Đa dạng thành phần loài hải quỳ cộng sinh với cá khoang cổ tại khánh hòa bằng các đặc điểm hình thái và di truyền

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG --- O 0 O --- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐA DẠNG THÀNH PHẦN LOÀI HẢI QUỲ CỘNG SINH VỚI CÁ KHOANG CỔ TẠI KHÁNH HÒA BẰNG CÁC ĐẶC ĐI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

- O 0 O -

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

ĐA DẠNG THÀNH PHẦN LOÀI HẢI QUỲ CỘNG SINH VỚI CÁ KHOANG CỔ TẠI KHÁNH HÒA BẰNG CÁC ĐẶC

ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ DI TRUYỀN

Giảng viên hướng dẫn : Th.S Nguyễn Thị Hải Thanh

TS Đặng Thúy Bình Sinh viên thực hiện : Phan Thị Bình An

Mã số sinh viên : 55130013

Khánh Hòa, tháng 06/2017

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

BỘ MÔN SINH HỌC

- O 0 O -

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

ĐA DẠNG THÀNH PHẦN LOÀI HẢI QUỲ CỘNG SINH VỚI

CÁ KHOANG CỔ TẠI KHÁNH HÒA BẰNG CÁC ĐẶC

ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ DI TRUYỀN

GVHD : Th.S Nguyễn Thị Hải Thanh

TS Đặng Thúy Bình

SVTH : Phan Thị Bình An

MSSV : 55130013

Khánh Hòa, tháng 06/2017

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp, em xin gửi lời cảm ơn đến Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang đã tạo môi trường thuận lợi về cơ sở vật chất cho em trong suốt quá trình thực hiện đồ án

Cảm ơn dự án NOHRED đã hộ trợ kinh phí cho em hoàn thành tốt đồ án này Đặc biệt em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến ThS Nguyễn Thị Hải Thanh và TS Đặng Thúy Bình đã tận tình hướng dẫn dạy bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi để cho em hoàn thành tốt đồ án này

Em xin gửi lời cảm ơn đến ThS Trương Thị Oanh, ThS Trần Quang Sáng đã nhiệt tình giúp đỡ em trong việc hoàn thành đồ án

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Sinh học và Công nghệ sinh học đã giảng dạy và cung cấp kiến thức cho em trong bốn năm học qua

Gửi lời cảm ơn đến các ctv làm việc ở phòng nuôi viện công nghệ sinh học và môi trường

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, anh chị, bạn bè và người thân đã quan tâm, hỗ trợ và động viên em hoàn thành tốt bài đồ án

Trong quá trình thực hiện không thể nào tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp để đồ án trở nên hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Khánh Hòa, ngày 26 tháng 6 năm 2017 Sinh viên thực hiện

Phan Thị Bình An

TÓM TẮT

Khánh Hòa là một tỉnh duyên hải Nam Trung Bộ Việt Nam với hơn 200 đảo và quần đảo cộng với khí hậu ôn hòa là nơi thích hợp cho nhiều loài sinh vật sinh sống và phát triển trong đó có hải quỳ Là nơi có độ đa dạng các loài hải quỳ cao nhất ở Việt Nam, nghiên cứu hiện tại thu được 9/11 loài hải quỳ được tìm thấy ở Khánh Hòa

(Entacmae quadricolor, Macrodactyla doreensis, Heteractis aurora, Heteractis crispa,

Heteractis malu, Stichodactyla tapetum, Stichodactyla haddoni, Stichodactyla gigantea, Stichodactyla mertensii) thuộc 4 giống (Entacmae, Macrodactyla, Heteractis, Stichodactyla), 2 họ (Actiniidae và Stichodactylidae)

Nghiên cứu dựa vào các chỉ tiêu phân loại (Fautin and Allen, 1992), định danh bổ sung vào nghiên cứu trước của ctv Lương Thị Tường Vi 4 loài hải quỳ được tìm thấy

tại Khánh Hòa và đính chính lại loài S tapetum do ctv nghiên cứu trước đây

Nghiên cứu đã xây dựng sơ bộ khóa định loại các loài hải quỳ tại Khánh Hòa dựa vào dữ liệu đặc điểm hình thái Đồng thời, nghiên cứu phân tích mối quan hệ tiến hóa giữa các loài hải quỳ dựa vào 2 trình tự gen ty thể là: COI và 16S rRNA Nghiên cứu cho thấy tốc độ tiến hóa của các loài hải quỳ trong hệ gen ty thể thấp dẫn đến thiếu sự phân tách giữa các loài trong cùng giống, tuy nhiên giữa chúng vẫn thể hiện mối quan

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ SƠ ĐỒ vii

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về vùng nghiên cứu 3

1.2 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu (hải quỳ - sea anemones) 5

1.2.1 Phân loại và phân bố 5

1.2.2 Đặc điểm hình thái và sinh học 6

1.3Tổng quan về hệ gen ty thể (mitochondrial DNA-mtDNA) 8

1.4 Tình hình nghiên cứu phân loại hải quỳ trên thế giới và Việt Nam 10

1.4.1 Trên thế giới 10

1.4.2 Việt Nam 12

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Đối tượng nghiên cứu 14

2.2 Sơ đồ khối nghiên cứu 14

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu hình thái 15

2.3.2 Xây dựng khóa phân loại hải quỳ 16

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu di truyền 16

2.3.4 Phân tích dữ liệu và xây dựng cây phát sinh chủng loại 19

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21

3.1 Thành phần loài hải quỳ tại Khánh Hòa dựa vào các đặc điểm hình thái 21

3.1.1 Thành phần các loài hải quỳ thu được tại Khánh Hòa 21

3.1.2 Đặc điểm hình thái một số loài hải quỳ tại Khánh Hòa 22

3.2 Nghiên cứu di truyền các loài hải quỳ 33

3.2.1 Tách chiết DNA tổng số 33

3.2.2 PCR khuếch đại đoạn gen 16S rRNA và COI mtDNA của hải quỳ 33

3.2.3 Xây dựng mối quan hệ phát sinh loài giữa các loài hải quỳ tại Khánh Hòa

34

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

4.1 Kết luận 41

4.2 Kiến nghị 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

PHỤ LỤC

BT Bootstrap (độ tin cậy)

cDNA Cytoplasma Deoxyribinucleic acid COI Cytochrome C oxydase submid I

ctDNA Chloroplasts Deoxyribonucleic acid

PCR Polymerase Chain Reaction

rRNA Ribosomal Ribonucleic Acid

tRNA Transfer Ribonucleic Acid

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 - Bản đồ các nơi có mặt hải quỳ ở vùng biển Khánh Hòa 6

Hình 1.2 - Mô tả cấu trúc hải quỳ 7

Hình 1.3 - Vòng đời của hải quỳ sinh sản bằng hình thức hữu tính 7

Hình 1.4 - DNA ty thể người 9

Hình 2.1 - Các chỉ tiêu đo của hải quỳ (Fautin and Allen, 1992) 15

Hình 2.2 - Chu trình nhiệt của phản ứng PCR đối với đoạn gen COI mt DNA và 16S rRNA 18

Hình 3.1 - Đặc điểm hình thái hải quỳ Heteractis crispa 24

Hình 3.2 - Đặc điểm hình thái hải quỳ Heteractis malu 25

Hình 3.3 - Đặc điểm hình thái hải quỳ Stichodactyla gigantea 27

Hình 3.4 - Đặc điểm hình thái hải quỳ Stichodactyla mertensii 28

Hình 3.5- Đặc điểm hình thái hải quỳ Stichodactyla tapetum 30

Hình 3.6 - Kết quả điện di DNA tổng số của hải quỳ được tách chiết từ bộ Kit Qiagen 33

