Xác định thành phần các loại ký sinh trùng trên ghẹ xanh (portunus pelagicus, linnaeus 1758) tại một số vùng biển ở việt nam dựa trên đặc điểm hình thái và di truyền

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG LÊ THỊ KIỀU OANH XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN CÁC LOÀI KÝ SINH TRÙNG TRÊN GHẸ XANH Portunus pelagicus, Linnaeus 1758 TẠI MỘT SỐ VÙNG BIỂN Ở VIỆT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

LÊ THỊ KIỀU OANH

XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN CÁC LOÀI KÝ SINH TRÙNG

TRÊN GHẸ XANH (Portunus pelagicus, Linnaeus 1758) TẠI

MỘT SỐ VÙNG BIỂN Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN ĐẶC ĐIỂM

HÌNH THÁI VÀ DI TRUYỀN

LUẬN VĂN THẠC SĨ

KHÁNH HÒA - 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

LÊ THỊ KIỀU OANH

XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN CÁC LOÀI KÝ SINH TRÙNG

TRÊN GHẸ XANH (Portunus pelagicus, Linnaeus 1758) TẠI

MỘT SỐ VÙNG BIỂN Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN ĐẶC ĐIỂM

HÌNH THÁI VÀ DI TRUYỀN

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Quyết định thành lập hội đồng: 233/QĐ-ĐHNT ngày 24/2/2017

iii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Xác định thành phần các loài ký

sinh trùng trên ghẹ xanh (Portunus pelagicus, Linnaeus 1758) tại một số vùng

biển ở Việt Nam dựa trên đặc điểm hình thái và di truyền” là công trình nghiên

cứu của cá nhân tôi và chưa từng được công bố trong bất cứ công trình khoa học nào khác cho tới thời điểm này

Khánh Hòa, ngày tháng năm 2017

Tác giả luận văn

Lê Thị Kiều Oanh

LỜI CẢM ƠN

Xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của quý phòng, ban trường Đại học Nha Trang, các thầy cô giáo trong Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài

Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Đặng Thúy Bình, người đã tận tình chỉ bảo

và hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện nghiên cứu này

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình và tất cả bạn bè, đồng nghiệp đã giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Khánh Hòa, ngày tháng năm 2017

Tác giả luận văn

Lê Thị Kiều Oanh

v

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN iii

LỜI CẢM ƠN iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii

DANH MỤC BẢNG ix

DANH MỤC HÌNH x

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN xi

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan các khu vực nghiên cứu 3

1.2 Một số đặc điểm sinh học, sinh sản của ghẹ xanh Portunus pelagicus 3

1.2.1 Vị trí phân loại 3

1.2.2 Đặc điểm phân bố 4

1.2.3 Đặc điểm hình thái 4

1.2.4 Đặc điểm dinh dưỡng và sinh sản 6

1.2.5 Tình hình khai thác và nuôi ghẹ xanh 8

1.3 Tình hình nghiên cứu ký sinh trùng trên cua, ghẹ 8

1.3.1 Tình hình nghiên cứu ký sinh trùng ở cua ghẹ trên thế giới 9

1.3.1.1 Động vật nguyên sinh 9

1.3.1.2 Động vật hình rêu (Bryozoa) 10

1.3.1.3 Giáp xác (Crustacea) 10

1.3.1.4 Giun sán (Helminthes) 12

1.3.1.5 Giun nhiều tơ (Polychaete) 13

1.3.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 13

1.4 Tổng quan chỉ thị phân tử trong nghiên cứu tiến hóa ký sinh trùng 14

1.4.1 Nghiên cứu đặc điểm của gen nhân và gen ty thể 14

1.4.2 Nghiên cứu định danh và mối quan hệ phát sinh loài ký sinh trùng trên cua, ghẹ 17

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.2 Phạm vi nghiên cứu 19

2.3 Sơ đồ khối nghiên cứu 21

2.4 Phương pháp nghiên cứu 22

2.4.1 Phương pháp thu mẫu ghẹ xanh 22

2.4.2 Phương pháp xử lý mẫu ghẹ 22

2.4.3 Thu mẫu KST trên ghẹ 22

2.4.4 Nhuộm và làm tiêu bản và bảo quản KST 23

2.4.5 Phương pháp đo KST 24

2.4.6 Xác định tỷ lệ và mật độ nhiễm KST trên ghẹ xanh 25

2.4.7 Phân loại, mô tả KST dựa vào đặc điểm hình thái 25

2.4.8 Nghiên cứu di truyền KST ký sinh trên ghẹ xanh ở Việt Nam 26

2.4.8.1 Định danh loài dựa trên chỉ thị phân tử 28S rDNA và COI mt DNA 26

2.4.8.2 Phân tích dữ liệu và xây dựng mối quan hệ phát sinh loài 28

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Thành phần và đặc điểm hình thái các loài ký sinh trùng trên ghẹ xanh Portunus pelagicus 31

3.1.1 Thành phần loài ký sinh trùng trên ghẹ xanh 31

3.1.2 Phân loại, mô tả đặc điểm hình thái và vị trí ký sinh của ký sinh trùng trên ghẹ xanh 35

A Ngành trùng lông Ciliophora 35

3.1.2.1 Loài trùng loa kèn Epistylis sp 35

3.1.2.2 Loài trùng loa kèn Zoothamnium sp 37

3.1.2.3 Loài trung loa kèn Vorticella sp .39

B Ngành Entoprocta 40

3.1.2.4 Loài Loxosomella sp .40

C Ngành Động vật hình rêu Bryozoa 42

3.1.2.5 Loài Triticella flavar Dalyell, 1848 42

D Ngành giun Nemertea 44

3.1.2.6 Loài giun Carcinonemertes sp 44

E Ngành giun dẹp Platyhelminthes 47

3.1.2.7 Loài giun dẹp Notoplana sp 47

F Ngành giun đốt Annelida 49

3.1.2.8 Loài giun nhiều tơ Hydroides sp .49

G Ngành chân khớp Arthropoda 51

vii

3.1.2.9 Loài giáp xác chân tơ Chelonibia patula Ranzani, 1818 51

3.1.2.10 Loài giáp xác Semibalanus sp 53

3.1.2.11 Loài giáp xác Octolasmis angulata Aurivillius, 1894 54

3.1.2.12 Loài giáp xác Octolasmis neptuni McDonald, 1869 56

3.1.2.13 Loài giáp xác Octolasmis warwickii Gray, 1825 58

3.1.2.14 Loài giáp xác Octolasmis tridens Aurivillius, 1894 .60

3.1.2.15 Loài giáp xác Choniosphaera indica Gnanamuthu, 1954 62

3.2 Tình trạng nhiễm ký sinh trùng trên ghẹ xanh 63

3.2.1 Mức độ đa dạng thành phần loài KST trên ghẹ xanh 63

3.2.2 Tình trạng nhiễm KST theo mùa, theo khu vực nghiên cứu và theo giới tính ghẹ xanh 64

3.2.2.1 Tình trạng nhiễm KST trên ghẹ xanh 64

3.2.2.2 Tình trạng nhiễm các loài KST trên ghẹ xanh theo mùa 67

3.2.2.3 Tình trạng nhiễm các loài KST trên ghẹ xanh theo khu vực nghiên cứu 70

3.2.2.4 Tình trạng nhiễm các loài KST theo giới tính ghẹ xanh 72

3.3 Nghiên cứu di truyền các loài ký sinh trùng trên ghẹ xanh tại một số vùng biển Việt Nam 75

3.3.1 Khuếch đại đoạn gen 28S rDNA và COI mtDNA 75

3.3.2 Xây dựng cây phát sinh loài của các loài ký sinh trùng 76

3.3.2.1 Mối quan hệ tiến hóa đối với gen 28S rDNA của các loài KST 76

3.3.2.2 Mối quan hệ tiến hóa đối với gen COI mtDNA của các loài KST 79

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 82

KẾT LUẬN 82

KIẾN NGHỊ 82

TÀI LIỆU THAM KHẢO 83 PHỤ LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

NCHT NTTS

: Nghiên cứu hiện tại

: Nuôi trồng thủy sản

ix

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Số liệu về mẫu ghẹ nghiên cứu 22

Bảng 2.2: Thông tin về các loài KST trên ghẹ xanh và các loài từ Genbank sử dụng trong phân tích di truyền gen 28S rDNA và COI mtDNA 29

Bảng 3.1: Thành phần loài ký sinh trùng trên ghẹ xanh ở Việt Nam 33

Bảng 3.2: So sánh một số đặc điểm hình thái của các loài Loxosomella 42

Bảng 3.3: So sánh một số đặc điểm hình thái các loài Carcinonemertes spp 47

Bảng 3.4: Tỷ lệ và mật độ nhiễm trung bình của các loài KST trên ghẹ xanh 65

Bảng 3.4: Tỷ lệ và mật độ nhiễm trung bình của các loài KST trên ghẹ xanh 66

Bảng 3.5: Tỷ lệ và mật độ nhiễm KST theo mùa khô và mùa mưa 69

Bảng 3.6: Tỷ lệ và mật độ nhiễm KST theo khu vực nghiên cứu 71

Bảng 3.7: Tỷ lệ nhiễm và mật độ nhiễm KST theo giới tính ghẹ 73

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 : Ghẹ xanh Portunus pelagicus Linnaeus, 1758 4

Hình 1.2: Cấu tạo các bộ phận cơ thể của ghẹ xanh Portunus pelagicus 5

Hình 1.3: Vùng rDNA 15

Hình 1.4: DNA ty thể của loài Campylorhynchus zonatus 16

Hình 2.1: Bản đồ các khu vực thu mẫu tại Việt Nam 20

Hình 2.2: Sơ đồ khối nghiên cứu 21

Hình 3.1: Đặc điểm hình thái và vị trí ký sinh của trùng loa kèn Epistylis sp .36

