) 46 Hình 3.8 Đặc điểm mắt lồi thuộc họ cá bơn mơi vỉ (Bothidae) 46 Hình 3.9 Đặc điểm giống cá bơn khoang (Zebrias) cá bơn lưỡi trâu (Brachirus) 47 Hình 3.10 Đặc điểm giống cá bơn vảy tròn (Liachirus) cá bơn hoa (Pardachirus)48 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR 19 Bảng 2.2 Trình tự gen CO1 mtDNA loài cá bơn sử dụng xây dựng phát sinh chủng loại .21 Bảng 3.1 Danh sách loài cá bơn thu Khánh Hòa, Việt Nam 24 Bảng 3.2 Chỉ tiêu hình thái lồi cá bơn phổ biến Khánh Hòa 31 Bảng 3.3 Kết độ tương đồng trình tự CO1 mtDNA từ 16 lồi cá bơn thu Khánh Hòa với liệu từ Genbank .33 Bảng 3.4 Sự khác biệt trình tự CO1 mtDNA 16 lồi cá bơn phổ biến Khánh Hòa .37 vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT μL Microliter μM Micromol bp Base pairs BT Bootstrap cs Cộng CO1 Cytochrome c oxidase subunit Cyt b Cytochrome b DNA Deoxyribonucleic acid GB mt DNA Ký hiệu cho loài từ Genbank Mitochondrial deoxyribonucleic acid ND1 NADH dehydrogenase, subunit PCR Polymerase Chain Reaction Rag Recombinase Activating Gene RNA Ribonucleic acid rRNA Ribosomal ribonucleic acid Ma Million years ago − triệu năm trước RH Rhodopsin RAG1 Recombination Activating Gene RAG2 Recombination Activating Gene E1 E2B E3 MLL Early Growth Response Protein genes Early Growth Response Protein genes 2B Early Growth Response Protein genes Mixed-lineage Leukemia viii a b Hình 3.10 Đặc điểm giống cá bơn vảy tròn (Liachirus) cá bơn hoa (Pardachirus) a − Vây đuôi không liền với vây lưng vây hậu mơn; b − Khơng có vây ngực 48 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Từ kết trên, đưa số kết luận sau: Nghiên cứu thu thập định loại 16 loài cá bơn địa bàn tỉnh Khánh Hòa thuộc 10 giống, họ (Bothidae, Paralichthyidae, Cynoglossidae, Soleidae), có lồi chưa định danh xác (Engyprosopon cf grandisquama Crossorhombus cf azureus) Khuếch đại giải trình tự đoạn gen CO1 DNA ty thể số loài cá bơn phổ biến vùng biển Khánh Hòa Sự khác biệt di truyền 16 loài cá bơn nằm khoảng 12,2% (76/625 nucleotide) – 25,8% (161/625 nucleotide), khác biệt lớn loài Pseudorhombus arsius Cynoglossus bilineatus, khác biệt nhỏ loài Paraplagusia japonica Paraplagusia blochii Cây phát sinh loài dựa trình tự gen CO1 mtDNA 16 lồi cá bơn cho thấy đồng dạng mức độ giống Các loài thuộc họ cá bơn vỉ (Bothidae) xếp với loài thuộc họ cá bơn sọc (Soleidae) họ cá bơn cát (Paralichthyidae) Thời gian phân hóa bơn so sánh với dẫn liệu hóa thạch ước tính cách khoảng 72,58 triệu năm trước (Ma), thuộc kỷ Cretaceous, Upper Cretaceous, tầng Campanian Thời gian phân hóa lồi cá bơn liên quan đến hình thành đặc điểm phân loại (vây ngực, xương trước nắp mang, hình thành mắt) 4.2 KIẾN NGHỊ Khảo sát chi tiết phân bố, đặc điểm hình thái đa dạng sinh học loài cá bơn Khánh Hòa Sự sai khác trình tự lồi cá bơn thu Khánh Hòa với trình tự tương ứng Genbank đòi hỏi phải có nhiều nghiên cứu nhằm cung cấp tiêu phân loại lồi cá bơn mặt hình thái di truyền cách xác thống Mở rộng hướng khảo sát đa dạng lồi cá bơn Khánh Hòa dựa đặc điểm hình thái di truyền, đồng thời xây dựng mối quan hệ phát sinh chủng loại ước tính thời gian phân hóa lồi cá nghiên cứu sử dụng thị phân tử khác 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Đinh Thị Phương Anh, Phan Thị Hoa (2010), “Thành phần loài cá vùng