Hình 3.7 - Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen COI mtDNA và 16S rRNA của một số loài hải quỳ tại Khánh Hòa 33

Hình 3.8 - Cây phát sinh loài của hải quỳ dựa trên gen COI mtDNA 36

Hình 3.9 - Cây phát sinh loài của hải quỳ dựa trên gen 16S rRNA 39

DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ SƠ ĐỒ

Bảng 1.1 - Nhiệt độ và lượng mưa trung bình của tỉnh Khánh Hòa 4Bảng 2.1 - Trình tự hai đoạn mồi nghiên cứu sử dụng khuếch đại 2 đoạn gen hải quỳ 16Bảng 2.2 – Đặc điểm của 2 cặp mồi nghiên cứu sử dụng 17Bảng 2.3 - Thành phần phản ứng PCR với tổng thể tích 50 µl 17Bảng 3.1 - Thành phần loài thu được tại Khánh Hòa 21Bảng 3.2 - Danh sách một số loài hải quỳ nhóm nghiên cứu thu được tại Khánh Hòa 21Bảng 3.3 - Độ tương đồng của trình tự gen COI mtDNA và 16S rRNA của các loài hải quỳ tại Khánh Hòa với dữ liệu Genbank 34

Sơ đồ 2.1 - Sơ đồ nghiên cứu chung 14

Hexacorallia thuộc lớp Anthozoa (Daly et al., 2008), với hơn 1.200 loài Hải quỳ là

những polyp đơn không xương sống phân bố ở mọi độ sâu và vĩ độ, chúng chiếm hầu

hết sinh cảnh trong rạn san hô (Rodríguez et al., 2014) Tuy nhiên chỉ có 10 loài hải quỳ (Cryptodendrum adhaesivum, Entacmae quadricolor, Macrodactyla doreensis,

Stichodactyla haddoni, Stichodactyla gigantea, Stichodactyla mertensii, Heteractis crispa, Heteractis malu, Heteractis aurora, Heteractis magnifica) được ghi nhận có

quan hệ cộng sinh với 28 loài cá khoang cổ (Burke et al., 2016) Nhờ tuyến độc

(nematocysts) tại xúc tu, các loài hải quỳ không những có khả năng bảo vệ bản thân, bên cạnh đó chúng còn bảo vệ các loài tảo cộng sinh với chúng (Trench, 1971b) Ngoài

ra chúng còn là nhà, là nơi cư trú, ẩn náu của một số loài tôm, cua (Mercier and Hamel,

2008; Goodwill et al., 2009; Fautin, 2016) và đặc biệt là cá khoang cổ (Fautin and Allen, 1992; Burke et al., 2016)

Chỉ tiêu hình thái là cơ sở ban đầu rất quan trọng để phân loại sinh vật Tuy nhiên, đôi khi những đặc điểm hình thái dưới sự tác động của môi trường và biến dị cá thể có thể gây nhầm lẫn trong công tác phân loại Đặc biệt, hải quỳ là loài rất đa dạng về màu sắc, kích cỡ nhưng lại có ít đặc điểm phân loại Hơn thế nữa cấu trúc hình thái hải quỳ rất dễ thay đổi khi ở trong môi trường không thích hợp và khi rời khỏi nước vì thế việc phân loại hải quỳ chỉ dựa vào hình thái là rất khó khăn Do đó, cần kết hợp phân loại hải quỳ bằng hình thái và những chỉ thị sinh học phân tử để có độ chính xác cao hơn Nhận thấy sự đa dạng sinh học của hải quỳ ở rạn san hô là tiền đề cho sự phát triển

bền vững, đề tài “Đa dạng thành phần loài hải quỳ cộng sinh với cá khoang cổ tại Khánh Hòa bằng các đặc điểm hình thái và di truyền” được thực hiện nhằm cung

cấp những dẫn liệu về hình thái và di truyền của một số loài hải quỳ tại Khánh Hòa, làm

cơ sở cho những nghiên cứu đa dạng sinh học quan hệ cộng sinh sau đó bằng việc xây dựng dữ liệu di truyền mã vạch DNA (DNA barcoding)

 Mục đích của đề tài

Nghiên cứu sử dụng phương pháp phân loại dựa trên đặc điểm hình thái và di truyền sử dụng 2 chỉ thị gen ty thể COI và 16S rRNA nhằm định danh và xây dựng mối quan hệ phát sinh loài của các loài hải quỳ thu được tại Khánh Hòa

 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Sử dụng phương pháp phân loại hình thái và di truyền để dịnh danh các loài hải quỳ thu được tại tỉnh Khánh Hòa

 Nội dung nghiên cứu

o Thu mẫu các loài hải quỳ cộng sinh với cá khoang cổ tại Khánh Hòa

o Phân loại các loài hải quỳ cộng sinh với cá khoang cổ bằng hình thái và di truyền

o Khảo sát mối quan hệ tiến hóa của các loài hải quỳ cộng sinh tại Khánh Hòa

 Ý nghĩa Khoa học và thực tiễn của đề tài

Nghiên cứu góp phần khảo sát sự đa dạng thành phần loài hải quỳ tại Khánh Hòa, đồng thời cung cấp dữ liệu về khóa định loại cơ bản và di truyền của gen COI và 16S rRNA thuộc hệ gen ty thể Dữ liệu này có thể được sử dụng như nguồn dữ liệu đầu vào cho các nghiên cứu về mối quan hệ cộng sinh giữa các loài cá khoang cổ và hải quỳ, là

cơ sở phục vụ cho nghiên cứu tác động của biến đổi khí hậu đến đa dạng sinh học ở rạn san hô

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về vùng nghiên cứu

 Vị trí địa lý

Khánh Hòa là một tỉnh duyên hải Nam Trung Bộ Việt Nam, giáp với tỉnh Phú Yên

về hướng Bắc, tỉnh Đắk Lắk về hướng Tây Bắc, tỉnh Lâm Đồng về hướng Tây Nam, tỉnh Ninh Thuận về hướng Nam và Biển Đông về hướng Đông; có mũi Hòn Đôi trên bán đảo Hòn Gốm huyện Vạn Ninh là điểm cực Đông trên đất liền của nước ta

Diện tích tự nhiên của Khánh Hòa, cả trên đất liền và hơn 200 đảo và quần đảo là 5.197 km2 Phần đất liền của tỉnh nằm kéo dài từ tọa độ địa lý 12o52’15” đến 11o42’50”

vĩ độ Bắc và từ 108o40’33” đến 109o29’55” kinh độ Đông (Đỗ Công Thung, 2011) Bờ biển dài 385 km với nhiều cửa lạch, đầm, vịnh, nhiều đảo và vùng biển rộng lớn Đặc biệt huyện đảo Trường Sa là nơi có vị trí kinh tế, an ninh quốc phòng trọng yếu Hiện tại Khánh Hòa bao gồm 2 thành phố trực thuộc tỉnh là Nha Trang và Cam Ranh, 1 thị

xã Ninh Hòa và 6 huyện bao gồm Vạn Ninh, Diên Khánh, Khánh Vĩnh, Khánh Sơn, Cam Lâm và huyện đảo Trường Sa, với tổng diện tích 5.217,6 km2 (Cổng thông tin hành chính tỉnh Khánh Hòa, 2008)

