Góp phần nghiên cứu tác dụng sinh học của mật gấu và sơ bộ phân biệt với một số mật khác

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC D ư ợ c HÀ NỘI TRẦN THỊ DIỆU OANH GÓP PHẦN NGHIÊN c ứ u TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MẬT • GẤU VÀ Sơ BỘ• PHÂN BIỆT • VỚI MỘT SỐ MẬT KHÁC (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP D ư ợ c s ĩ KHOÁ 1998 - 2003) - Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Văn Đồng - Nơi thực hiện: Bộ môn Hoá Sinh - Thời gian thực hiện: tháng 3 - 5 / 2003 U i Em xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Văn Đồng, người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em thực hiện khoá luận thành công. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô tại Bộ môn Hóa Sinh, thư viện, các cán bộ nhân viên khoa Trữ máu Bệnh viện Việt Đức đã tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành khoá luận này. Trần Thị Điệu Oanh C Á C CHỮ VIẾT TẮT [oc ]20d Độ quay cực đo ở 20°c, với tia D của natri AB Acid béo ADP Adenosyl diphosphat AMP Adenosyl monophosphat CDCA Chenodesoxycholic DG Diglycerid HMWK High molecular weigh kininogen (kininogen phân tử lượng cao) MG Monoglycerid PAI-1, PAI-2 Plasminogen activated inhibitor - 1 , 2 (yếu tố ức chế hoạt hóa plasminogen -1,-2) PIVKA Protein induced by vitamin K angotanists QTĐM Quá trình đông máu SKLM Sắc ký lớp mỏng TG Triglycerid t°c Nhiệt độ nóng chảy t-PA Tissue plasminogen activator (yếu tố hoạt hoá plasminogen tổ chức) UCDA Ursodesoxycholic acid VLDL Very low density lipoprotein (lipoprotein tỉ trọng rất thấp) Yt Yếu tô MỤC LỤC ■ ■ Trang Đặt vấn đề 1 Tổng quan 2 1.1 Đại cương về mật gấu 2 1.1.1 Đặc điểm, thành phần hoá học 2 1.1.2 Công dụng, cách dùng 3 1.1.3 Cách lấy và chế biến 4 1.1.4 Thử mật gấu 4 1.2 Vai trò của mật trong quá trình chuyển hóa lipid 5 1.3 Tác dụng của mật gấu tới quá trình đông máuvà tiêu Phần 1 6 fibrin 1.3.1 Quá trình đông máu 6 1.3.2 Quá trình tiêu fibrin 8 1.3.3 Một số thuốc chống đông máu và tiêu fibrin 9 1.4 Sắc ký lớp mỏng 11 1.4.1 Nguyên tắc của SKLM 11 1.4.2 Kỹ thuật SKLM 12 1.4.3 Ưu điểm của SKLM 13 Thực nghiệm và kết quả 14 2.1 Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu 14 2.1.1 Nguyên vật liệu 14 2.1.2 Phương pháp nghiên cứu 15 2.1.3 Phương pháp xử lý số liệu 19 2.2 Kết quả nghiên cứu và nhận xét 20 2.2.1 Sơ bộ phân tách thành phầncủa mật gấu và so sánh Phần 2 với các mật khác bằng phương pháp SKLM 20 2.2.2 Tác dụng của mật gấu trên thời gian phục hồi calci 24 2.2.3 Tác dụng của mật gấu trên thời gian tiêu fibrin 27 2.2.4 Tác dụng của mật gấu trên chuyển hoá lipid 28 2.3 Nhận xét tổng quát và bàn luận 30 Phần 3 Kết luận và đề xuất 31 Tài liệu tham khảo 32 ĐẶT VẤN ĐỂ ■ Mật gấu còn gọi là hùng đởm, tên khoa học là Fel Ursi, là túi mật phơi hay sấy khô lấy từ nhiều loài gấu Ursus sp., họ Gấu Ursidae. Từ lâu mật gấu đã được coi là một vị thuốc quý trong nhân dân. Theo y học cổ truyền, mật gấu có vị đắng, tính mát, quy vào ba kinh can, tâm, vị, có tác dụng thanh nhiệt sát trùng, hoạt huyết giảm đau, được dùng trong các trường hợp mắt đỏ có màng, thấp nhiệt da vàng, huyết ứ sưng đau, đặc biệt khi có chấn thương tụ máu, sốt cao co giật, sợ hãi co quắp... được pha với nước để uống, nhỏ mắt, hoặc pha trong cồn để xoa bóp, dùng riêng hoặc dùng chung với các vị thuốc khác [1, 2, 15]. Hiện nay, mật gấu được dùng khá phổ biến, cả ở dạng mật tươi, với nhiều công dụng khác như chữa đau dạ dày, giúp tiêu hoá, điều trị cao huyết áp, rượu thuốc bổ, thậm chí điều trị ung thư...Người ta coi mật gấu như vị thuốc vạn