biển Nam bán đảo Sơn Trà, thành phố Đà Nẵng”, Tạp chí khoa học cơng nghệ, Đại học Đà Nẵng, 36 (1), tr 56 – 64 Nguyễn Thế Biên, Nguyễn Đức Vượng, Hồ Lương Tụy, Đỗ Hoài Nam, Trương Thị Nhàn, Hoàng Đức Cường & Nguyễn Văn Điển (2006), “Đánh giá cân nước định hướng sử dụng bền vững, bảo vệ tài nguyên môi trường nước Khánh Hòa”, Thành phố Hồ Chí Minh Lê Quang Dũng (2013), “Sử dụng cá bơn cynoglossus arel bloch & schneider, 1801 sinh vật thị đánh giá ô nhiễm kim loại nặng vùng biển Hạ Long - Cát Hải”, Tạp chí Khoa học Công nghệ Biển, 13(4), tr 382 – 389 Trần Đắc Định, Shibukawa Koichi, Nguyễn Thanh Phương, Hà Phước Hùng, Trần Xuân Lợi, Mai Văn Hiếu, Utsugi Kenzo (2013), Mô tả định loại cá đồng sông Cửu Long, Việt Nam, NXB Đại học Cần Thơ Huỳnh Thị Hậu (2016), Ứng dụng gen mã vạch cytochrome oxidase subunit i (COI) DNA ty thể để phân loại số loài cá nước khu vực Duyên hải Nam Trung Bộ Tây Nguyên, đồ án tốt nghiệp đại học, Đại học Nha Trang Trần Thị Hồng Hoa, Võ Văn Quang, Nguyễn Phi Uy Vũ, Lê Thị Thu Thảo, Trần Cơng Thịnh (2014), “Thành phần lồi cá khai thác vịnh Vân Phong, tỉnh Khánh Hòa”, Tuyển tập Nghiên Cứu Biển, 20, tr 70 – 88 Nguyễn Hữu Hồ, Bùi Hồng Long, Nguyễn Tấn Hương, Trương Thị Phương Thảo, Nguyễn Văn Thắng, Thiệu Quang Tân Nguyễn Đình Thanh (2003), Báo cáo tổng kết nghiên cứu khoa học đề tài: Đặc điểm khí hậu thủy văn Khánh Hòa Nguyễn Hữu Phụng (1999), Danh mục cá biển Việt Nam - Tập V: Bộ cá mù (Scorpaeniformes), cá bơn (Pleuronectiformes), cá (Tetraodontiformes), cá nhái (Lophiformes), cá cóc (Batrachoidiformes) cá rồng (Pegasiformes) Viện hải dương học Nha Trang NXB nông nghiệp Trần Văn Phước (2011), “Hiện trạng nguồn lợi thủy sản khai thác nò sáo thơn Tân Đảo – Đầm Nha Phu, tỉnh Khánh Hòa” Khoa ni trồng Thủy sản – Trường Đại học Nha Trang, tr 386 – 394 50 10 Đinh Thị Phượng (2017), Nghiên cứu thành phần loài cá sống tầng đáy phổ biến Phú n Khánh Hòa dựa vào đặc điểm hình thái di truyền, đồ án tốt nghiệp đại học, Đại học Nha Trang 11 Trịnh Thị Minh Trang, Nguyễn Thị Nguyệt Hà, Trần Đức Thạnh (2015), “Tài nguyên vị vùng bờ Khánh Hòa: tiềm triển vọng”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Biển, 15(1), tr 13-24 12 Trần Anh Tuấn Nguyễn Thế Tiệp (2015), “Nghiên cứu đặc điểm địa mạo, trầm tích mối liên hệ chúng để xác định dấu vết đường bờ cổ khu vực thềm lục địa Đà Nẵng – Phan Thiết” Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Biển,15(1), tr 25 – 34 Tài liệu tiếng Anh Alcock, A W (1894), “Natural history notes from H M Indian marine survey steamer “Investigator”, Ser II No 11” An account of a recent collection of bathybial fishes from the Bay of Bengal and from the Lakshadweep Sea, 63, pp 115-137 Alcock, A W (1899), “A descriptive catalogue of the Indian deep- sea fishes in the Indian Museum, being a revised account of the deep-sea fishes collected by the Royal Indian Marine Survey Ship Investigator” Indian Museum, Calcutta, pp.211 Allen, G R and Erdmann M V (2012), Reef fishes of the East Indies Perth, Australia: Universitiy of Hawai'i Press, Volumes I-III, Tropical Reef Research Amezcua, F and Nash, R.D.M (2001), “Distribution of the Order Pleuronectiformes and its relation to the sediment type in the north Irish Sea”, Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom, 