(Bảng 1.1)

Bảng 1.1 - Nhiệt độ và lượng mưa trung bình của tỉnh Khánh Hòa

Cao nhất

( o C) 27 28 29 31 32 32 32 32 32 3 28 27 Thấp nhất

( o C) 22 22 23 25 26 26 26 26 25 24 24 22 Lượng

mưa (cm) 2,4 0,56 2,07 1,98 5,08 3,48 2,62 3,23 13,38 25,43 25,12 12,22

(Nguồn: Thời tiết – MSN wether)

 Hệ sinh thái rạn san hô

Rạn san hô có vai trò quan trọng đối với việc hình thành, bảo vệ cấu trúc nền đáy, duy trì các dòng chảy tự nhiên Đồng thời là nơi trú ẩn, sinh sản và phát triển của nhiều loài sinh vật biển trong đó có hải quỳ Theo các ngiên cứu và thống kê cho thấy, vịnh Nha Trang là nơi san hô trong đó có các loài hải quỳ phát triển rất tốt, có diện tích khoảng 252 ha với độ bao phủ rất cao và tập trung phân bố ở các khu vực Hòn Mun (22 ha), Hòn Tằm (20 ha), Hòn Rơm (3,2 ha), Hòn Vung (4,6 ha), Hòn Cau (3,2 ha) (Nguyễn Đức Anh, 2014)

 Nguồn lợi sinh vật biển

Vịnh Nha Trang là một trong những khu vực có tầm quan trọng bậc nhất về bảo tồn biển và du lịch biển của Việt Nam Rạn san hô có tầm quan trọng mang tính quốc tế

và đa dạng sinh học cao nhất ở Việt Nam gồm hơn 222 loài giáp xác, trên 350 loài san

hô (chiếm 40 % san hô tạo rạn trên thế giới), 120 loài thân mềm, 70 loài giáp xác, 30 loài da gai, 70 loài rong biển và khoảng 7 loài cỏ biển,… (Nguyễn Đức Anh, 2014) Gần đây, do chịu sự tác động trực tiếp của biến đổi khí hậu ở Khánh Hòa đã bắt đầu xuất hiện một số dấu hiệu cảnh báo sự thay đổi như: nhiệt độ tăng cao đến 39,2 oC mực nước biển cũng có xu thế gia tăng, bước đầu xác định được những vùng nhạy cảm

có nguy cơ ảnh hưởng đến sinh vật biển do tác động của biến đổi khí hậu (Nguyễn Tác

An and Nguyễn Kỳ Phùng, 2014) Chính sự thay đổi này đã tác động trực tiếp đến hệ sinh thái, đặc biệt hệ sinh thái rừng ngập mặn, hệ sinh thái rạn san hô,… ở các khu vực ven biển, đầm phá, vịnh, đảo,… làm tăng nguy cơ tuyệt chủng hệ sinh vật dẫn đến giảm

độ đa dạng thành phần loài trong hệ sinh thái biển

1.2 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu (hải quỳ - sea anemones)

1.2.1 Phân loại và phân bố

Hải quỳ thuộc ngành ruột khoang (Cnidaria), lớp san hô (Anthozoa), thuộc phân lớp Hexacorallia và bộ Actiniaria (Carlgren, 1949), được xem là bộ có thành phần loài

phong phú nhất trong lớp san hô (Daly et al., 2008) Chúng có quan hệ gần gũi với sứa,

san hô, thủy tức (Mcfadden and Collins, 2007) Chúng thường sống chôn chân trong lớp trầm tích rạn san hô, ven biển và đầm phá thuộc vùng biển nhiệt đới Ấn Độ - Thái Bình Dương (trong vùng biển của khu vực Indonesia - Malaysia và trải dài về phía Đông Nam

Á, từ vùng đảo Ryukyu - Nhật Bản đến Tây Bắc Australia) (Allen, 1991; Fautin et al.,

2009)

Đến thời điểm hiện tại, bộ Actiniaria có 1.200 loài hải quỳ thuộc 46 họ, phân bố ở

nhiều độ sâu và vĩ độ khác nhau trên các rạn san hô (Rodríguez et al., 2014) Tuy nhiên các loài cá khoang cổ chỉ cộng sinh được với 10 loài hải quỳ là: Cryptodendrum

adhaesivum, Entacmae quadricolor, Macrodactyla doreensis, Stichodactyla haddoni, Stichodactyla gigantea, Stichodactyla mertensii, Heteractis crispa, Heteractis malu, Heteractis aurora, Heteractis magnifica thuộc 5 giống, 3 họ (Burke et al., 2016) Phần

lớn số hải quỳ khác sống đơn lẻ hoặc sống thành cụm

Ở Việt Nam, điều tra thực địa tại vùng biển Côn Đảo (Vũng Tàu), Bạch Long Vĩ (Hải Phòng) và Hòn Mun, Hòn Miễu, Hòn Rùa, Hòn Tre, Hòn Một, Hòn Tằm (Khánh

Hòa) (Hình 1.1) ghi nhận được 11 loài hải quỳ thuộc 5 giống (Entacma, Macrodactyla,

Stichodactyla, Heteractis, Cryptodendrum), 3 họ (Thalassianthidae, Actiniidae,

Stichodactylidae) Trong đó Khánh Hòa có độ đa dạng loài hải quỳ cao nhất với 11 loài

(E quadricolor, M doreensis, S haddoni, S gigantea, S mertensii, S tapetum, H

aurora, H crispa, H malu, H magnifica, C adhaesivum) (Đào Tấn Hổ et al., 2000;

Astakhov, 2002, 2012; Astakhov et al., 2008)

Hình 1.1 - Bản đồ các nơi có mặt hải quỳ ở vùng biển Khánh Hòa

(Nguồn: Đào Tấn Hổ et al., 2000)

1.2.2 Đặc điểm hình thái và sinh học

Hải quỳ là loài có cấu tạo đơn giản (Hình 1.2) Mỗi cá thể tồn tại đều nhờ phần

đĩa dưới bám chặt vào lớp đất, đá hoặc chôn sâu dưới lớp trầm tích – phần này được gọi

là chân bám hay đĩa bám (pedal disc) Phần trên là đĩa miệng (oral disc) với miệng (mouth) ở trung tâm và xúc tu (tetacles) phân bố xung quanh với nhiều hình dạng và màu sắc khác nhau, có thể ngắn - dài, thon - mập, đầu cùn - thuôn nhọn, hình chùy, bong bóng (Dunn, 1981) Mỗi cá thể có thể có vài chục đến vài trăm xúc tu xung quanh đĩa miệng Trên mỗi xúc tu có những tuyến độc (nematocysts) với độc tố khác nhau tùy vào từng loài (England, 1991) có nhiệm vụ phóng độc tố bắt mồi Thân (column) nối trực tiếp từ đĩa miệng xuống đĩa bám, ở giữa tạo một khoang trống được gọi là khoang tiêu hóa thức ăn Cơ thể hải quỳ có một lỗ hổng duy nhất ở trung tâm đĩa miệng vừa là miệng (mouth) cũng chính là hậu môn (Pantin and Pantin, 1943)

Hải quỳ là động vật bám đáy có khả năng di chuyển thấp, chúng thường dành phần lớn thời gian để chôn sâu chân mình dưới lớp cát, đá hoặc trong những khe hở của san

hô, chúng ít khi di chuyển trừ khi môi trường sống của chúng bị thay đổi hay có sự tấn

công của kẻ thù (Fautin et al., 2008)