Hình 3.2: Đặc điểm hình thái và vị trí ký sinh của trùng loa kèn Zoothamnium sp 38

Hình 3.3: Đặc điểm hình thái và vị trí ký sinh của trùng loa kèn Vorticella sp .40

Hình 3.4: Đặc điểm hình thái và vị trí ký sinh của loài Loxosomella sp 41

Hình 3.5: Đặc điểm hình thái và vị trí ký sinh của loài Triticella flavar 43

Hình 3.6: Đặc điểm hình thái và vị trí ký sinh của loài giun Carcinonemertes sp .45

Hình 3.7: Đặc điểm hình thái và vị trí ký sinh của loài giun dẹp Notoplana sp 48

Hình 3.8: Đặc điểm hình thái và vị trí ký sinh của loài giun nhiều tơ Hydroides sp 50

Hình 3.9: Đặc điểm hình thái và vị trí ký sinh của loài giáp xác Chelonibia patula 52

Hình 3.10: Đặc điểm hình thái và vị trí ký sinh của loài giáp xác Semibalanus sp .53

Hình 3.11: Đặc điểm hình thái và vị trí ký sinh của giáp xác Octolasmis angulata 53

Hình 3.12: Đặc điểm hình thái và vị trí ký sinh của loài Octolasmis neptuni 57

Hình 3.13: Đặc điểm hình thái và vị trí ký sinh của giáp xác Octolasmis warwickii 59

Hình 3.14: Đặc điểm hình thái và vị trí ký sinh của giáp xác Octolasmis tridens 61

Hình 3.15: Đặc điểm hình thái và vị trí ký sinh của giáp xác Choniosphaera indica 63

Hình 3.16: Tỷ lệ của các nhóm ghẹ xanh nhiễm từ 0 đến 7 loài ký sinh trùng 64

Hình 3.17: Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 28S rDNA và COI mt DNA của các loài KST trên ghẹ xanh .75

Hình 3.18: Cây phát sinh loài dựa vào trình tự gen 28S rDNA của các loài KST trên ghẹ xanh 76

Hình 3.19: Cây phát sinh loài dựa vào trình tự gen COImt DNA của các loài ký sinh trùng trên ghẹ xanh 80

xi

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Ghẹ xanh Portunus pelagicus (Linnaeus, 1758) có phân bố rộng, có giá trị dinh

dưỡng và có tính thương mại cao và được coi là đặc sản vì có thịt thơm, ngọt được nhiều người ưa thích Ngoài ra, nhờ có tốc độ tăng trưởng nhanh, khả năng chống chịu nitrate và amoniac tốt, chúng trở thành một trong những loài lý tưởng trong nuôi trồng thủy sản Tuy nhiên, các bệnh ký sinh trùng làm ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển, chất lượng và sản lượng của ghẹ xanh Vì vậy, việc nghiên cứu ký sinh trùng trên đối tượng này là điều cần thiết Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm xác định thành phần loài, tỷ lệ nhiễm, mật độ nhiễm, mối quan hệ phát sinh loài của các ký sinh trùng trên

ghẹ xanh Portunus pelagicus tại một số vùng biển ở Việt Nam

Tổng cộng 365 cá thể ghẹ xanh đã được thu từ 03 khu vực nghiên cứu: vùng biển Hải Phòng (bao gồm đảo Cát Bà), vùng biển Khánh Hòa – Phú Yên và vùng biển Kiên Giang (bao gồm đảo Phú Quốc) Thời gian tiến hành nghiên cứu: từ tháng 10/2015 đến tháng 8/2016 Ngoại ký sinh được thu trên mai, chân, càng, yếm, mắt phần phụ miệng; nội

ký sinh thu từ ruột, máu, tim, tuyến sinh dục, dạ dày của ghẹ Ký sinh trùng được cố định, nhuộm, đo các thông số để xác định đặc điểm hình thái và định danh theo các tài liệu phân loại Tình trạng nhiễm ký sinh trùng được đánh giá thông qua tỷ lệ nhiễm (%) và mật

độ nhiễm trung bình (tổng số ký sinh trùng/số ghẹ nhiễm) và được so sánh bằng các phép thống kê Chi bình phương (so sánh tỷ lệ nhiễm), Mann – Whitney và Kruskal – Wallis (so sánh mật độ nhiễm trung bình) Các loài ký sinh trùng được nghiên cứu di truyền dựa vào trình tự gen 28S rDNA và COI mtDNA để xác định mối quan hệ tiến hóa của các loài DNA được tách bằng bộ kit Qiagen; phản ứng PCR đối với gen 28S rDNA sử dụng cặp mồi và chu trình nhiệt theo Olson và cộng sự (2003), gen COI mtDNA sử dụng cặp mồi và chu trình nhiệt theo Folmer và cộng sự (1994); cây phát sinh loài được xây dựng từ trình tự gen của các loài nghiên cứu và một số trình tự từ Genbank dựa trên thuật toán Neighbor – Joining bằng phần mềm MEGA 6 với giá trị bootstrap (độ lặp lại) 1.000 lần

Kết quả phát hiện được 15 loài ký sinh trùng thuộc 12 giống, 12 họ, 9 bộ, 7 lớp, 7 ngành (Ciliophora, Entoprocta, Bryozoa, Nemertea, Annelida, Platyhelminthes và Arthropoda) Ở Hải Phòng phát hiện 12 loài, Khánh Hòa – Phú Yên 13 và Kiên Giang

11 loài Trên ghẹ cái ghi nhận 15 loài trong khi ghẹ đực có 12 loài ký sinh trùng Mùa

khô độ đa dạng thành phần loài (11 loài) thấp hơn mùa mưa (15 loài) Thành phần loài

dao động từ 0 đến 7 loài KST trên một cá thể ghẹ, trong đó nhóm nhiễm 1 loài ký sinh

trùng chiếm tỷ lệ cao nhất 23,29 % Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỷ lệ và mật

độ nhiễm giữa mùa mưa và mùa khô, giữa các khu vực nghiên cứu và giữa hai giới

tính ghẹ tập trung vào giun Carcinonemertes sp và nhóm Octolasmis Nghiên cứu di

truyền dựa vào trình tự gen 28S rRNA và COI mtDNA cho thấy các loài ký sinh trùng

đều nằm trên cùng 1 nhánh đồng dạng (monophyly) và thể hiện sự phù hợp với các đặc

điểm hình thái

Nghiên cứu đã phát hiện 15 loài ký sinh trùng thuộc 12 giống, 12 họ, 9 bộ, 7 lớp,

7 ngành ký sinh trên ghẹ xanh Thành phần loài và tình trạng nhiễm một số loài ký

sinh trùng có sự khác biệt theo mùa, theo khu vực nghiên cứu và theo giới tính ghẹ

Mỗi cá thể ghẹ nhiễm từ 0 đến 7 loài ký sinh trùng Carcinonemertes sp và

Octolasmis angulata là hai loài chiếm ưu thế trên ghẹ xanh với tỷ lệ và mật độ nhiễm

trung bình cao Các đặc điểm di truyền dựa vào trình tự gen 28S rRNA và COI

mtDNA thể hiện sự phù hợp với các đặc điểm hình thái Cần tiếp tục thu mẫu ghẹ ở

Hải Phòng và Kiên Giang nhằm cân bằng về số lượng mẫu giữa các khu vực nghiên

cứu và sử dụng các cặp mồi thích hợp để phân tích đặc điểm di truyền của các loài

thuộc ngành Ciliophora và Bryozoa

Từ khóa: Ghẹ xanh, ký sinh trùng, tỷ lệ nhiễm, mật độ nhiễm, 28S rDNA,

COI mtDNA

1

MỞ ĐẦU

Ghẹ xanh Portunus pelagicus (Linnaeus, 1758) phân bố chủ yếu ở vùng biển Ấn

Độ - Tây Thái Bình Dương từ các quốc gia Đông Á, Đông Nam Á, đông Australia, đảo Fidji, đến phía tây Biển Đỏ, đông Phi (FAO, 2014) Chúng là loài hải sản có giá trị dinh dưỡng và có tính thương mại cao (Alsaquabi và cs, 2010), đặc biệt ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới (Zainal, 2013) và được coi là đặc sản vì có thịt thơm, ngọt được nhiều người ưa thích (Maheswarudu và cs, 2008) Theo thống kê của FAO (2014) tổng sản lượng ghẹ xanh được đánh bắt trên thế giới tăng dần từ khoảng 5.000 tấn năm 1963 và đạt khoảng 184.000 tấn năm 2013 Ngoài ra, nhờ có tốc độ tăng trưởng nhanh, khả năng chống chịu nitrate và amoniac tốt, ghẹ xanh trở thành một trong những loài lý tưởng trong nuôi trồng thủy sản (Romano và Zeng, 2007) Ở Việt Nam, ghẹ xanh phân bố khắp các vùng biển và hải đảo từ Bắc đến Nam, quy trình sản xuất giống nhân tạo và nuôi thương phẩm ghẹ xanh đã được nghiên cứu thành công từ năm 2000 (Nguyễn Thị Bích Thủy, 2000)

Theo mô hình trên mỗi sinh vật sống tự do có ít nhất một loài sinh vật ký sinh, thì

ký sinh trùng (KST) chiếm một nửa của đa dạng sinh học trên thế giới và đóng vai trò quan trọng trong các hệ sinh thái (Windsor, 1998) Các loài ký sinh trùng gây bệnh làm ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển thậm chí gây chết ở vật chủ Tuy nhiên, thông tin về đa dạng sinh học các loài KST thường ít được quan tâm (Poulin, 2004) Vì vậy, nghiên cứu về thành phần các loài ký sinh trùng là điều rất cần thiết