45, pp 293-301 Anand, P., Roy, A.S.R (2014), “Molecular Markers in Phylogenetic Studies-A Review”, Journal of Phylogenetics & Evolutionary Biology, 02(02) Barba-Montoya, J., dos Reis, M and Yang, Z (2017), “Comparison of different strategies for using fossil calibrations to generate the time prior in Bayesian molecular clock dating”, Molecular Phylogenetics and Evolution The Authors, 114, pp 386-400 Betancur, R and Ortí, G (2014), “Molecular evidence for the monophyly of flatfishes (Carangimorpharia: Pleuronectiformes)”, Molecular Phylogenetics and Evolution Elsevier Inc., 73(1), pp 18–22 Bleeker, P (1865), “Description de quelques espèces inédites des genres Pseudorhombus et Platophrys de l’Inde Archipélagique” Nederlandsch Tijdschrift voor de Dierkunde, 3, pp 43–50 51 Bleeker, P (1851), “Nieuwe bijdrage tot de kennis der ichthyologische fauna van Borneo met beschrijving van eenige nieuwe soorten van zoetwatervisschen”, Natuurkundig Tijdschrift voor Nederlandsch India, 1, pp 259-275 10 Bleeker, P (1851) “Over eenige nieuwe soorten van Pleuronectoïden van den Indischen Archipel” Natuurkundig Tijdschrift voor Nederlandsch Indië, 1(4), pp 401– 416 11 Bleeker, P (1854), “Faunae ichthyologicae japonicae species novae” Natuurkundig Tijdschrift voor Nederlandsch Indië, 6(2), pp 395–426 12 Bleeker, P (1854), “Zevende bijdrage tot de kennis der ichthyologische fauna van Borneo Zoetwatervisschen van Sambas, Pontianak en Pangaron”, Natuurkundig Tijdschrift voor Nederlandsch Indië, 5, pp 427- 462 13 Bleeker, P (1855), “Derde bijdrage tot de kennis de ichthyologische fauna van de Kokos-eilanden” Natuurkd Tijdschr Neder India 8, pp 169-180 14 Bloch M.E and Schneider J.G (1801), “Systema Ichthyologiae Iconibus cx Ilustratum Post obitum auctoris opus inchoatum absolvit, correxit, interpolavit Jo” Gottlob Schneider, Saxo Berolini, Sumtibus Auctoris Impressum et Bibliopolio Sanderiano Commissum, Berlin, pp 584 15 Bouckaert, R., Heled, J., Kühnert, D., Vaughan, T., Wu, C-H., Xie, D., Suchard, MA., Rambaut, A., & Drummond, A J (2014), “BEAST 2: A Software Platform for Bayesian Evolutionary Analysis” PLoS Computational Biology, 10(4) 16 Budimir, K., Jovanovac, S., Mijić, P., Margeta, V (2014), “Mitochondrial DNA as a tool for identification of genetic diversity among domestic animals” Acta Agraria Kaposváriensis, 18(1), pp.152-158 17 Burnham, K P and Anderson, D R (2002), Model selection and multimodel inference: a practical information-theoretic approach 2nd ed., Springer, New York 18 Campbell, M.A, Chen, W.J and López, J.A (2013) “Are flatfishes (Pleuronectiformes) monophyletic?”, Molecular Phylogenetics and Evolution Elsevier Inc., 69(3), pp 664-673 19 Campbell, M A.; López, A.J.; Satoh, T P.; Wei-Jen Chen; Miya, M (2014), “Mitochondrial genomic investigation of flatfish monophyly”, Gene, 551(2), pp 176– 182 52 20 Carpenter, K E and Niem, V H (2001), FAO species identification guide for fishery purposes The living marine resources of the western central Pacific, Volume 6, Bony fishes part (Labridae to Latimeriidae) FAO 21 Chial, H and Craig, J (2008) “mtDNA and Mitochondrial Diseases”, Nature Education, 1(1), pp 342-346 22 Dagang, C., Changan, L and Shuozeng, D (1992), “The biology of flatfish (Pleuronectinae) in