(Nguồn: Pinterest.com) Hải quỳ có thể sinh sản hữu tính hoặc sinh sản vô tính Trong sinh sản hữu tính, con đực phóng tinh trùng kích thích trứng rụng và sự thụ tinh diễn ra ở miệng con cái, sau đó hợp tử phát triển thành ấu trùng và polyp bám đá theo thời gian sinh trưởng phát

triển thành cá thể hải quỳ đơn (Hình 1.3) Đối với sinh sản vô tính, một cá thể có thể tự

tách đĩa bám và phân chia cơ thể thành hai cá thể riêng biệt (Smith and Lenhoff, 1976; Jennison, 1981) Những nghiên cứu về sinh sản của hải quỳ chưa được phổ biến, chỉ tìm thấy được một số ít thông tin nói về tuyến sinh dục và sinh sản của một số loài (McMurrich, 1889; Duerden, 1898)

(Smith and Lenhoff, 1976; Jennison, 1981)

Hải quỳ là động vật ăn thịt Thức ăn của hải quỳ là động vật phù du hay những loài

cá có kích thước nhỏ sống ở rạn san hô Bên cạnh đó, hải quỳ sống cộng sinh bắt buộc

Hình 1.3 - Vòng đời của hải quỳ sinh sản bằng hình thức hữu tính

Hình 1.2 - Mô tả cấu trúc hải quỳ

với một số loài tảo (zooxanthellae) Tảo có nhiệm vụ quang hợp để cung cấp oxy và thức ăn cho hải quỳ dưới dạng glycerol, glucose và alanin Ngược lại tảo cũng được hải quỳ bảo vệ (Trench, 1971a, 1971b)

Ngoài việc cộng sinh bắt buộc với tảo, chúng còn là nhà, là nơi cư trú, ẩn náu của

một số loài cua, tôm (Mercier and Hamel, 2008; Goodwill et al., 2009; Fautin, 2016) và

đặc biệt là các loài cá khoang cổ (Fautin and Allen, 1992) Các loài cá khoang cổ cộng sinh với hải quỳ trước hết chúng phải bơi qua các xúc tu (tentacles) chứa độc tố mà không bị thương, ngược lại được sự bảo vệ từ hải quỳ Trong khi đó nếu chúng bơi sang các loài hải quỳ khác sẽ bị bắt và ăn thịt (Gudger, 1946; Mariscal, 1966) Do tuyến độc (nematocysts) ở mỗi loài hải quỳ khác nhau (England, 1991) và chất nhày (mucus) ở mỗi loài cá khác nhau nên khả năng chịu độc tố của các loài cá khoang cổ khi bơi qua xúc tu hải quỳ khác nhau (Dunn, 1981)

1.3 Tổng quan về hệ gen ty thể (mitochondrial DNA-mtDNA)

Hệ gen (genome) chứa toàn bộ thông tin di truyền và các hoạt động khác của cơ thể đặc trưng cho từng loài và từng cá thể trong loài Ở sinh vật nhân chuẩn (Eukaryote)

99 % genome nằm trong nhân tế bào (hệ gen nhân – nuclear DNA (cDNA)) và số ít còn lại nằm trong một số cơ quan như ty thể (Mitochondrial DNA – mtDNA) và lạp thể (Chloroplast DNA – ctDNA, chỉ có ở thực vật) (Chial and Craig, 2008)

Ty thể là một bào quan hình cầu được cấu tạo từ màng phospholypid khép, giữ nhiệm vụ tổng hợp và dự trữ năng lượng (ATP) cho tế bào thông qua quá trình phosphoryl hóa (Chial and Craig, 2008) DNA hệ gen ty thể hải quỳ có kích thước khoảng 17.443 bp, cấu trúc dạng vòng khép kín gồm 17 gen mã hóa đặc trưng cho 2

rRNA, 2 tRNA và 13 protein (Beagley et al., 1998) Các tRNA chủ yếu mã hóa cho các

protein tham gia vào việc vận chuyển điện từ và phosphoryl hóa oxy của ty thể (Chial and Craig, 2008)

Hình 1.4 - DNA ty thể người

(Nguồn: Ganfyd.org) (*) Vùng khoanh dấu đỏ là những đoạn gen sử dụng trong nghiên cứu hiện tại để định danh một số loài hải quỳ

Một tế bào chứa nhiều ty thể và mỗi ty thể chứa hàng chục bản sao bộ gen ty thể

Và hơn thế nữa, hệ gen ty thể có tỷ lệ đột biến cao (hơn gen nhân khoảng 100 lần) (Chial and Craig, 2008) Chính nhờ điều này làm tăng khả năng tách chiết DNA từ hệ gen ty thể Đồng thời, bộ gen ty thể chứa ít trình tự DNA không mã hóa (3 % gen không mã hóa là DNA của ty thể, trong khi đó phần còn lại hơn 97 % gen không mã hóa là DNA của hệ gen nhân) (Taylor and Turnbull, 2005) Các vùng mã hóa này sẽ làm cho quá trình giải trình tự trở nên phức tạp hơn, vì đôi khi cần phải tạo dòng để thu được sản

phẩm mong muốn (Tautz et al., 2003; Schander and Willassen, 2005)

Nhờ có kích thước nhỏ, số lượng bản sao lớn (Taylor and Turnbull, 2005), không tái tổ hợp (Krishnamurthy and Francis, 2012), di truyền theo dòng mẹ (Nagel and

Lougheed, 2006; Swartz et al., 2008), vùng mã hóa lớn, nên ty thể được xem là đối

tượng lý tưởng để khảo sát sự biến đổi trong hệ gen, phục vụ cho các nghiên cứu về giám định, phân loại và di truyền quần thể Ngoài ra, các gen ty thể có hệ số biến đổi nhanh hơn hệ gen nhân 10 -15 lần, nên rất thuận lợi cho việc nghiên cứu về tiến hóa (evolution) Các gen ty thể trong các loài có quan hệ gần về sinh học có sự bảo tồn rất cao; do vậy, bất cứ sự thay đổi nhỏ nào cũng là dấu hiệu trong giám định và phân loại loài Các chỉ thị phân tử của DNA ty thể thường được sử dụng là các gen mã hóa 12S rRNA, 16S rRNA, Cytochrome-b, Cytochrome oxydase, tRNA và một số vùng không

mã hóa như vùng liên gen (trnF-cox3, atp6-trnM, cox1-cox2, cox3-trnK, nad1-trnP)

(Boursot and Bonhomme, 1986; Delsuc et al., 2003; Hassanin et al., 2013) Đặc biệt

hơn, chúng cũng có ý nghĩa trong việc sắp xếp lại gen, định danh và nghiên cứu tiến hóa

một số loài thuộc ngành nhuyễn thể (Cnidaria) (Grande et al., 2008)

Tuy nhiên, việc sử dụng mtDNA cũng có một số giới hạn Kích thước của mtDNA nhỏ nên chỉ thể hiện một phần vật chất di truyền Tỷ lệ đột biến ở mtDNA cao hơn DNA nhân (Chial and Craig, 2008) trong khi đó hệ gen mtDNA có kích thước nhỏ (Taylor and Turnbull, 2005) nên đột biến dễ dàng xảy ra mà không phản ánh được mối quan hệ phát sinh loài hay lịch sử tiến hóa Ngoài ra, hệ gen mtDNA phát triển chậm hơn nhiều

so với DNA gen nhân ở hầu hết các loài thuộc ngành ruột khoang (Cnidiria) (Hebert et

al., 2004) Vì vậy nên sử dụng kết hợp các chỉ thị phân tử khác nhau để có kết quả với