Từ cuối những năm 1960 đến nay, nhiều loài ký sinh trên cua, ghẹ là động vật nguyên sinh, giun sán và giáp xác đã được biết đến qua các công bố của các nhà khoa học như Weng (1987), Shields (1992), Gaddes (2004), Alsaqabi và cộng sự (2010) Tại Việt Nam, đã có một vài nghiên cứu về KST trên ghẹ xanh được thực hiện ở vùng biển Khánh Hòa như: nghiên cứu của Lê Văn Yên và cộng sự (2006), nghiên cứu của Phạm Nguyễn Hậu (2012) và Võ Thế Dũng và cộng sự (2013)

Nhìn chung, các nghiên cứu nêu trên đều dựa vào đặc điểm hình thái để phân loại

ký sinh trùng trên cua, ghẹ Các nghiên cứu ở Việt Nam chỉ được thực hiện ở Khánh Hòa, chưa có số liệu so sánh về thành phần loài và tình trạng nhiễm KST trên ghẹ xanh ở các vùng biển khác nhau, đặc biệt chưa có nghiên cứu nào ứng dụng những tiến

bộ của lĩnh vực sinh học phân tử, kết hợp định loại bằng đặc điểm hình thái và di

truyền và phân tích mối quan hệ phát sinh loài Chính vì vậy, Viện Công nghệ Sinh

học và Môi trường, trường Đại học Nha Trang đã cho phép thực hiện đề tài “Xác định

thành phần các loài ký sinh trùng trên ghẹ xanh (Portunus pelagicus, Linnaeus

1758) tại một số vùng biển ở Việt Nam dựa trên đặc điểm hình thái và di truyền”

trong khuôn khổ chương trình đào tạo thạc sĩ

Mục tiêu nghiên cứu

Xác định thành phần loài, tỷ lệ nhiễm, mật độ nhiễm, mối quan hệ phát sinh loài

của các ký sinh trùng trên ghẹ xanh Portunus pelagicus tại một số vùng biển ở Việt

Nam

Nội dung nghiên cứu

Phân loại và xác định thành phần loài KST trên ghẹ xanh Portunus pelagicus tại

một số vùng biển ở Việt Nam

Xác định tỷ lệ và mật độ nhiễm các loài KST trên các quần thể ghẹ xanh khác nhau

Nghiên cứu đặc điểm di truyền dựa trên chỉ thị phân tử của gen 28S ribosome

DNA (28S rDNA) và gen CO1 mitochondrial DNA (CO1 mtDNA), khảo sát mối quan

hệ phát sinh loài của các loài ký sinh trùng trên ghẹ xanh

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Kết quả của đề tài bổ sung thêm dẫn liệu về thành phần loài ký sinh trùng trên ghẹ xanh ở Việt Nam cũng như trên thế giới Từ đó làm cơ sở cho các nghiên cứu sâu hơn về bệnh lý trên vật chủ và các giải pháp phòng, trị thích hợp

3

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan các khu vực nghiên cứu

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa và được phân bố thành 3 vùng khí hậu riêng biệt với miền Bắc là khí hậu cận nhiệt đới ẩm, miền Trung và Bắc Trung bộ là khí hậu nhiệt đới gió mùa, miền Nam và Nam Trung bộ mang đặc điểm nhiệt đới Xavan Đồng thời, do nằm ở rìa phía Đông Nam của phần lục địa châu Á, giáp với biển Đông (một phần của Thái Bình Dương), nên chịu ảnh hưởng trực tiếp của kiểu khí hậu gió mùa mậu dịch, thường thổi ở các vùng vĩ độ thấp

đông phần đất liền từ Móng Cái (tỉnh Quảng Ninh) đến Hà Tiên (tỉnh Kiên Giang) với chiều dài trên 3.260 km Trong vùng biển có khoảng 3.000 đảo lớn nhỏ nằm rải rác dọc ven bờ và hình thành các quần đảo lớn như Hạ Long – Cát Bà ở phía tây vịnh Bắc

Bộ, quần đảo Trường Sa và Hoàng Sa ở ngoài khơi biển Đông Địa hình có nhiều vịnh,

eo biển tạo điều kiện cho các loài thủy hải sản sinh trưởng và phát triển Vì vậy Việt Nam là một trong những quốc gia có đa dạng sinh học biển phong phú Các nhà khoa học đã phát hiện trên 11.000 sinh vật sống trong vùng biển và ven bờ Việt Nam Trong

đó, có khoảng 6.000 loài động vật đáy, 2.458 loài cá, 653 loài rong biển, 657 loài động vật nổi, 537 loài thực vật nổi, 14 loài cỏ biển, phân ngành giáp xác có 1.647 loài gồm

225 loài tôm biển, khoảng 500 - 600 loài cua, ghẹ và một số loài giáp xác khác (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 2011)

1.2 Một số đặc điểm sinh học, sinh sản của ghẹ xanh Portunus pelagicus

Hình 1.1 Ghẹ xanh Portunus pelagicus Linnaeus, 1758

A - Ghẹ đực B - Ghẹ cái

1.2.2 Đặc điểm phân bố

Ghẹ xanh Portunus pelagicus (Linnaeus, 1758) có tên tiếng anh là blue

swimming crab (FAO, 2014) Chúng được tìm thấy chủ yếu ở vùng biển Ấn Độ - Tây Thái Bình Dương từ các quốc gia Đông Á, Đông Nam Á, đông Australia, đến phía tây Biển Đỏ, đông Phi (FAO, 2014) Ngoài ra, ghẹ xanh còn xuất hiện ở biển Địa Trung Hải, Ai Cập, Israel, Lebanon, Thổ Nhĩ Kỳ, Ả-rập Xê-út, Cộng Hòa Síp và đông nam vùng Sicily (Department of Fisheries of Australia, 2011) Ở Việt Nam, ghẹ xanh phân

bố khắp các vùng biển và hải đảo từ Bắc đến Nam (Nguyễn Thị Bích Thủy, 2000) Ghẹ xanh sống trên nền đáy cát hoặc bùn cát ở những vùng nước nông từ 10 đến 50

m, bao gồm cả các khu vực gần rạn san hô, rừng ngập mặn, thảm cỏ biển (FAO, 2014)

1.2.3 Đặc điểm hình thái

Mai của ghẹ xanh có chiều rộng gấp khoảng 2 lần chiều dài và có thể lên đến 20

cm Bề mặt mai thô ráp với nhiều hạt và gai nhỏ dày đặc Có bốn răng hình tam giác, cặp răng bên ngoài lớn che phủ cặp răng bên trong Mỗi mép bên phía trước của mai

có 9 gai, trong đó gai cuối cùng lớn và hướng thẳng sang 2 bên Đôi càng dài, có thể lên đến 80 cm, to nhỏ không bằng nhau, bề mặt có hoa văn; mép trong của đốt ống (merus) có 3 gai, mỗi góc (trong và ngoài) của đốt đùi (carpus) đều có 1 gai; đốt bàn (propodus) có 2 ngón với các gai hình nón ở mặt trong mỗi ngón Đôi chân bơi dẹt với hai đốt cuối có hình như mái chèo giúp ghẹ bơi dễ dàng (Department of Fisheries of Australia, 2011)

5

Ghẹ đực có màu xanh sáng với những đốm hoa văn màu xanh lam nhạt và màu

trắng với đôi càng dài đặc trưng, con cái màu nâu lục, xỉn màu hơn và mai tròn hơn

con đực (FAO, 2014) Phần yếm của ghẹ đực giống hình chữ V ngược, hẹp và thấy rõ

các góc Trong khi đó, yếm ghẹ cái rộng và tròn hơn (Department of Fisheries of

Australia, 2011)

Hình 1.2 Cấu tạo các bộ phận cơ thể của ghẹ xanh Portunus pelagicus

(Nguồn: Lai, 2010)

A – Cấu tạo bên ngoài; B – Cấu tạo bên trong lớp mai

1 – Mai; 2 – Càng; 3 – Chân bò; 4 – Chân bơi; 5 – Gai lớn; 6 - Gai nhỏ; 7 – Mắt;

8 – An ten; 9 – Khoang mang; 10 – Các chân hàm; 11 – Dạ dày; 12 –Tuyến sinh dục;

13 – Phần cứng dưới lớp mang; 14 – Mang; 15 – Tim; 16 – Ruột

1.2.4 Đặc điểm dinh dưỡng và sinh sản

Thức ăn của ghẹ xanh khá đa dạng, chủ yếu là động vật bao gồm hai mảnh vỏ, chân bụng, giáp xác, cá và ít hơn là các loài rong tảo lớn (FAO, 2014) Theo Josileen (2011), đối với ghẹ trưởng thành, giáp xác là loại thức ăn phổ biến được tìm thấy trong

dạ dày của 78,43 % số ghẹ nghiên cứu Trong khi đó, thức ăn chính của con non và con chưa trưởng thành là các mảnh vụn hữu cơ

Ghẹ bơi lội rất tốt, chúng có thể bơi xa 20 km trong một ngày, chủ yếu là do các cặp chân bơi dẹp như các mái chèo (Gaddes và Sumpton, 2004) Chúng sinh trưởng và phát triển quanh năm ở những vùng nước ấm (Kumar và cs, 2003) Khi không hoạt động hoặc vào mùa đông ở những vùng ôn đới, ghẹ vùi mình dưới cát hay bùn chỉ có phần mắt, an ten và miệng nhô lên Ngược với loài cua xanh trong cùng họ Portunidae, ghẹ xanh không thể sống một thời gian dài mà không có nước (Gaddes và Sumpton, 2004)