the coastal waters of China”, Netherlands Journal of Sea Research, 29(1–3), pp 25-33 23 Darriba D., Taboada G.L., Doallo R and Posada D (2011), “ProtTest 3: fast selection of best-fit models of protein evolution Bioinformatics, 27, pp 1164-1165 24 Di F.A., Guerriero G., Russo G.L and Ciarcia G (2007), “Identification of gadoid species (Pisces, Gadidae) by sequencing and PCR-RFLP analysis of mitochondrial 12S and 16S rRNA gene fragments” Eur Food Res Technol (225), pp 337-344 25 Dimauro, S and Davidzon, G (2005), “Mitochondrial DNA and disease”, Annals of Medicine, 37(3), pp 222–232 26 Donoghue, P C J and Benton, M.J (2007), “Rocks and clocks: calibrating the Tree of Life using fossils and molecules”, Trends in Ecology and Evolution, 22(8), pp 424–431 27 Drummond, AJ and A Rambaut (2007), “BEAST: Bayesian evolutionary analysis by sampling trees” BMC Evolutionary Biology, 7, pp 214 28 Drummond A J., Ho S Y W., Phillips M J and Rambaut A (2006), “Relaxed phylogenetics and dating with confidence” PLoS Biology, 4(5), pp 88 29 Drummond A J and Suchard M A (2010), “Bayesian random local clocks, or one rate to rule them all” BMC Biology 2010, 114 (8) 30 Drummond, A J and Bouckaert, R.R (2015), “Bayesian evolutionary analysis with BEAST”, Bayesian Evolutionary Analysis with BEAST, pp 1–249 31 Exadactylos, A and Thorpe, J.P (2001), “Allozyme variation and genetic inter- relationships between seven flatfish species (Pleuronectiformes)”, Zoological Journal of the Linnean Society, 132(4), pp 487–499 32 Folmer, 0., Black, M., Hoeh, W., Lutz, R., and Vrijenhoek, R (1994), “DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse 53 metazoan invertebrates” Molecular Marine Biology and Biotechnology, 3(5), pp 294299 33 Galtier, N., Nabholz, B., Glémin, S., Hurst G.D (2009), “Mitochondrial DNA as a marker of molecular diversity: a reappraisal”, Molecular Ecology, 18(22), pp 4541– 4550 34 Günther, A (1862), “Catalogue of the Acanthopterygii, Pharyngognathi and Anacanthini in the collection of the British Museum” British Museum, London, pp 534 35 Habeeb, S.K.M and Sanjayan, K.P (2011), “sequencing and phylogenetic analysis of the mitochondrial cytochrome c oxidase subunit i of oxycarenus laetus (hemiptera : lygaeidae )”, Sanjayan Department of Zoology & Bioinformatics , Guru Nanak College , Velachery Ma, International Journal of Plant, Animal and Environmental Sciences, 1(3), pp 85–92 36 Hall, T A (1999), “BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT”, Nucleic Acids Symposium Series, 41, pp 95-98 37 Hamilton F (1822), “An account of the fishes found in the river Ganges and its branches” Edinburg, London, Great Britain, pp – 39 38 Heath, T.A (2016), “Divergence Time Estimation using BEAST v2” 2017 Workshop on Molecular Evolution, Wood Hole, USA 39 Hebert, P.D.N., Penton, E.H., Burns, J.M., Janzen, D.H., Hallwachs, W (2004), “Ten species in one: DNA barcoding reveals cryptic species in the neotropical skipper butterfly Astraptes fulgerator”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 101(41), pp 14812–14817 40 Ho, S (2008), “The molecular clock and estimating species divergence”, Nature Education 1(1), pp 168 41 Huang, X (1996), “An improved sequence assembly program genomic”, 33, pp 21-21 