độ chính xác cao hơn (Hebert et al., 2004) Trong những nghiên cứu tiến hóa và định

danh loài gần đây, một số chỉ thị phân tử của DNA nhân được sử dụng như là 5,8S

rRNA, 28S rRNA, 18S rRNA,… (Schander and Willassen, 2005; Daly et al., 2008)

1.4 Tình hình nghiên cứu phân loại hải quỳ trên thế giới và Việt Nam

1.4.1 Trên thế giới

Hải quỳ là một trong những động vật biển có chứa độc tố, chúng được biết đến

như là nhà, là nơi cư trú, ẩn náu của các loài cá khoang cổ (Burke et al., 2016) Đến năm

1949, những nghiên cứu đầu tiên về phân loại học và hình thái mới được công bố Tuy nhiên, những nghiên cứu chỉ dừng lại ở việc phân loại các giống trong cùng một họ

Những năm sau đó lần lượt (Dunn, 1981; Daly, 2004; Fautin et al., 2008; Fautin et al., 2009; Fautin et al., 2015) dựa vào những đặc điểm hình thái (thân, xúc tu, đĩa miệng,

đĩa bám) và giải phẫu mô học (phân tích mạc treo ruột – mesentery) đã định danh được

cụ thể từng loài hải quỳ thuộc cùng giống ở nhiều vùng biển khác nhau Việc định danh hình thái rất dễ nhầm lẫn, đặc biệt đối với hải quỳ là những loài động vật không có hình dáng cố định Do đó, để việc định danh hải quỳ có ý nghĩa, những nghiên cứu về di

truyền được thực hiện bởi (Chen and Yu, 2000; Daly et al., 2008; Rodríguez et al., 2012; Rodríguez et al., 2014)

 Phân loại hải quỳ dựa vào đặc điểm hình thái

Carlgren (1949) nghiên cứu thành phần loài hải quỳ tại vịnh Moreton phía đông Australia dựa vào đặc điểm hình thái (thân, xúc tu, đĩa miệng, đĩa bám) và phân tích mô học (mesentery – mạc treo ruột) Nghiên cứu đã xây dựng được khóa phân loại của 3 bộ

(Ptychodactiaria, Corallimorpharia và Actiniaria) thuộc lớp san hô (Anthozooa) và ngành ruột khoang (Cnidaria) Tuy nhiên khóa định loại của ông chỉ dừng lại ở việc định danh các giống trong cùng họ, chưa rõ ràng cụ thể đối với các loài trong cùng một giống Dunn (1981) dựa trên phân tích mô học (mesentery – mạc treo ruột) và đặc điểm hình thái đã xây dựng khóa phân loại mô tả cụ thể chi tiết 12 loài hải quỳ thuộc 3 họ và

5 giống (C adhaesivum, E quadricolor, M doreensis, H crispa, H malu, H aurora,

H magnifica, S tapetum, S gigantea, S haddoni, S mertensii, S helianthus) cộng sinh

với 25 loài cá khoang cổ

Daly (2004) tiến hành phân loại 3 loài hải quỳ Anthopleura dowii, Bunodactis

mexicana và Bunodosoma californica có hình thái bên ngoài giống nhau tại vịnh

California dựa vào sự có hay vắng mặt của các hạt mụn (verrucae) trên thân và phân tích giải phẫu học hình thái

Fautin et al (2008) phân loại được 19 loài hải quỳ thuộc 14 giống, 6 họ ở vịnh

Moreton phía Đông Australia dựa trên phân tích mô học và các đặc điểm bên ngoài như màu sắc, hình thái, sự hiện diện hay vắng mặt các hạt mụn (verrucae) trên thân, sự sắp xếp của các xúc tu trên đĩa miệng và sự có hay không các hoa văn trên đĩa miệng

Fautin et al (2009) dựa vào đặc điểm hình thái (xúc tu, thân, đĩa miệng, đĩa bám) định danh được 16 loài hải quỳ thuộc 16 giống, 7 họ tại Sigapore Fautin et al (2015) tiếp tục nghiên cứu tại Sigapore và ghi nhận thêm được 6 loài thuộc 6 giống, 3 họ

 Phân loại hải quỳ dựa vào đặc điểm di truyền

Daly et al (2008) nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài của 50 loài hải quỳ thuộc

45 giống, 23 họ ở Mỹ, sử dụng gen 16S rRNA và 12S rRNA thuộc DNA ty thể, 28S rRNA và 18S rRNA của DNA nhân Kết quả chỉ ra rằng sự tiến hóa phân tử trong DNA

ty thể hải quỳ phát triển chậm bất thường, tuy nhiên gen 12S hỗ trợ xác định các mối quan hệ trong hải quỳ tốt hơn gen 16S và dữ liệu từ cả hai gen 18S và 28S hỗ trợ rất tốt cho việc nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài trong hải quỳ

Wilmer et al (2008) sử dụng đoạn gen ribosome (ITS1 – 5,8S – ITS2) khuếch đại

một phần của đoạn gen 18S, 28S và vùng liên gen ITS1 – 5,8S – ITS2 Đoạn mồi này

khuếch đại thành công 6 loài hải quỳ đại diện từ vịnh Moreton: Anemonea, sp.,

Heteractis malu, Stichodactyla haddoni, Entacmaea quadricolor, Macrodactyla doreensis, Oulactis muscosa Đồng thời, nghiên cứu ghi nhận sự khác biệt trung bình

giữa các loài là 23,84 %, qua đó cho thấy đoạn gen này thích hợp cho việc định danh và phân tích mối quan hệ tiến hóa giữa các loài hải quỳ

Rodríguez et al (2012) ứng dụng 3 gen ty thể (COIII, 12S rRNA, 16S rRNA) và 2

gen nhân (18S rRNA, 28S rRNA) để xây dựng mối quan hệ phát sinh loài của 85 loài hải quỳ thuộc 12 họ Kết quả phân tích phát sinh loài dựa vào chỉ thị phân tử này trùng hợp với nhiều giả thuyết về mối quan hệ và phân loại trước đây, tuy nhiên việc so sánh các loài trong cùng giống không mang lại kết quả chính xác cao

1.4.2 Việt Nam

Không giống như các loài động vật biển có giá trị kinh tế khác, mãi đến năm 2000 mới xuất hiện những nghiên cứu cơ bản đầu tiên về hải quỳ do Đào Tấn Hổ và ctv tại các đảo nhỏ ở Khánh Hòa Sau đó, qua những lần nghiên cứu cộng sinh ngoài thực địa

(Astakhov, 2002, 2012; Astakhov et al., 2008) ghi nhận được sự có mặt của hải quỳ ở

Côn Đảo (Vũng Tàu) và đảo Bạch Long Vĩ (Hải Phòng) Đến năm 2015, nghiên cứu di truyền về hải quỳ đầu tiên ở Việt Nam do Lương Thị Tường Vi (2015) thực hiện