Ấu trùng ghẹ xanh trải qua 5 giai đoạn biển thái trong khoảng thời gian 15 – 18 ngày, gồm 4 giai đoạn zoeal và 1 giai đoạn megalopa (Josileen, 2004) Ấu trùng ghẹ xanh sống dạng phù du, chúng có thể trôi dạt đến 80 km ra biển trước khi trở về sống ở khu vực ven bờ Trong tự nhiên, giai đoạn này có tỷ lệ tử vong rất cao do ấu trùng ghẹ

là con mồi của nhiều loài sinh vật khác Ấu trùng ghẹ di chuyển từ xa bờ đến gần bờ

để trở thành những sinh vật phù du bán trôi nổi và sống đáy (Department of Fisheries

và Zeng (2006), độ mặn có ảnh hưởng đến tỷ lệ sống, sinh trưởng của những con non

Độ mặn thích hợp cho sự phát triển của con non là từ 20 - 35 ppt Khi độ mặn nằm ngoài ngưỡng này ghẹ non sẽ sinh trưởng chậm và mắc hội chứng chết do không thể lột xác Nguyên nhân có thể do khả năng điều hòa áp suất thẩm thấu của ghẹ non còn yếu; điều đó giải thích vì sao chúng di cư hàng loạt từ cửa sông ra biển vào mùa mưa

7

Khi ghẹ trưởng thành và thành thục sinh dục sẽ có những dấu hiệu để nhận biết Những dấu hiệu này ở ghẹ cái rõ ràng hơn ghẹ đực Ghẹ cái thay đổi hình dạng yếm, phần phụ bụng và xương ức trong khi ghẹ đực xuất hiện các ống dẫn tinh và màu sắc xanh đậm hơn của đôi càng (Al-Rumaidh, 2002)

Kích thước thành thục sinh dục (tính theo chiều rộng mai) của ghẹ xanh phụ thuộc vào giới tính và vùng phân bố của ghẹ Nghiên cứu ở Philippines, kích thước thành thục sinh dục tối thiểu ở ghẹ cái là 40 mm và ghẹ đực là 37 mm, trong khi đó ở Australia kích thước này lần lượt là 79 mm và 81 mm (Shields, 1993) Theo Xiao và Kumar (2004), nghiên cứu về sự trưởng thành sinh dục của ghẹ cái ở Australia cho thấy, chiều rộng mai để 50% ghẹ xanh trưởng thành sinh dục là 58,5 mm, và khi chiều rộng mai đạt kích thước 66,3 mm, 95 % ghẹ cái trưởng thành sinh dục Ở Việt Nam, kích cỡ tham gia sinh sản lần đầu của ghẹ cái là 74,5 mm, sức sinh sản của ghẹ tỷ lệ thuận với kích thước cơ thể (Nguyễn Thị Bích Thủy, 2000)

Thời gian cho một chu kỳ sinh sản của ghẹ xanh thay đổi theo nhiệt độ hàng năm Ở các vùng biển nhiệt đới và cận nhiệt đới, ghẹ đẻ trứng quanh năm Ở các vùng

ôn đới, chúng đẻ trứng 1 lần vào các tháng ấm hơn vì chúng chỉ lột xác 1 lần trong năm (Romano và Zeng, 2006) Ghẹ bắt cặp và giao phối vào cuối mùa hè Giao phối xảy ra ngay khi ghẹ cái lột xác và khi vỏ còn mềm Ghẹ đực có thể giao phối với nhiều ghẹ cái trong một mùa sinh sản (Department of Fisheries of Australia, 2011) Sau khi giao phối thành công, những con cái có thể đẻ và ấp trứng nở ra ấu trùng trong 6 lần liên tiếp mà không cần giao phối thêm (Romano và Zeng, 2008) Số trứng trong mỗi lần đẻ của ghẹ cái khoảng từ 180.000 đến 2 triệu trứng (Department of Fisheries of Australia, 2011)

Khi ghẹ cái đã sẵn sàng đẻ trứng, chúng di cư từ vùng cửa sông đến vùng biển xa

bờ để đẻ trứng Sự di cư này cần thiết cho các ấu trùng sống sót sau khi nở vì lượng oxy hòa tan và thức ăn thích hợp cho ấu trùng thường thấp ở vùng cửa sông (Shahib, 2012) Trứng được phóng ra dưới nền cát, sau đó ghẹ cái gom vào phần bụng dưới yếm, và trứng được ấp ở đó Ban đầu, trứng có màu cam và dần chuyển sang màu xám

và sau đó nở thành các ấu trùng Tốc độ phát triển phụ thuộc vào nhiệt độ nước; ở

phát triển thành ấu trùng (Romano và Zeng, 2008)

1.2.5 Tình hình khai thác và nuôi ghẹ xanh

Ghẹ xanh trở thành sản phẩm thương mại có giá trị và bắt đầu khai thác vào khoảng đầu những năm 1960 với sản lượng khoảng 20.000 tấn mỗi năm trên toàn thế giới Sản lượng này tăng dần theo thời gian và đạt mức 184.000 tấn năm 2013 (FAO, 2014)

Tuy nhiên, cùng với sự suy giảm chất lượng môi trường sống, sự khai thác quá mức và một số loại bệnh đã làm sản lượng ghẹ xanh ở một số nơi giảm đáng kể Tại vịnh Kung Krabaen - Thái Lan, sản lượng năm 2002 từ 120 tấn giảm 58,33 % còn 50 tấn vào năm 2012 (Kunsook và cs, 2014)

Ngành công nghiệp nuôi ghẹ xanh bắt đầu ở châu Á vào khoảng thời gian giữa những năm 1990, khi bệnh đốm trắng gây ảnh hưởng lớn cho nuôi tôm nước mặn (Romano và Zeng, 2008) Ghẹ xanh có thể được nuôi trong các ao nuôi hoặc trong các

hệ thống tuần hoàn Với tốc độ tăng trưởng nhanh, khả năng chống chịu cả nitrat lẫn ammoniac tốt, ghẹ xanh trở thành một trong những đối tượng lý tưởng cho nuôi trồng thủy sản (Mireia và cs, 2010) Nghề nuôi ghẹ xanh không chỉ cung cấp cho thị trường ghẹ thương phẩm nguyên con, mà còn có ghẹ lột, một dạng sản phẩm có giá trị cao gấp nhiều lần ghẹ bình thường (Romano và Zeng, 2008) Tuy nhiên, những khó khăn trong việc tìm kiếm loại thức ăn phù hợp và việc đảm bảo được môi trường nuôi tối ưu (về độ mặn, nhiệt độ, ánh sáng…) nhằm nâng cao tỷ lệ sống, tốc độ tăng trưởng và giảm giá thành sản xuất vẫn đang là những thách thức không nhỏ đối với việc nuôi ghẹ xanh, do đó sản lượng nuôi chưa cao (Mireia và cs, 2010) Sản lượng ghẹ xanh nuôi trên toàn thế giới chỉ đạt trên 30 tấn năm 2008 và trên 25 tấn năm 2013 (FAO, 2014)

Ở Việt Nam, quy trình sản xuất giống nhân tạo và nuôi thương phẩm ghẹ xanh đã được Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III nghiên cứu thành công (Nguyễn Thị Bích Thủy, 2000) Nuôi ghẹ lột ở một số nơi (Quảng Ninh, Hải Phòng, Nam Định và khu vực đồng bằng Sông Cửu Long) đã tạo ra một sản lượng đáng kể cho thị trường (Võ Thế Dũng, 2013)

1.3 Tình hình nghiên cứu ký sinh trùng trên cua, ghẹ

Từ cuối những năm 1960 đầu 1970, khi cua, ghẹ trở thành loài thủy sản được khai thác nhiều trên thế giới thì các loài ký sinh và bệnh trên các đối tượng này mới được quan tâm nghiên cứu (Josileen, 2014) Cho đến nay, nhiều loài cộng sinh, ký sinh trên cua, ghẹ là động vật nguyên sinh, giun sán và giáp xác đã được biết đến qua các

Trùng lông (Ciliophora): Vorticella, Epistylis, Zoothamnium, Acineta là những

giống ký sinh trùng thường gặp trên cua biển Một số loài gây ảnh hưởng đến sự trao đổi khí của trứng và ấu trùng khi chúng ký sinh ở mật độ cao Ngoài ra, chúng còn cản trở quá trình vận động, lột xác và lọc thức ăn của cua, ghẹ (Pitogo và Pena, 2004)

Loài trùng lông Paranophrys sp ký sinh trên cua Canner magister gây thoái hóa và hoại tử cơ làm cho cua chết (Amstrong và cs, 1981) Loài Mesanophrys sp có ký chủ

là Carcinus maenas, Cancer pagurus, Cancer magister, khi bị nhiễm nặng làm cho

cua yếu ớt, cơ thể bị lật ngược và mô cơ tim bị hoại tử (Bower và cs, 1994)

Trùng amip (Amoebozoa): Trùng amip Paramoeba là tác nhân gây bệnh cua xám

"gray crab" trên một số loài cua như Callinectes sapidus, Cancer irotatus, Carcinus maenas Biểu hiện của bệnh là bụng cua có màu xám, cua hoạt động chậm chạp, giảm

hoặc không đông máu, và tỷ lệ tử vong cao đối với cua mới lột (Bower và cs, 1994)

Trùng roi (Mastigophora): Hematodinium ký sinh trong máu tôm, cua và thường gây chết ở vật chủ (Lützen và Pham, 1999) Mặt khác, Hematodinium còn được xem là

tác nhân gây bệnh cua đắng "bitter crab", làm giảm chất lượng thịt và giá trị thương

mại của cua, ghẹ (Love và cs, 1993) Loài Hematodinium sp ký sinh trên cua xanh Callinectes sapidus, cua Cancer irroratus, C borealis và Ovalipes ocellatus ở Mỹ,

gây tỷ lệ tử vong khá cao, không phân biệt kích thước, giai đoạn lột xác hay giới tính (MacLean và Ruddell, 1978; Shields và Squyars, 2000) Ở Alaska và đông Canada