42 Hubbs, C.L (1915), “Flounders and soles from Japan collected by the United States Bureau of Fisheries Steamer "Albatross" in 1906” Proceedings of the United States National Museum, 48 (2082), pp 449–496 54 43 Jin, X.X, Zhao, S.L, Wang, R.X (2013), “Universal primers to amplify the complete mitochondrial 12S rRNA gene in marine fish species” Genet Mol Res, 12 (4), pp: 4575-4578 44 Kartavtsev, Y.P, Sharina, S.N, Goto, T, Chichvarkhin, A.Y, Balanov, A.A., Vinnikov, K.A, Ivankov, V.N, Hanzawa, N (2008), “Cytochrome oxidase gene sequence analysis in six flatfish species (Teleostei, Pleuronectidae) of Far East Russia with inferences in phylogeny and taxonomy”, Mitochondrial DNA, 19(6), pp 479-489 45 Kaup J.J (1858), “Übersicht der Soleinae, der vierten Subfamilie der Pleuronectidae” Archiv für Naturgeschichte, 24(1), pp 94–104 46 Knowlton, N and Weigt, L A (1998), “New dates and new rates for divergence across the Isthmus of Panama”, Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences, 265(1412), pp 2257–2263 47 Kumar, A B and Deepthi, G R (2009), “Diversity of flatfishes (Order: Pleuronectiformes) along the Kerala coast of India, with notes on two rare species”, Indian Journal of Fisheries, 56(3), pp 211–214 48 Lacepède, B.G.E (1802), “Histoire naturelle des poisons” Tome Plassan, Imprimeur-Libraire Paris, pp 728 49 Mandal, S.D, Chhakchhuak, L, Gurusubramanian, G, Kumar, N.S (2014), “Mitochondrial markers for identification and phylogenetic studies in insects – A Review”, DNA Barcodes, 2(1), pp 1–9 50 Manickchand, S.C.H (1994), “Distribution and abundance of flatfish on the South American continental shelf from Suriname to Colombia”, 32(3–4), pp 441–452 51 Mas-Coma, S., Valero, M A, Bargues, M D (2009), “Chapter Fasciola, Lymnaeids and Human Fascioliasis, with a Global Overview on Disease Transmission, Epidemiology, Evolutionary Genetics, Molecular Epidemiology and Control”, Advances in Parasitology, 69(09), pp 41–146 52 Nelson, J S., Grande, Terry, T C, Wilson, M V H (2016) “Fishes of the World”, (2004), pp 752 53 O’Reilly, J E., dos Reis, M, Donoghue, P.C.J (2015), “Dating Tips for Divergence-Time Estimation”, Trends in Genetics Elsevier Ltd, 31(11), pp 637–650 55 54 Okada, N Takagi, Y, Tanaka, M, Tagawa, M (2003), “Fine structure of soft and hard tissues involved in eye migration in metamorphosing Japanese flounder (Paralichthys olivaceus)”, The Anatomical Record, 273A(1), pp 663–668 55 Oksanen J., Blanchet F G., Friendly M., Kindt R., Legendre P., McGlinn D., Minchin P R., O'Hara R B., Simpson G L., Solymos P., Stevens M H H., Szoecs E and Wagner H (2018), “vegan: Community Ecology Package R package version 2”,5(2) 56 Palumbi, S.R (1996), “Nucleic Acids II: The Polymerase Chain Reaction In: Molecular Systematics” Sinauer & Associates Inc., Massachusetts, pp 205-247 57 Paradis E (2012), “Analysis of Phylogenetics and Evolution with R (Second Edition)”, Springer, New York 58 Paradis E., Claude, J and Strimmer, K (2004), “APE: analyses of phylogenetics and evolution in R language” Bioinformatics, 20, pp 289–290 59 Pardo, B.G, Machordom, A., Foresti, F, Porto-Foresti, F., Azevedo, M.F.C, Bon, R, Sánchez, L, Martínez, P (2005), “Phylogenetic analysis of flatfish (Order Pleuronectiformes) based