 Phân loại dựa vào đặc điểm hình thái

Đào Tấn Hổ et al (2000) quan sát thực địa và thu mẫu tại Hòn Tầm, Hòn Rùa,

Hòn Miễu, Hòn Mun, Hòn Một và Hòn Tre thuộc tỉnh Khánh Hòa đã định danh được 8 loài hải quỳ thuộc 3 giống, 2 họ Đồng thời nghiên cứu đã xây dựng được khóa định loại

cơ bản cho 8 loài hải quỳ thu được tại Khánh Hòa

Astakhov (2002) nghiên cứu mối quan hệ cộng sinh giữa cá khoang cổ và hải quỳ ngoài thực địa tại vùng biển Khánh Hòa Nghiên cứu ghi nhận được 9 loài hải quỳ cộng

sinh với 5 loài cá khoang cổ (phát hiện thêm Cryptodendrum adhaesivum và

Macrodactyla doreensis nhưng ông không tìm thấy loài Stichodactyla gigantea so với

nghiên cứu của Đào Tấn Hổ và ctv (2000))

Astakhov et al (2008), cùng cộng sự nghiên cứu cộng sinh của cá khoang cổ và hải quỳ tại Côn Đảo tìm thấy được 4 cá thể hải quỳ (E quadricolor, H magnifica, S

gigantea, S haddoni)

Astakhov (2012), tiếp tục nghiên cứu tại đảo Bạch Long Vĩ (Hải Phòng) chỉ thấy

một cá thể hải quỳ Entacmea quadricolor

 Phân loại dựa vào đặc điểm di truyền

Lương Thị Tường Vi (2015), mô tả đặc điểm hình thái của 5 loài hải quỳ (S

tapetum, S haddoni, E quadricolor, M doreensis, H aurora) và sử dụng cặp mồi 18S

seaanemone – 28S seaanemone khuếch đại một phần đoạn gen ITS1 – 5,8S – ITS2

rDNA để phân tích dữ liệu di truyền của 2 loài hải quỳ (M doreensis và S tapetum)

Sản phẩm khuếch đại thu được có chiều dài khoảng 800 bp Tác giả ghi nhận cây phát sinh loài dựa trên trình tự gen ITS1 – 5,8S – ITS2 thiếu phân tách về mặt di truyền nhưng vẫn cho thấy mối quan hệ gần gũi giữa các loài hải quỳ

Ngoài những nghiên cứu trên thì chưa có công bố nào đáng kể về định danh hình thái và di truyền của hải quỳ ở Việt Nam

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Hải quỳ tiếp tục được thu mua tại các tiệm bán cá cảnh ở tỉnh Khánh Hòa từ tháng 8/2015 đến 4/2017 (ctv Lương Thị Tường Vy đã thu và phân loại hải quỳ đợt I từ tháng 11/2014 đến tháng 4/2015) Mẫu được chụp hình, phân loại sơ bộ ngay tại địa điểm thu mẫu Sau khi được vận chuyển về phòng thí nghiệm tiếp tục nuôi thích nghi để có được trạng thái khỏe mạnh và bung to nhất, hải quỳ được tiếp tục phân loại ngay trong bể nuôi

30 mg mô cơ hải quỳ (xúc tu, rìa đĩa miệng hoặc chân bám) được cắt, sau đó cố định trong cồn 96o và bảo quản ở -20 oCđể phục vụ cho các nghiên cứu di truyền tiếp theo Thay cồn cho các mẫu trong 3 ngày liên tiếp để loại bỏ tạp chất và sắc tố để bảo quản DNA được lâu hơn

2.2 Sơ đồ khối nghiên cứu

Sơ đồ 2.1 - Sơ đồ nghiên cứu đa dạng hải quỳ tại Khánh Hòa

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu hình thái

Phương pháp phân loại hình thái dựa theo mô tả (Allen, 1972; Dunn, 1981; Fautin

and Allen, 1992; Fautin et al., 2008)

 Các chỉ tiêu phân loại

- Đĩa miệng: quan sát hình dáng đĩa miệng (trải dài trên mặt phẳng hay uốn lượn nhấp nhô), màu sắc đĩa miệng, có hoa văn hay không

- Xúc tu: hình dáng xúc tu (thuôn dài ở đầu hay tù, mỏng hay dày, ngắn hay dài); màu sắc thân xúc tu và đầu tận cùng (tip) của xúc tu và sự hiện diện của các hạt mụn (verrucae) trên xúc tu

- Thân: quan sát màu sắc và sự thay đổi màu sắc ở phần thân trên (upper column) với thân dưới (lower column), quan sát sự bố trí và màu sắc của các hạt mụn (verrucae) trên thân (có hạt hay không hạt)

- Đĩa bám: hải quỳ có chôn chân sâu vào lớp trầm tích không, có cùng màu với thân không, có các đốm khác màu hay không

 Các chỉ tiêu đo về hình thái

Mẫu hải quỳ sau khi thu về nuôi trong bể phòng thí nghiệm để các loài hải quỳ khỏe và kích thước bung to nhất Sau đó tiến hành chụp hình, dùng thước đo có độ chính xác 1 mm để đo các chỉ tiêu hình thái bên ngoài

Đo mẫu hải quỳ theo các chỉ tiêu Hình 2.1

- Đường kính đĩa miệng (mm)

2.3.2 Xây dựng khóa phân loại hải quỳ

Dựa trên các đặc điểm hình thái đặc trưng của các loài hải quỳ đã định danh, khóa định loại hải quỳ tại Khánh Hòa được xây dựng sơ bộ nhằm so sánh, kết nối các đặc điểm đặc trưng giữa các loài trong cùng một chi, giữa các chi trong cùng một họ Khung

tham chiếu được sử dụng là khóa phân loại của Carlgren, Fautin et al., (Carlgren, 1949; Dunn, 1981; Fautin et al., 2008)

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu di truyền

 Tách chiết DNA tổng số

30 mg cơ hải quỳ sau khi được thay cồn 3 lần được cắt nhỏ trong Eppendoft 1,5

ml DNA tổng số được tách chiết bằng bộ Kit Qiagen (Qiagen DNA mini Kit của Đức)

theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Phụ lục 1) DNA sau đó được tinh sạch qua 3 bước

rửa giải (Eluta 3 lần), theo đó đệm AE được thêm vào 3 lần và thời gian ủ tăng lần lượt

từ 5 phút, 10 phút và 15 phút cho mỗi lần rửa giải) Nghiên cứu sử dụng DNA rửa giải lần 3 để khuếch đại gen mục tiêu (PCR) Bảo quản mẫu DNA tinh sạch ở -40 oC

 Khuếch đại gen mục tiêu (PCR reaction)

10 µL dung dịch tách chiết DNA tổng số được dùng cho phản ứng PCR Nghiên cứu sử dụng 2 cặp mồi khuếch đại 2 đoạn gen ty thể của hải quỳ là COI và 16S rRNA

Trình tự 2 đoạn mồi được thể hiện ở (Bảng 2.1)

Bảng 2.1 - Trình tự 2 đoạn mồi nghiên cứu sử dụng khuếch đại 2 đoạn gen hải quỳ

Gen Trình tự mồi xuôi Trình tự mồi ngược

Sản phẩm khuếch đại

Tài liệu tham khảo

~ 450

bp Nghiên cứu hiện tại

Trong nghiên cứu hiện tại, sử dụng 2 cặp mồi của gen ty thể là: COI và 16S rRNA được thiết kế dựa trên một số trình tự có sẵn trên Genbank của 4 giống hải quỳ nghiên cứu thuộc 2 họ Actiniidae và Stichodactyla Trình tự bắt cặp của mồi thiết kế được trình

bày trong phần Phụ lục 2, Phụ lục 3

Đặc điểm của cặp mồi 16S rRNA và COI được thể hiện ở Bảng 2.2

Bảng 2.2 – Đặc điểm của 2 cặp mồi nghiên cứu sử dụng

COI_ANE_R: 22 bp

16S_ANE_F: 20 bp 16S_ANE_R: 22 bp

Nhiệt độ nóng chảy COI_F: 61,3

oC COI_R: 57,4 oC

16S_F: 64 oC 16S_R: 64 oC

Thành phần phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích 50 µl, thành phần