Hematodinium sp được tìm thấy trên cua Chionoecetes bairdi và C Opilio (Meyers và

cs, 1996)

Trùng bào tử (Sporozoa): Ameson michaelis là loài trùng bào tử gây bệnh cua

bông "cotton crab disease" ở vịnh Chesapeake và Louisiana (Shields và Overstreet,

2003) Trùng Haplosporidium sp ký sinh trên cua Carcinus maenas ở châu Âu Đây là

loài ký sinh trong các mô máu và mô liên kết của vật chủ (Stentiford và cs, 2004)

Nghiên cứu trên ghẹ xanh Portunus pelagicus ở vịnh Moreton phía đông

Australia đã phát hiện 15 loài cộng sinh và ký sinh trên mô, các lá mang, máu, ruột và

bề mặt ngoài của ghẹ xanh Trong số đó, có 6 loài động vật nguyên sinh ký sinh bao

gồm: 2 loài trùng lông Operculariella sp và Acineta sp trên mang, 2 loài trùng bào tử Thelohania sp và Ameson sp trong ruột, trùng bào tử Nematopsis sp trong cơ, máu và trùng roi Hematodinium sp ký sinh trong máu ghẹ (Shields, 1992)

1.3.1.2 Động vật hình rêu (Bryozoa)

Nghiên cứu của Abelló và Corbera (1996) ở đồng bằng sông Ebro phía tây Địa

Trung Hải đã ghi nhận 2 loài bryozoa Triticella flava và Alcyonidium mamillatum trên phần vỏ cứng của loài cua Goneplax rhomboides với tỷ lệ nhiễm lần lượt là 36,3% và 0,7 % Loài T flava sống bám trên các chân hàm hoặc mép sau của mai trong khi

A mamillatum bám trên phần nhẵn của mai và càng cua Khi cua bị giáp xác

sacculinid ký sinh, tỷ lệ nhiễm cả hai loài trên tăng cao, nguyên nhân là do sacculinid làm ức chế quá trình lột xác ở vật chủ Một số loài Bryozoa khác cũng đã được ghi

nhận trên cua ghẹ: Nolella annectens trên mai cua Bathynectes piperitus ở Namibia (Gili và cs, 1993); Membranipora membranacea trên cua Cancer productus và Cancer magister ở Colombia (McGow, 2006), trên ghẹ ba chấm Portunus sanguinolentus ở

Trung Quốc (Yang và cs, 2014), một loài Bryozoa chưa được định danh nhiễm trên

cua Arenaeus cribrarius tại Brasil (Costa và cs, 2010)

ký sinh trên hai quần thể ghẹ xanh khác nhau ở Queensland đã được thực hiện S grannifera làm thay đổi bụng của vật chủ theo 3 dạng hình thái khác nhau Kết quả

cho thấy, loài này được tìm thấy quanh năm với tỷ lệ cao nhất vào mùa khô (từ tháng 5 đến tháng 10) ở vịnh Carpentaria và những tháng ấm (tháng 10 đến tháng 3) ở vịnh Moreton Tỷ lệ nhiễm ở con đực nhiều hơn con cái ở vùng Carpentaria, còn ở Moreton

tỷ lệ nhiễm ở cả ghẹ đực và cái tương đương nhau Mật độ nhiễm là 6,6 % ở Moreton

và 1,2 % ở vịnh Carpentaria (Weng, 1987)

Giáp xác chân tơ thuộc bộ Lepadiformes: Chủ yếu là các loài trong giống

Octolasmis Giống này có phân bố rộng khắp trong các vùng biển ôn đới và nhiệt đới

(Jones và cs, 2000) Chúng lấy thức ăn bằng cách lọc các hạt vật chất trong dòng hô hấp của vật chủ, tuy nhiên việc sống bám trên mang cua ghẹ, làm giảm không gian quanh mang, gây khó khăn cho việc trao đổi khí của vật chủ (Meyers và cs, 1996)

Một số loài Octolasmis đã được tìm thấy trên ghẹ Portunus pelagicus, cua P sangguinolentis, Podopthalmus vigil, Scylla serreta và S tranqueberiea ở Ấn Độ và Thái Lan (Kumaravel và cs, 2009)

Nghiên cứu sự phân bố của Octolasmis muelleri trên mang loài cua xanh Callinectes sapidus cho thấy tỷ lệ nhiễm dao động từ 17 % – 67 %, mật độ nhiễm trung bình là 21,8 trùng/con, mật độ cao nhất là 432 trùng/con Octolasmis ký sinh chủ

yếu trên các phiến mạng ở vị trí 3, 4, 5 và 6 của cua (Gannon, 1990)

Gaddes và Sumpton (2004) thực hiện nghiên cứu trên 952 cá thể ghẹ xanh

Portunus pelagicus ở 3 điểm khác nhau quanh vịnh Moreton – Australia Kết quả đã

ghi nhận sự xuất hiện của giáp xác ngoại ký sinh trên mai và mang của ghẹ; tỷ lệ

nhiễm Octolasmis spp là 92% Trong đó, mật độ nhiễm trên mai (chủ yếu là loài Octolasmis warwickii) và trên mang (chủ yếu là O angulata) với số lượng tương ứng

là 2,35 và 71,1 trùng/con Hơn nữa, giáp xác ký sinh trên ghẹ có sự thay đổi theo vùng, theo mùa và theo giới tính Ghẹ sống ở vùng nước sâu hơn có mật độ nhiễm cao hơn

Giáp xác tập trung nhiều nhất ở gần bề mặt của các phiến mang số 3, 4 và 5 Vật chủ

trong giai đoạn thay vỏ, hoặc bị nhiễm giáp xác Sacculina granifera cũng có thể ảnh hưởng đến mật độ nhiễm Octolasmis

Giáp xác chân tơ thuộc bộ Sessilia: Loài Chelonibia patula bám trên phần vỏ cứng của loài ghẹ ba chấm Portunus sanguinolentus (Yang và cs, 2014), cua Arenaeus cribrarius (Costa và cs, 2010), ghẹ xanh Portunus pelagicus (Shields, 1992) Loài Balanus crenatus ký sinh trên cua Cancer gracilis, C productus, và C magister ở Columbia (McGaw, 2006), trên cua Liocarcinus puber ở Scotland (Leborans và Gabilondo, 2008), Balanus amphitrite và Balanus eburneus trên cua Schizophrys dahlak ở Ai Cập (Madkour và cs, 2012) Nhóm giáp xác này có các phiến canxi lớn

bao bọc phía ngoài, khi chúng xuất hiện với số lượng lớn sẽ gây khó khăn cho quá trình di chuyển, vận động và có thể dẫn đến chết ở vật chủ (Tan và cs, 2011)

Giáp xác chân tơ thuộc bộ Akentrogonida: Loài Diplothylacus sinensis được ghi nhận trên loài ghẹ ba chấm Portunus sanguinolentus tại Trung Quốc (Yang và cs, 2014) Một số loài copepode như Choniopharea indica và Choniophaera cancrorum

được biết đến là loài ký sinh ăn trứng trên cua, ghẹ (Johnson, 1957)

1.3.1.4 Giun sán (Helminthes)

Giun: Các loài thuộc giống Carcinonemertes là động vật ăn trứng của cua, ghẹ (Kuris, 1987) Nghiên cứu của Shields và cộng sự (1989) đã mô tả C regicides là sinh vật ăn trứng trên cua đỏ Paralithodes camtschatica ở Alaska Trong khi đó, loài C epialti có ảnh hưởng đến quá trình lột xác và sinh sản của cua Hemigrapsus orgonensis (Kuris, 1987) Khảo sát về sự phân bố của loài Carcinonemertes sp trên cua tím Randallia ornata cho thấy giun có chiều dài khoảng 10 mm, tỷ lệ nhiễm trung

bình là 70% (85% trên cua cái ôm trứng, 67% trên cua cái sau ôm trứng và 45% trên cua đực) Giun trưởng thành được tìm thấy trên khối trứng của cua, giun trưởng thành thoái hóa nằm dưới phần bụng của cua cái sau khi ôm trứng, các nang ấu trùng được tìm thấy trên cua cái chưa trưởng thành và cua đực (Sadeghian và Kuris, 2001)

Ngoài giun tròn Carcinonemertes missukurii và Carcinonemertes sp ký sinh trên

ghẹ xanh đã được phát hiện ở Ả-rập Xê-út (Alsaqabi, 2010)

13

Shields (2001) đã mô tả loài Ovicides julieae thuộc giống giun mới Ovicides trên cua Chlorodiella nigra và C xishaensis ở Australia Ovicides cùng họ với Carcinonemertes và cũng là loài giun ăn trứng trên giáp xác mười chân Sự khác biệt

cơ bản giữa hai giống giun này là hình dạng của túi vòi và có thêm các gai thực quản

phụ ở Ovicides Ba loài mới khác là Ovicides jonesi trên cua Austinograea alayseae, Ovicides davidi trên cua Cyanagraea praedator và Ovicides jonesi trên cua Bythograea vrijenhoeki đã được Shields và Segonzac (2007) mô tả Tiếp đó Kajihara

và Kuris (2013) đã mô tả loài giun mới Ovicides paralithodis ký sinh trên cua Paralithodes camtschaticus ở Nhật Bản và Hoa Kỳ

Nghiên cứu về loài cộng sinh và ký sinh trên ghẹ xanh Portunus pelagicus ở Australia còn tìm thấy ấu trùng loài sán lá Levinseniella sp ký sinh trong cơ, máu, ấu trùng sán dây Polypocephalus moretonensis trong các dây thần kinh, ấu trùng Tetraphyllid trong ruột và ấu trùng giun dẹp Planoceroid trên mang ghẹ (Shields, 1992)