on mitochondrial 16s rDNA sequences”, Scientia Marina, 69(4), pp 531–543 60 Popescu A., Huber K T and Paradis, E (2012), “ape 3.0: new tools for distance based phylogenetics and evolutionary analysis in R” Bioinformatics, 28, pp 15361537 61 Posada, D and Crandall, K.A (1998), “MODELTEST: testing the model of DNA substitution” Bioinformatics 14(9), pp 817-818 62 Posada, D (2008), “jModelTest: Phylogenetic Model Averaging” Molecular Biology and Evolution, 25, pp 1253-1256 63 Regan, C T (1908), “Report of the marine fishes collected by Mr J Stanley Gardiner in the Indian Ocean”, Transactions of the Linnean Society of London, 12, pp 217–255 64 Revell, L J (2012), “phytools: An R package for phylogenetic comparative biology (and other things)” Methods Ecol Evol., 3, pp 217-223 65 Richardson, J (1846) “Report on the ichthyology of the seas of China and Japan” Report of the British Association for the Advancement of Science 15th meeting, pp 187–320 56 66 Robin, N G., Richard D., Nash, M., Audrey, J., Geffen, H W., Van der, V., (2015), Flatfishes: biology and exploitation, Wiley Blackwell 67 Roje, D.M (2010), “Incorporating molecular phylogenetics with larval morphology while mitigating the effects of substitution saturation on phylogeny estimation: A new hypothesis of relationships for the flatfish family Pleuronectidae (Percomorpha: Pleuronectiformes)”, Molecular Phylogenetics and Evolution Elsevier Inc., 56(2), pp 586–600 68 Schander, C and Willassen, E (2005), “What can biological barcoding for marine biology?”, Marine Biology Research, 1(1), pp 79–83 69 Schliep K.P (2011), “phangorn: Phylogenetic analysis in R Bioinformatics”, 27(4), pp 592-593 70 Seefeld K and Linder E (2007), “Statistics Using R with Biological Examples”, Biostatistics Research Center, Tufts-NEMC, Boston, USA 71 Sharina, S N and Kartavtsev, I F (2010), “Phylogenetic and taxonomic analysis of flatfish species (Teleostei, Pleuronectiformes) inferred from the primary nucleotide sequence of cytochrome oxidase gene (Co-1)”, Genetika, 46(3), pp 401– 407 72 Shi, W., Dong, X.L, Wang, Z.M, Miao, X.G, Wang, S.Y, Kong, X.Y (2013), “Complete mitogenome sequences of four flatfishes (Pleuronectiformes) reveal a novel gene arrangement of L-strand coding genes”, BMC Evolutionary Biology, 13(1) 73 Snyder J.O (1909), “Descriptions of new genera and species of fishes from Japan and the Riu Kiu Islands” Proceedings of the United States National Museum, 36(1688), pp 597–610 74 Tautz, D Arctander, P., Minelli, A., Thomas, R.H., Vogler, A.P (2003), “A plea for DNA taxonomy”, Trends in Ecology and Evolution, 18(2), pp 70–74 75 Taylor, R W and Turnbull, D M (2005), “Mitochondrial DNA mutations in human disease”, Nat Rev Genet, 6(5), pp 389–402 76 Temminck, C J and Schlegel H (1846), “Pisces In: Fauna Japonica, sive descriptio animalium quae in itinere per Japoniam suscepto annis 1823–30 collegit, notis observationibus et adumbrationibus illustravit P F de Siebold” 10(14), pp 173–269 57 77 Voronina, E P., Prokofiev, A M., Prirodina, V P (2016), “Review of the Flatfishes of Vietnam in the Collection of Zoological Institute ”, Proceedings of the Zoological Institute RAS, 320(4), pp 381–430 78 Ward, R.D., Zemlak, T.S., Innes, B.H., Last, P.R., Hebert, P.D.N., (2005) “DNA