được mô tả trong (Bảng 2.3) Phản ứng được chạy trên máy luân nhiệt Icycler

(Bio-rad) theo chương trình nhiệt độ như sau:

Biến tính ban đầu ở trong 3 phút; sau đó là 35 chu kỳ của 94 oC trong 30 giây, nhiệt độ lai tại 48 oC (đối với gen COI mt DNA) và 55 oC (đối với gen 16S rRNA) trong 45 giây và kéo dài ở 72 oC trong 5 phút; bước kéo dài cuối cùng ở 72 oC trong 5

 Điện di kiểm tra kết quả

Sản phẩm được điện di trên gel agarose 1,5 % nhuộm Ethidium bromide để kiểm tra kết quả

o Cách chuẩn bị gel Agarose 1,5 %:

- Chuẩn bị buồng đổ gel, lắp khuôn gel, gắn lược (8, 10 hoặc 15 giếng)

- Cân 0,6 g Agarose với 40 ml đệm TBE (1X) cho vào bình tam giác 100 ml

- Đun sôi hỗn hợp trong lò vi sóng cho đến khi gel tan hoàn toàn (đun khoảng 2-2,5 phút)

- Cho thêm nước để bù lượng nước bay hơi trong quá trình đun

- Chuyển dung dịch sang bình có sẵn trong buồng đổ gel, thêm 2 µl Ethidium bromide vào dung dịch

- Lắc đều đổ dung dịch vào khuôn gel đã chuẩn bị lúc đầu (tránh tạo bọt khí)

- Đợi gel nguội (khoảng 30-40 phút), rút lược ra khỏi bản gel (lưu ý rút nhẹ, rút thẳng tránh làm gãy bản gel và rách các giếng gel)

o Chạy điện di

Cho gel đã chuẩn bị vào bể điện di và thêm đệm TBE 1X vào bể sao cho ngập gel Load mẫu vào giếng theo tỉ lệ 5:1 tương ứng là 5 µl mẫu DNA, 1 µl Loading dye 6X mix đều và load vào giếng của bản gel Hút 3 µl DNA ladder (thang maker DNA) cho vào giếng sau đó chạy điện di với nguồn điện 90V, 400mA trong 40 phút

o Đọc kết quả

Hình 2.2 - Chu trình nhiệt của phản ứng PCR đối với đoạn gen COI mt DNA và 16S rRNA

Bản gel điện di được soi trên thiết bị UV Transilluminator Sản phẩm của quá trình khuếch đại đối với hải quỳ là các băng DNA có kích thước ~ 480 bp đối với gen COI mtDNA và ~ 450 bp đối với gen 16S rRNA

 Giải trình tự

Sản phẩm PCR được gửi đến công ty TNHH Nam Khoa – thành phố Hồ Chí Minh giải trình tự Phản ứng giải trình tự được tiến hành theo nguyên tắc Dey – labelles dideoxy terminator với các đoạn mồi tương tự như phản ứng PCR theo chương trình luân nhiệt sau:

96 oC trong 20 giây, 50 oC trong 20 giây, cuối cùng là 60 oC trong 4 phút Sản phẩm sau đó được phân tích bằng thiết bị ABI Prism 3.700 DNA Analyser (Applied Biosystems)

2.3.4 Phân tích dữ liệu và xây dựng cây phát sinh chủng loại

 Xử lý, kết nối trình tự và phân tích dữ liệu

 Xây dựng mối quan hệ phát sinh chủng loại

Phân tích di truyền được tiến hành với 2 trình tự gen DNA ty thể: COI và 16S rRNA của 8 loài hải quỳ nghiên cứu và 7 loài hải quỳ trên ngân hàng Genbank

Metridium senile được sử dụng làm nhóm ngoại, thông tin loài, khu vực nghiên cứu,

nguồn tham khảo và mã số Genbank được trình bày ở (Bảng 3.2)

Cây phát sinh loài được xây dựng dựa trên 3 thuật toán Maximum likelihood (ML), Neighbor joinig (NJ), Maximum parsimony (MP) của 2 phần mềm lần lượt là MEGA version 7.0.26 (Kumar, Stecher and Tamura, 2016), R-studio version 1.0.143 (Robert & Ross, 1993) Giá trị Bootstrap (độ tin cậy – BT) được lựa chọn là 1000 lần

Đối với thuật toán Maximum likelihood (ML), các mô hình tiến hóa được kiểm tra bằng Modeltest trong R-studio 1.0.143 (Robert and Ross, 1993) trước khi xây dựng cây tiến hóa Đối với cây phát sinh loài dựa vào gen COI mô hình tối ưu là GTR dựa trên 24

mô hình tiến hóa với tần suất các base nitơ là A = 0.2293484; C = 0.2074775; G = 0.2183775; T = 0.3447966, tỷ lệ các vị trí không biến đổi là 0.5793593 và thông số dạng phân bố Gamma là 0,6835359 Đối với cây phát sinh loài dựa vào gen 16S rRNA

mô hình tối ưu là GTR dựa trên 24 mô hình tiến hóa với tần suất các base nitơ là A = 0.3016815; C = 0.1729838; G = 0.249878; T = 0.2754567, tỷ lệ các vị trí không biến đổi là 0.7428103 và thông số dạng phân bố Gamma là 0.7363355

Đối với thuật toán Maximum parsimony (MP), phân tích mô hình thay thế được xây dựng bằng phần mềm MEGA 7.0.26 với mô hình tối ưu là SPR (Subtree – Purning – Regrafting) dựa trên mức tiến hóa chậm của các nucleotide bằng cách trao đổi các nhánh sao cho cây tiến hóa được hình thành

Đối với thuật toán Neighbor Joining (NJ), phân tích mô hình thay thế được xây dựng bằng phần mềm MEGA 7.0.26 với mô hình tối ưu là TN93 dựa trên khoảng cách

di truyền của các nucleotide để phù hợp với các nhánh sao cho cây tiến hóa được hình thành (Gascuel and Steel, 2006)

Các tính toán về mô hình thay thế của các thuật toán được chạy lặp lại 2 lần, riêng đối với mô hình thuật toán Maximum parsimony (MP) được lặp lại 4 lần để tăng độ chính xác của phương pháp phân tích Giá trị bootstrap được tính toán để xác định tính chính xác của thuật toán MP, ML, NJ với độ lặp lại 1000 lần

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thành phần loài hải quỳ tại Khánh Hòa dựa vào các đặc điểm hình thái

3.1.1 Thành phần các loài hải quỳ thu được tại Khánh Hòa

Qua nhiều đợt thu mẫu liên tục và phân loại hình thái nghiên cứu cho thấy tại Khánh Hòa có sự hiện diện của 9 loài hải quỳ thuộc 4 giống và 2 họ Số lượng cá thể

thu được của mỗi loài được thể hiện trong (Bảng 3.1) và các chỉ tiêu phân loại được thể hiện ở Phụ lục 6