1.3.1.5 Giun nhiều tơ (Polychaete)

Gili và cộng sự (1993) đã phát hiện loài giun nhiều tơ Spirorbis patagonicus trên mai cua Bathynectes piperitus ở Nambia Hơn 50 % S patagonicus được tìm thấy trên

mai cua ở vị trí khoang mang, 38 % ở phần phía trước bề mặt mai, số còn lại ở phía

sau của bề mặt mai Ba loài giun nhiều tơ Spirorbis sp., Serpulid sp và Dipolydora socialis được tìm thấy trên các loài cua Cancer gracilis, C productus, và C magister

ở Columbia với tỷ lệ nhiễm từ 0,4 – 6,1 % (McGaw, 2006)

Madkour và cộng sự (2012) đã ghi nhận loài giun nhiều tơ Hydroides elegans sống trong các ống canxi gắn trên mai cua Schizophrys dahlak ở Ai Cập

Leborans và Gabilondo (2008) đã tìm thấy 2 loài giun nhiều tơ Pomatoceros triqueter và Hydroides norvegica ký sinh trên cua Liocarcinus puber ở Scotland Cả P triqueter và H norvegica đều sống trong các ống canxi màu trắng, uốn lượn trên mai cua

1.3.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam, những nghiên cứu về bệnh và ký sinh trùng trên cua, ghẹ mới được thực hiện rải rác ở một số địa phương trong khoảng hai mươi năm trở lại đây

Nghiên cứu của Bùi Quang Tề và cộng sự (1997) về cua nuôi thương phẩm tại Hải Phòng cho thấy, cua thường bị nhiễm bệnh run chân, bệnh cua sữa và bệnh hoa

mu vào mùa hè khi thời tiết nằng nóng kéo dài và sau đó là mưa rào Phan Hồng Dũng (2004) cũng đã thông báo về bệnh đen mang, bệnh phồng mang, bệnh chậm lớn, bệnh rong bám, bệnh khó lột xác là các bệnh thường gặp trên cua nuôi lồng ở Hải Phòng Theo Hoàng Đức Đạt (2000), cua nuôi ở giai đoạn Zoea thường nhiễm trùng lông

thuộc hai giống Zoothanium, Epistylis gây bệnh trùng loa kèn và V parahaemolyticus

giống, 7 họ Trong đó có 2 loài trùng lông Epistylis sp., Apisoma sp., 1 loài (Entoprocta) Loxosomella sp., 1 loài giun Carcinonemertes sp., 3 loài giáp xác Choniosphera indica, Octolasmis warwickii, Octolasmis sp và 1 loài giun dẹp chưa

được định danh Các cá thể ghẹ nhiễm từ 1 đến 5 loài ký sinh trùng Hai loài

Octolasmis sp và Carcinonemertes sp bắt gặp ở hầu hết các tháng nghiên cứu với tỷ

lệ nhiễm cao Hai loài Apiosoma sp và Epistylis sp với tỷ lệ nhiễm thấp bắt gặp ở một

vài tháng nghiên cứu Tháng 9 và tháng 10 là hai tháng ghẹ nhiễm ký sinh trùng cao nhất trong 6 tháng nghiên cứu, với thành phần loài đa dạng

Võ Thế Dũng (2013) đã công bố 4 loài KST trên ghẹ xanh, trong đó có loài giáp

xác chân đều Allokepon monodi chưa được công bố trên ghẹ xanh ở Việt Nam

1.4 Tổng quan chỉ thị phân tử trong nghiên cứu tiến hóa ký sinh trùng

1.4.1 Nghiên cứu đặc điểm của gen nhân và gen ty thể

Hệ gen (genome) chứa toàn bộ thông tin di truyền và các chương trình cần thiết cho cơ thể hoạt động Ở các sinh vật nhân chuẩn (eukaryote), 99% genome nằm trong nhân tế bào (hệ gen nhân – nuclear DNA (nDNA)) và phần còn lại nằm trong một số

cơ quan tử như ty thể và lạp thể (hệ gen ty thể - mitochondrial DNA (mtDNA) và hệ gen lạp thể - chloroplast DNA (ctDNA))

15

Gen nhân

Genome trong nhân thường lớn (3,3 tỷ base pairs ở người) và phân bố trên các nhiễm sắc thể dạng thẳng Trong khi đó đa số genome ở các cơ quan tử thường có kích thước nhỏ (16.569 base pairs ở người) và ở dạng vòng khép kín (Chial và Craig, 2008) Trong các nghiên cứu phân loại học thường sử dụng DNA nhân vì các DNA này có tính alen cao, tần

số đột biến thấp, việc truyền tính trạng tuân theo các định luật chặt chẽ

Trong hệ gen nhân tế bào, có một tổ hợp gen quan trọng gọi là tổ hợp DNA ribosome (rDNA), bao gồm các khung gen do 18S - ITS1 - 5,8S - ITS2 - 28S hợp thành Độ dài của gen 18S vào khoảng 1,9 - 2,0 kb, của gen 5,8S khoảng 150 bp, của gen 28S là khoảng 3,5 - 4,1 kb, vùng giao gen ITS-1 có độ dài khoảng 300 - 600 bp và ITS-2 có độ dài tương đương khoảng 300 - 500 bp Khoảng cách giữa các tổ hợp ribosome (rDNA) rất dao động ở các loài, từ 2 kb đến 9 kb, có khi vượt quá 10 kb Trong các loại rDNA nêu trên, 28S có vai trò quan trọng trong phân loại học; cạnh đó, vùng ITS thường được sử dụng trong các nghiên cứu về tiến hóa ở vi sinh vật nhằm xác định mức độ biệt hóa (Guarro và Tchigel, 1999)

Hình 1.4: DNA ty thể của loài Campylorhynchus zonatus

(Nguồn: http://www.tc.umn.edu/~barke042/projects.html) Mũi tên chỉ vùng gen COI mtDNA được sử dụng trong nghiên cứu hiện tại

DNA ty thể có đặc điểm cơ bản sau: số lượng bản sao lớn (Taylor và Turnbull, 2005), vùng mã hóa lớn, không tái tổ hợp, di truyền theo dòng mẹ (Saccone và cs, 1999) Với những đặc điểm trên, DNA ty thể trở thành công cụ đắc lực cho việc định danh loài, đánh giá mối quan hệ giữa các loài (Rubinoff, 2006) Các chỉ thị phân tử chuẩn của DNA ty thể thường được sử dụng là các gen mã hóa cho vùng điều khiển mtDNA, cytochrome b (cyt b) mtDNA, 16S mtDNA và cytochrome c oxidase subunits

1 (COI) mtDNA (Grande và cs, 2008) Trên thực tế, sử dụng một cặp môi chung khuếch đại đoạn gen cytochrome c oxidase subunits 1 (COI) của DNA ty thể có thể định danh được đến loài ở hầu hết các ngành thuộc hệ thống phân loại động vật (Herbert và cs, 2004) Đối với KST, hiểu biết đầy đủ về hệ gen ty thể, còn có giá trị định hướng trong phòng chống, đặc biệt tìm kiếm hoá chất, hoá dược, hoặc thực nghiệm các loại vacxin thế hệ mới (Herbert và cs, 2004)

Tuy nhiên, việc sử dụng DNA ty thể trong nghiên cứu di truyền cũng có một số giới hạn Kích thước DNA ty thể nhỏ nên chỉ thể hiện một phần vật chất di truyền Tỷ

lệ đột biến ở DNA ty thể cao hơn DNA nhân (Brown và cs, 1979), đột biến có thể xảy

ra nên không phản ánh được mối quan hệ phát sinh loài hay lịch sử tiến hóa Vì vậy,

17

DNA ty thể được đề nghị sử dụng kết hợp với các chỉ thị phân tử để có kết quả với độ chính xác cao (Hebert và cs, 2004) Trong các nghiên cứu tiến hóa gần đây, DNA nhân thường được sử dụng với DNA ty thể để cho thấy mối quan hệ tiến hóa rõ hơn (Schander và Willassen, 2005)

1.4.2 Nghiên cứu định danh và mối quan hệ phát sinh loài ký sinh trùng trên cua, ghẹ

Các nghiên cứu sử dụng công nghệ di truyền để định danh và phân tích mối quan

hệ phát sinh các loài ký sinh trùng trên cua, ghẹ còn rất hạn chế

Glenner và cộng sự (2003) sử dụng chỉ thị phân tử 18S rDNA và COI mtDNA để

nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài của 10 loài giáp xác thuộc giống Sacculina,

chuyên ký sinh trên cua, ghẹ Kết quả cây phát sinh loài của cả 2 gen cho thấy

Sacculina plana có mối quan hệ gần gũi với S gregaria với S polygenea S carcini có quan hệ gần gũi với nhóm ngoại là loài Loxothylacus panopaei và Heterosaccus californicus hơn là các loài khác trong cùng giống

Losada và cộng sự (2004) nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa dựa trên 167 trình tự thuộc các gen 18S, 28S, histone H3 rDNA, 12S và 16S mtDNA của 35 loài giáp xác bám thuộc liên bộ Thoracica, trong đó có một số loài ký sinh trên cua, ghẹ Kết quả cho thấy sự phù hợp giữa đặc điểm hình thái và di truyền Hầu hết các loài nghiên cứu thuộc bộ phụ Balanomorpha Bộ phụ Heteralepadomorpha có mối quan hệ gần gũi với Lepadomopha Cây phân loại đã làm rõ câu hỏi quan trọng về sự tiến hóa, trong đó bộ Sessilia (không có cuống) là một nhánh đơn phát triển từ tổ tiên có cuống Scalpellomorpha với nhiều hơn 5 tấm canxi hơn là nhóm Lepadomorpha (chỉ gồm 5 phiến canxi) Nhóm tác giả cũng đưa ra giả định rằng sự khoáng hóa lớp vỏ ngoài của các loài không xương sống có thể được tiến hóa từ khoáng hóa phosphat sang khoáng hóa canxi