barcoding Australia’s fish species” Philosophical Transactions of the Royal Society, 360(1462), pp.1847–1857 79 Waugh, J (2007), “DNA barcoding in animal species: Progress, potential and pitfalls”, BioEssays, 29(2), pp 188–197 80 Wills, M A., (1999), “Congruence between phylogeny and stratigraphy: randomization tests and the gap excess ratio” Systematic Biology, 48(3), pp 559-580 81 Wolstenholme, D R (1992), “Animal Mitochondria1 DNA : Structure and Evolution”, International Review of Cytology, 141, pp 173–216 Tài liệu Internet http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi http://khanhvinh.khanhhoa.gov.vn 58 PHỤ LỤC Phụ lục Tên phụ lục Số trang Phụ lục A Quy trình tách chiết DNA tổng số kit Wizard® SV Genomic DNA Phụ lục B Độ tương đồng (%) loài thuộc giống cá bơn mắt lệch (Crossorhombus) nghiên cứu Phụ lục C Độ tương đồng (%) loài thuộc giống cá bơn trán hẹp (Engyprosopon) nghiên cứu 59 Phụ Lục A Quy trình tách chiết DNA tổng số kit Wizard® SV Genomic DNA Bước 1: Lấy 25 mg mẫu mô ghẹ xanh cho vào tube 1,5 ml Bước 2: Thêm 200µl đệm dung dịch Nuclei Lysis, 50µl đệm EDTA (pH=8,0), 20 µl proteinase K(20mg/ml), 5µl dung dịch RNase A mix Bước 3: Ủ 55oC mẫu tan hoàn toàn (từ 16 -18 giờ) Bước 4: Thêm 250 µl Wizard® SV Lysis Buffer Vortex Bước 5: Dùng pipet hút tồn dịch chuyển sang tube có cột lọc Wizard® SV Bước 6: Ly tâm 13.000 vòng/phút phút Bước 7: Loại bỏ dịch thu cột lọc Bước 8: Đặt cột lọc sang tube ml (có sẵn) Bước 9: Thêm 650µl đệm Column Wash Solution (CWA với 95% cồn), ly tâm 13.000 vòng/phút phút Bước 10: Loại bỏ dịch thu cột lọc Bước 11: Đặt cột lọc sang tube ml (có sẵn) Bước 12: Thêm 650µl, đệm Column Wash Solution ly tâm phút 13.000 vòng/phút Bước 13: Loại bỏ dịch chuyển cột lọc sang tube 1,5 ml (có sẵn) Bước 14: Thêm 250 µl đệm Nuclease-Free Water, ủ phút nhiệt độ phòng, ly tâm phút 13.000 vòng/phút thu dịch bên lần Bước 15: Chuyển cột lọc sang tube 1,5 ml (có sẵn) Thêm 250 µl đệm Nuclease-Free Water, ủ phút nhiệt độ phòng, ly tâm phút 13.000 vòng/phút thu dịch bên lần Bước 16: Tổng thể tích thu khoảng 500µl bảo quản nhiệt độ -20oC phục vụ cho bước nghiên cứu sau Phụ Lục B Độ tương đồng (%) loài thuộc giống cá bơn mắt lệch (Crossorhombus) nghiên cứu 1 ID 0.993 0.833 ID 0.83 ID Chú thích: - Crossorhombus cf azureus; - Crossorhombus azureus KP267582; - Crossorhombus kobensis AP014589 Phụ Lục C Độ tương đồng (%) loài thuộc giống cá bơn trán hẹp (Engyprosopon) nghiên cứu 4 ID 83,50 85,10 ID 83,50 85,10 ID 81,70 ID Chú thích: - Engyprosopon cf grandisquama; - Engyprosopon macrolepis KP266767; - Engyprosopon maldivensis; - Engyprosopon multisquama KY315400 ... việc định danh, phân loại, thu thập bổ sung liệu di truyền tiến hóa đối tượng cá bơn cần thiết, đề tài Định loại loài cá bơn phổ biến Khánh Hòa dựa đặc điểm hình thái, di truyền ước tính thời gian. .. NGHIỆP ĐỊNH LOẠI CÁC LOÀI CÁ BƠN PHỔ BIẾN TẠI KHÁNH HỊA DỰA TRÊN ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, DI TRUYỀN VÀ ƯỚC TÍNH THỜI GIAN PHÂN HĨA LỒI GVHD: TS Đặng Thúy Bình SVTH: Phạm Thiên Phú MSSV: 56131191 Khánh Hòa, ... thập định loại lồi cá bơn phổ biến Khánh Hòa dựa đặc điểm hình thái 17 2.2.1 Đối tượng, địa điểm phương pháp thu mẫu 17 2.2.2 Định loại loài cá bơn phổ biến dựa vào đặc điểm hình