Bảng 3.1 - Thành phần loài thu được tại Khánh Hòa

Phần trăm 14 % 10 % 0,6 % 20 % 0,6 % 20 % 5 % 12 % 17 %

Chú thích: A- S gigantea, B - S haddoni, C - S mertensii, D - S tapetum, E - H

aurora, F - H crispa, G - H malu, H – E quadricolor, I - M doreensis

Bảng 3.2 - Danh sách một số loài hải quỳ nhóm nghiên cứu thu được tại Khánh Hòa

Tên thường gọi

Actiniaria

Actiniidae (Rafinesque, 1815)

Entacmaea

(Ehrenberg, 1834)

Entacmaea quadricolor

(Leuckart in Rüppell &

Leuckart, 1828)

Hải quỳ bong bóng, hải quỳ

vú

Macrodactyla

(Haddon, 1898)

Macrodactyla doreesis

(Quoy and Gaimard, 1833)

Hải quỳ chân đỏ

Stichodactylidae (Andres, 1883)

Stichodactyla

(Brandt, 1835)

Stichodactyla haddoni

(Saville-Kent, 1893)

Hải quỳ thảm

Stichodactyla gigantea

(Forskål, 1775)

Hải quỳ thảm khổng

lồ

Stichodactyla mertensii

(Brandt, 1835)

Hải quỳ thảm Mertens

Stichodactyla tapetum

(Hemprich and Ehrenberg, 1834)

Hải quỳ thảm đá nhỏ Heteractis

(Milne – Edwards and Haime, 1851)

Heteractis aurora

(Quoy and Gaimard, 1833)

Hải quỳ cúc

3.1.2 Đặc điểm hình thái một số loài hải quỳ tại Khánh Hòa

Ctv trước đó (Lương Thị Tường Vi, 2015), đã mô tả hình thái của 6 loài (E

quadricolor, M doreensis, S.haddoni, S tapetum, H aurora, C adhaesivum) trên tổng

số 11 loài tại Khánh Hòa Nghiên cứu tiếp tục kế thừa và bổ sung thêm 4 loài là: H

malu, H crispa, S mertensii, S gigantea, đồng thời định danh lại loài S tapetum

Họ (Family): Stichodactylidae (Andres, 1883)

Thân: Thân dưới trơn mịn, hầu hết ở các loài thuộc họ này xuất hiện những hạt mụn (verrucae) ở phần thân trên

Đĩa miệng: Tròn (đôi khi có hình oval); bằng phẳng đến nhấp nhô uốn lượn Xúc

tu bao phủ trên đĩa miệng từ thưa thớt đến dày đặc

Xúc tu: Đơn, hình cầu, hình ngón, hình chùy hoặc uốn lượn; hầu hết các xúc tu giống nhau ở từng loài, riêng có một số loài đặc biệt xúc tu ngoài trông cứng cáp khỏe mạnh hơn xúc tu trong, những xúc tu này nằm gần rìa và trên mỗi exocoel chứa một xúc

tu Và có nhiều hơn một xúc tu giống nhau trên mỗi endocoel, chúng xếp thành từng mảng dọc theo mỗi endocoel, mỗi một mảng có thể có 1 xúc tu, 2 xúc tu hoặc 1 cụm xúc tu (2-6 xúc tu) Đĩa bám: Cùng màu với thân dưới, có hoặc không có những đốm màu, bám chặt dưới nền đất hoặc chôn chân dưới hốc đá

3.1.2.1 Giống (Genus): Heteractis (Milne – Edwards and Haime, 1851)

Thân: Thân dưới mịn trơn và thân trên với những hạt mụn (verrucae) nổi trên da không dễ nhìn thấy hoặc chìm dưới da

Đĩa miệng: Bằng phẳng hoặc lượn sóng nhẹ tùy thuộc vào từng loài và tình trạng bung nở của chúng, có khả năng co rút mạnh Có thể nhìn thấy miệng nhờ lớp xúc tu phủ thưa thớt trên bề mặt đĩa miệng

Xúc tu: Hình ngón tương đối dài có thể uốn lượn quanh bề mặt đĩa miệng, duy

nhất chỉ có loài H aurora xuất hiện những nốt phồng xung quanh xúc tu

Đĩa bám: Cùng màu với thân dưới, chôn chân sâu dưới hốc đá

 Heteractis crispa (Hemprich and Ehrenberg, 1834)

Tên tiếng anh: Sebae anemone, leathery sea anemone, long tentacle anemone, purple tip anemone

Tên tiếng việt: Hải quỳ da

Phân loại khoa học theo:

Bộ: Actiniaria

Họ: Stichdactylidae

Giống: Heteractis (Milne Edwards and Haime, 1851)

Loài: Heteractis crispa (Hemprich and Ehrenberg, 1834) (Phụ lục 7 4)

 Đặc điểm hình thái

Heteractis crispa có đĩa miệng trung bình khoảng 105-230 mm, cùng màu với xúc

tu thường có màu xám, kem, nâu đen, nâu đỏ và xanh lá cây Được phủ bởi 2 loại xúc

tu (ngắn, dày và đầu tròn có chiều dài 5-10 mm hoặc các xúc tu thuôn dài 20-25 mm)

tùy từng cá thể Đặc biệt là loài có thân dày trông như miếng da thuộc (đây là đặc

điểm có thể dùng để phân biệt loài), chiều cao trung bình nghiên cứu thu được khoảng

23-64 mm Phần thân dưới trơn có màu trắng đến kem, phần thân trên to bung ra có màu xám đến nâu tím, nâu đỏ với các hạt mụn (verrucae) cùng màu nổi cộm trên da có hình tròn Đĩa bám cùng màu với thân và bám chặt dưới lớp đá san hô

Hình 3.1 - Đặc điểm hình thái hải quỳ Heteractis crispa

(1 – thân hải quỳ nhìn ngang, 2 – đĩa miệng hải quỳ khi nhìn từ trên xuống, 3 –Thân trên với các hạt mụn (verrucae) tròn cùng màu; 4 – Thân dưới trơn màu cam nhạt với đĩa bám; 5 – các xúc tu ngắn màu nâu nhạt; 6 – các xúc tu dài màu kem)

 Nhận xét

Theo Dunn, (1981) loài H crispa có đĩa bám tròn, bằng phẳng rộng lên đến

200-500 mm, với những xúc tu dài 15-20 mm, có màu xám, nâu tím hoặc xanh Phần thân trên với những hạt mụn (verrucae) sắp xếp trât tự theo hàng từ 10-12 hạt mỗi hàng Loài

H crispa tại Khánh Hòa có thể có xúc tu ngắn hơn, nhiều màu sắc hơn, các hạt mụn

(verrucae) sắp xếp không thẳng hàng Tuy nhiên vẫn có thân dày trông như miếng da

thuộc là đặc điểm chỉ có ở loài H crispa theo như mô tả của (Dunn, 1981)

Loài H crispa có thể bị nhầm lẫn với M doreensis, H aurora, H malu Tuy nhiên

có thể nhìn các hạt mụn (verrucae) hình tròn ở loài H crispa và hình mắt ở loài M

doreensis để phân biệt chúng; hoặc những nốt phồng ở xúc tu của loài H aurora mà H crispa không có; hay ở loài H malu các xúc tu trong với xúc tu ngoài có hai màu sắc

khác biệt nhau

 Heteractis malu (Haddon and Shackleton, 1893)

Tên tiếng anh: Malu anemone, white sand anemone Tên tiếng việt: Hải quỳ cát trắng

Phân loại khoa học theo:

Bộ: Actiniaria Họ: Stichodactylidae

a

c