Gurney và cộng sự (2006) so sánh đặc điểm của 17 trình tự gen COI mtDNA của

loài Sacculina carcini ký sinh trên cua Carcinus maenas ở Anh và Đan Mạch, trên cua Liocarcinusm armoreus ở Ireland và cua Liocarcinush olsatus ở Wales Kết quả cho thấy sự khác biệt trình tự giữa Sacculina carcini và Sacculina sp là 25 %, giữa S carcini và S oblonga là 34 % Sacculina carcini và Sacculina sp có mối quan hệ gần gũi với nhóm ngoại Heterosaccus lunatus hơn là các loài Sacculina khác Sự khác biệt

trình tự của S carcini trên cua Carcinus maenas ở Anh và Đan Mạch là 0,6 %, trên cua Carcinus và Liocarcinush là 0,4 %

Chen và cộng sự (2013) đã sử dụng chỉ thị phân tử COI mtDNA cùng cặp mồi LCO1490 và HCO2198 để định loại các ấu trùng trôi nổi của giáp xác chân tơ Nghiên cứu đã phân tích trình tự của 540 ấu trùng giáp xác và so sánh với trình tự từ các cá thể trưởng thành của 48 loài giáp chân tơ (trong đó có 3 loài ký sinh trên cua, ghẹ), đồng thời phân tích một số đặc điểm hình thái của các ấu trùng như: chiều rộng và chiều cao phần thân, kích thước và cấu tạo các râu Kết quả cho thấy các ấu trùng thuộc 36 loài, trong đó định danh được 26 loài do trình tự trùng khớp với các cá thể trưởng thành và

10 chưa được định danh Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái cho thấy mối tương tác giữa cấu trúc an ten của ấu trùng và tính chất các giá thể bám của chúng khi trưởng thành

Kajihara và Kuris (2013) đã công bố và mô tả đặc điểm hình thái loài giun mới

Ovicides paralithodis trên cua Paralithodes camtschaticus ở Nhật Bản và Hoa Kỳ Nghiên cứu chỉ thị phân tử 28S rDNA và COI mtDNA cho thấy Ovicides paralithodis

có mối quan hệ gần gũi với giống Carcinonemertes Kết quả này phù hợp với các đặc

điểm hình thái

Zardus và cộng sự (2013) đã nghiên cứu trình tự gen COI mtDNA, 12S rDNA và

28S rDNA của 4 loài giáp xác chân tơ giống Chelonibia ký sinh trên rùa biển, bò biển, cua và tôm biển Kết quả cho thấy 3 loài Chelonibia testudinaria, C patula và C manati có trình tự không khác biệt, chứng tỏ chúng là cùng một loài Không có sự khác biệt trình tự của Chelonibia thu từ các vật chủ khác nhau Có sự khác biệt trình tự

của các mẫu thu ở các khu vực địa lý khác nhau trong đó mẫu thu từ đông Thái Bình Dương khác từ Đại Tây Dương là 5,3 %, giữa đông Thái Bình Dương và Ấn Độ - Tây Thái Bình Dương là 7,3 %

19

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Loài ghẹ xanh Portunus pelagicus (Linnaeus, 1758) và các loài ký sinh trùng trên

ghẹ xanh ở vùng biển Việt Nam

2.2 Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu tập trung khảo sát thành phần loài ký sinh trùng trên ghẹ xanh ở 03 khu vực biển đại diện cho 3 miền Bắc, Trung, Nam của Việt Nam Miền Bắc: vùng biển Hải Phòng (bao gồm đảo Cát Bà), miền Trung: vùng biển Khánh Hòa – Phú Yên

và miền Nam: vùng biển Kiên Giang (bao gồm đảo Phú Quốc) Bản đồ khu vực thu

mẫu được thể hiện trong Hình 2.1

Thời gian tiến hành nghiên cứu: từ tháng 10-2015 đến tháng 8-2016

Hình 2.1 Bản đồ các khu vực thu mẫu tại Việt Nam

Mẫu được thu ở vùng biển thuộc các địa danh hành chính được đánh dấu màu Màu xanh lá: tỉnh Hải Phòng (bao gồm đảo Cát Bà); Màu xanh biển: tỉnh Phú Yên;

Màu hồng: tỉnh Khánh Hòa; Màu cam: tỉnh Kiên Giang (bao gồm đảo Phú Quốc)

21

2.3 Sơ đồ khối nghiên cứu

Hình 2.2: Sơ đồ khối nghiên cứu

Thu mẫu ghẹ xanh

Xác định giới tính ghẹ

và các thông số về kích thước, khối lượng

Kiểm tra ngoại và nội ký sinh Thu mẫu ghẹ xanh

Thu mẫu ký sinh trùng

Nghiên cứu đặc điểm hình thái

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp thu mẫu ghẹ xanh

Tổng cộng 365 cá thể ghẹ xanh đã được thu từ các khu vực nghiên cứu Ghẹ

được thu mua trực tiếp từ ngư dân đánh bắt và vận chuyển về phòng thí nghiệm -

Trung tâm Thí nghiệm Thực hành, Trường Đại học Nha Trang Kích thước, khôi

lượng của ghẹ xanh ở từng khu vực nghiên cứu được thể hiện trong Bảng 2.1

Bảng 2.1 Số liệu về mẫu ghẹ nghiên cứu

Số lượng ghẹ Chiều rộng

mai (mm)

Khối lượng (g)

Stt Địa điểm nghiên cứu

Ghẹ đực Ghẹ cái giá trị trung bình ± độ lệch

Trước khi kiểm tra và thu thập KST cần ghi đầy đủ các thông tin: ngày, tháng,

năm, địa điểm thu mẫu, ký hiệu và chụp hình mẫu Xác định khối lượng ghẹ bằng cân

có độ chính xác 0,1 g, đo chiều rộng mai bằng thước kẹp có độ chính xác 1 mm, xác

định giới tính và giai đoạn sinh sản của ghẹ (mai mềm, ghẹ cái ôm trứng, ghẹ sau khi

sinh sản…)

2.4.3 Thu mẫu KST trên ghẹ

Thu mẫu ngoại ký sinh

Đặt ghẹ lên đĩa petri có chứa nước biển Quan sát các KST ở bên ngoài cơ thể

bằng mặt thường, kính lúp và kính soi nổi

+ Yếm và khối trứng trong yếm (nếu có), mai, mang, chân hàm, các phần phụ

miệng, càng và các chân: được tách lần lượt, cho riêng vào các đĩa petri có chứa nước

biển sạch để kiểm tra bằng mắt thường, kính soi nổi hoặc kính hiển vi

23

+ Khi phát hiện KST, tách chúng ra khỏi cơ thể vật chủ bằng conter hút, dùi, nhíp hoặc dao giải phẫu, làm sạch, giữ trong đĩa petri chứa nước biển sạch

Thu mẫu nội ký sinh

Giải phẫu ghẹ để kiểm tra cơ quan bên trong, dùng panh tách riêng từng bộ phận

để tiên hành kiểm tra

+ Máu: dùng xilanh lấy máu của ghẹ (ở gốc chân bơi thứ năm) dàn đều lên lam kính để quan sát

+ Tim, dạ dày, tuyến sinh dục, ruột cắt theo chiều dọc, gan, tụy, mô cơ từ càng ghẹ: được tách riêng từng phần, ép giữa hai lam kính và quan sát dưới kính hiển vi + Khi phát hiện KST làm tương tự với mẫu ngoại ký sinh nhưng giữ mẫu trong nước muối sinh lý

KST được tiếp tục nghiên cứu hình thái, mẫu tươi hoặc được bảo quản trong cồn tuyệt đối (99,8%) để nghiên cứu di truyền

Đếm số lượng KST và ghi chú vị trí ký sinh để xác định tỷ lệ nhiễm và mật độ nhiễm

2.4.4 Nhuộm và làm tiêu bản và bảo quản KST

- Động vật nguyên sinh (Protozoa)

Nhuộm và làm tiêu bản: Các lam kính đã phết mẫu, được để khô trong không

nước cất Chuyển lam kính sang đĩa petri chứa nước cất, đặt mặt nhớt lên trên và ngâm lam trong nước ngập sâu khoản 1 – 1,5 cm, phơi dưới ánh nắng mặt trời trong thời gian từ 60– 90 phút Trong quá trình phơi cần kiểm tra mẫu, sau khi thấy rõ cấu tạo của trùng thì dừng phơi Rửa nước cất, đặt ngửa trên giấy lọc để hút khô nước Kiểm tra bằng kính hiển vi, chọn tiêu bản đẹp, gắn tiêu bản bằng vaseline, ghi nhãn đầy đủ

- Entoprocta, động vật hình rêu (Bryozoa)

- Giun dẹp (Platyhelminthes)

Làm trùng no nước bằng cách đưa trùng qua các thang cồn có nồng độ nhỏ dần:

700, 500, 300, 100, 00 Ở mỗi nồng độ cồn nên để khoảng 15 – 20 phút

Cho trùng vào dung dịch nhuộm Carmin hoặc Hematoxylin trong thời gian từ 1 – 3h (tùy theo độ lớn nhỏ của trùng) Theo dõi dưới kính hiển vi hoặc kính giải phẫu khi nào thấy tầng bì cơ thể trùng màu đỏ, các cơ quan bên trong có màu đỏ đậm, nhạt không giống nhau (nếu nhuộm bằng dung dịch Carmin) hoặc thấy tầng bì có màu xanh tro, các cơ quan bên trong màu xanh tím (nếu nhuộm bằng Hematoxylin)

Nếu trùng bắt màu quá đậm nên làm nhạt màu bằng cách nhúng trùng trong cồn acid (cồn acid chlorhydric) Nhúng trùng và rửa qua nước chảy nhẹ 1 giờ

Tiếp theo là quá trình làm mất nước bằng cách cho trùng qua các thang cồn có nồng độ cao dần: 100, 300, 500, 700, 900, 1000, cồn xylen và cuối cùng là xylen (giữ ở mỗi thang khoảng 15 phút) Ở những thang cồn cuối 90 – 1000 nên giữ trùng trong khoảng 30 – 45 phút hoặc thay cồn 2 lần, cồn xylen có tác dụng làm trong tiêu bản Dùng panh gắp trùng ra, đặt lên một tấm lam sạch, gắn tiêu bản bằng canada balsam

- Giun (Nemertea), giun nhiều tơ (Polychaete), giáp xác (Crustacea)

Không cần nhuộm và làm tiêu bản cho nên trước khi quan sát cần ngâm trùng trong dung dịch làm trong: acid lactic Thời gian ngâm khoảng 20 phút đến 1 ngày tùy theo kích thước trùng lớn hay nhỏ cho đến khi cơ thể trùng trong suốt Sau khi quan sát xong, trả trùng về dung dịch cố định (cồn 700)

KST được quan sát dưới vật kính (4x, 10x, 40x, 100x) và quan sát chiều dài của KST tương ứng với số vạch của thước đo khi quan sát thị kính sau khi đã được hiệu chỉnh bằng thước đo chuẩn (1 vạch/vật kính 10x = 0,01 mm, 1 vạch/vật kính 4x = 0,025 mm), từ đó suy ra kích thước của KST phân loại

25

2.4.6 Xác định tỷ lệ và mật độ nhiễm KST trên ghẹ xanh

Tỷ lệ nhiễm và mật độ nhiễm trung bình ký sinh trùng được xác định theo định nghĩa của Bush và cộng sự (1997)

Mật độ nhiễm trung bình : (2.2) Trong đó: P: là tỷ lệ ghẹ xanh bị nhiễm KST, tính bằng đơn vị %

Kiểm định Chi bình phương được sử dụng để so sánh tỷ lệ nhiễm KST

Kiểm định Mann – Whitney để so sánh mật độ nhiễm KST theo giới tính ghẹ và mùa trong năm Kruskal – Wallis để so sánh mật độ nhiễm KST theo khu vực nghiên cứu Các số liệu thống kê được xử lý, mức độ ý nghĩa P = 0,05

Các chữ a, b, c thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỷ lệ nhiễm (Chi bình phương, P < 0,05) của các loài KST khi so sánh theo khu vực nghiên cứu, theo mùa và theo giới tình ghẹ Tương tự x, y, z thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa về mật độ nhiễm

(Mann – Whitney, P < 0,05; Kruskal – Wallis, P < 0,05)

2.4.7 Phân loại, mô tả KST dựa vào đặc điểm hình thái

KST được trên ghẹ xanh được phân loại và mô tả hình thái theo các tìa liệu như sau: Trùng lông (Ciliophora) được phân loại theo Corliss (1979); Entoprocta phân loại theo Nielsen (1971) và Iseto (2010); động vật hình rêu phân loại theo Abelló và Corbera (1996); Giun dẹp (Flatworm) phân loại theo Kluijver và cộng sự (2000); giun (Nemertea) phân loại theo Humes (1942), Sheilds và cộng sự (1989); giáp xác (Crustacea) phân loại theo Jeffries (2005), Chan và cộng sự (2009)

Đặc điểm hình thái KST được vẽ trực tiếp dựa trên phần mềm Adobe Illustrator CS6 và xử lý bằng Photoshop CS6 Đặc điểm phân loại chủ yếu của các nhóm KST:

- Trùng lông (Ciliophora): Căn cứ vào hình dạng, kích thước tế bào; các cá thể tồn tại đơn lẻ hay dạng quần thể; cấu tạo nhân lớn, nhân nhỏ, không bào co bóp, không bào tiêu hóa, vành lông rung; khả năng co rút của thân và cuống

- Entoprocta: Căn cứ vào hình dạng và cấu tạo phần đài, phần cuống, dạ dày; số lượng xúc tu; số lượng, vị trí phát triển chồi và loại vật chủ

- Động vật hình rêu (Bryozoa): Cấu tạo của tập đoàn; hình dạng, kích thước của

cơ thể; cấu tạo phần thân, phần cuống; số lượng các tua cảm

- Giun dẹp (Flatworm): Căn cứ vào hình dạng và màu sắc cơ thể, cấu tạo phần não, miệng, các cơ quan sinh sản, phân bố các điểm mắt

- Giun (Nemertea): Căn cứ vào hình dạng kích thước cơ thể; cấu tạo, kích thước vòng thần kinh, thực quản, vòi, túi vòi, ruột, các tuyến, số lượng gai thực quản

- Giun nhiều tơ (Polychaete): Căn cứ phân loại là hình dạng, kích thước cơ thể, nắp mang, vòng gai trên nắp mang

- Giáp xác (Crustacea): Căn cứ vào hình dạng cơ thể, cấu tạo phần đầu, phần thân,

số lượng, hình dạng và vị trí các phiến canxi, cấu tạo các đôi chân, hình dạng chân

2.4.8 Nghiên cứu di truyền KST ký sinh trên ghẹ xanh ở Việt Nam

2.4.8.1 Định danh loài dựa trên chỉ thị phân tử 28S rDNA và COI mt DNA

Tách chiết DNA

DNA của từng cá thể KST được tách chiết bằng bộ kit DNAeasy Tissue

Extraction Kit (Qiagen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Phụ lục 1) DNA sau khi

tách chiết được bảo quản trong tủ đông ở – 400C

27

Tiến hành phản ứng PCR

Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích 50μl bao gồm: khuôn DNA 10 μl (20 μg/ml) đối với gen 28S rDNA và 9 μl đối với gen COI mtDNA, Dream Tag Buffer 5μl (10X), dNTP 1 μl (10 mM), mồi xuôi 2 μl và mồi ngược 2 μl (10 pmol/μl), Tag DNA polymerase 0.25 μl (5 U/μl) và nước cất cho đủ thể tích

Gen 28S rDNA sử dụng cặp mồi LSU-5: 5’_TAG GTC GAC CCG CTG AAT TTA AGC A_3’ và 1500R: 5’_ GCT ATC CTG AGG GAA ACT TCG_3’ (Olson và

cs, 1994); bước kéo dài tại 720C trong 7 phút

Điện di sản phẩm PCR, kiểm tra kết quả

Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di trên gel agarose 1,5 % nhuộm Ethidium bromide

Chuẩn bị gel agarose 1.5%: Cân 0.6 g agarose rồi thêm 40 mL đệm TBE 1X chứa trong bình tam giác 100 mL thứ nhất, cân khối lượng bình, đun sôi trong lò vi sóng cho đến khi agarose tan hoàn toàn Cân lại khối lượng bình và thêm nước cất vào cho đạt khối lượng ban đầu Để nguội 60°C - 70°C, chuyển qua bình tam giác 100 mL thứ hai và thêm 2 μL Ethidium bromide, lắc nhẹ để tránh tạo bọt và trộn đều (lưu ý hóa chất này độc hại cần tuyệt đối cẩn thận khi thao tác) Đổ gel ra khuôn đã được lắp đặt sẵn Khi gel nguội hoàn toàn và đông cứng lại, rút nhẹ bản lược ra theo phương thẳng đứng để tránh làm rách các giếng Bảo quản gel trong đệm TBE 1X

Chạy điện di: Cho gel vào bể điện di và thêm đệm TBE 1X cho đến khi ngập bản gel Dùng micropipette trộn đều 5 µL mẫu của từng loài KST với 1 µL loading dye

6X, rồi bơm vào các giếng khác nhau của gel Hút 3 µL DNA Ladder (thang DNA) vào 1 giếng Tiến hành chạy điện di với nguồn điện 90 V, 400 mA trong 20 phút Đọc kết quả: Sau khi chạy xong, lấy gel đặt lên bàn UV Transilluminator và xem các băng DNA dưới tia cực tím

Giải trình tự DNA

Sản phẩm PCR được tiến hành phản ứng giải trình tự theo nguyên tắc Dye – labelles dideoxy terminator (Big Dye Terminator v.3.1, Applied Biosystems) với các đoạn mồi tương tự như phản ứng PCR theo chương trình luân nhiệt như sau: 960C trong 20 giây, 500C trong 20 giây, cuối cùng là 600C trong 4 phút Sản phẩm sau đó được phân tích bằng thiết bị ABI Prism 3.700 DNA Analyser (Applied Biosystems)

2.4.8.2 Phân tích dữ liệu và xây dựng mối quan hệ phát sinh loài

Trình tự gen 28S rDNA của 10 loài KST, và gen COI mtDNA của 9 loài KST trên ghẹ xanh được xử lý và kết nối bằng phần mềm Vector NTI verson 11.5.0 (Huang, 1996), sau đó kiểm chứng bằng chương trình BLAST (ncbi.nlm.nih.gov/Blast) Các trình tự được dóng hàng (alignment) bằng phần mềm Bioedit (Hall, 1999), sau đó được kiểm tra và chỉnh sửa bằng mắt thường

Phân tích di truyền đối với gen 28S rDNA của 10 loài KST thu được trên ghẹ xanh và 15 loài từ Genbank, đối với gen COI mtDNA 9 trình tự thu được và 13 trình

tự từ Genbank Thông tin về các loài KST trên ghẹ xanh và các loài từ Genbank được

thể hiện trong Bảng 2.2

Phân tích mối quan hệ phát sinh loài của KST được tiến hành dựa trên thuật toán Neighbor – Joining bằng phần mềm MEGA 6 (Tamura và cs, 2013) với giá trị bootstrap (độ lặp lại) 1.000 lần Cây phân loại được hiển thị và hiệu chỉnh bằng phần mềm TreeView (Page, 1996)