năng nên có thời điểm tạo ra cơn sốt mật gấu. Tuy nhiên, việc sử dụng mật gấu vẫn chỉ theo kinh nghiệm dân gian hoặc theo lời đồn đại mà chưa có sự kiểm chứng. Các tài liệu nghiên cứu về tác dụng của mật gấu không nhiều và còn sơ sài. Trên thị trường có nhiều dạng mật gấu khác nhau: loại phơi sấy khô, dịch mật tươi, rượu mật gấu... chưa có tiêu chuẩn để đánh giá chất lượng và phân biệt mật gấu thật hay giả. Từ thực tế đó chúng tôi tiến hành thực hiện khóa luận tốt nghiệp “Góp phần nghiên cứu tác dụng sinh học của mật gấu và sơ bộ phân biệt với một sô' mật khác” với mục tiêu là: - Góp phần tìm hiểu về tác dụng chống đông máu và tác dụng trên quá trình thủy phân triglycerid của mật gấu. - Sơ bộ phân tách thành phần của mật gấu và phân biệt với một số mật khác bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng. 1 PHẨN 1 TONG QUAN 1.1. ĐẠI CƯƠNG VỂ MẬT GÂU 1.1.1 Đặc điểm và thành phần hóa học [2,15] a. Đặc điểm: Tại Việt Nam, mật gấu được lấy từ một số loài gấu: gấu ngựa Selenarctos thibetanus G. Cuvier có khoang trắng hình chữ V ở ngực, gấu chó Ursus aretoslisiotus Gray., gấu đen, gấu xám. Mật gấu còn nguyên thường là những túi được ép bẹp, có cuống dài, chiều rộng có thể tới 5 - 6 cm, chiều dài 1 4 -1 5 cm, chiều dày 1 - 4 mm. Bên trong có chất đen nhánh, giữa đám đen có những hạt lổn nhổn màu vàng óng ánh như hổ phách. Nếm có vị đắng, sau ngọt, dính lưỡi. Ngửi có khi có mùi khói. Đốt không cháy. Mật gấu được dùng ở Triều Tiên, Trung Quốc, Việt Nam...Tại Triều Tiên quy định tiêu chuẩn mật gấu: độ ẩm dưới 15%, độ tro dưới 7%, tro không tan trong acid clohydric dưới 4%. b. Thành phần hóa học: Một số thành phần chủ yếu : muối của các acid mật, cholesterol, sắc tố mật (bilirubin...)Các acid mật trong mật gấu gồm có: acid cholic, acid chenodesoxycholic (CDCA), acid urso desoxycholic (UCDA) (hình 1.1). UCDA: là acid đặc biệt chỉ có trong mật gấu, t°c = 200°c - 204°c, [a]20D = +59,0° -> +62,0° (dung dịch 40 mg/ml trong ethanol) [30]. 2 Acid cholic Acid chenodesoxycholic Acid ursodesoxycholic Hình 1.1 Các acid mật [30] 1.1.2 Công dụng, cách dùng [1, 2,16]: Công năng chủ trị: - Thanh nhiệt giải độc, dùng cho bệnh do hỏa độc dẫn đến mụn nhọt sang lở sưng đau, đặc biệt đau do bệnh trĩ, có thể hòa tan trong nước nóng rồi bôi. - Thanh nhiệt giáng hỏa, dùng trong bệnh sốt cao dẫn đến co giật, hoặc bệnh kinh giản, hồi hộp sợ hãi, co quắp. Phối hợp với câu đằng, bình vôi... sắc lấy nước, hòa với mật gấu để uống. - Thanh can hỏa, tan màng mộng ở mắt, dùng khi can hỏa mắt sưng đau, mắt có màng mộng, mật gấu hòa với nước lấy dịch trong nhỏ vào mắt. Trường hợp viêm gan, hôn mê gan, sắc nước nhân trần rồi hòa với mật gấu mà uống. Hoặc uống riêng để chữa xơ gan. - Hoạt huyết giảm đau, dùng cho trường hợp sưng tấy ứ huyết đau đớn do chấn thương, mật gấu hòa vào rượu, xoa và bóp nơi sang chấn. - Ngoài ra còn dùng chữa đau dạ dày, khó tiêu, lỵ lâu ngày, giun... 3 Liều dùng: - Uống: 0,5 - 2 g / ngày. - Nhỏ mắt: mật gấu một lượng bằng hạt gạo mài vớinước đun sôi để nguội, lấy dịch trong nhỏ vào mắt. - Xoa bóp: dùng dung dịch mật gấu 5g /lOOml rượu 35°. Kiêng kỵ: Những người đau do hỏa uất, trạng thái thực nhiệt không dùng. Không nên dùng liều cao kéo dài, dễ ảnh hưởng tới trạng thái thần kinh. 1.1.3 Cách lấy - chế biến [15]: Bất cứ mùa nào cũng có thể lấy mật. Có thể ba tháng, sáu tháng hoặc một năm lấy một lần. Mật gấu lấy vào mùa đông được nhiều, lấy vào mùa xuân được ít hơn nhưng có phẩm chất tốt hơn. Trước kia muốn lấy cả túi mật người ta phải giết gấu, nay có thể hút trực tiếp từ túi mật sau khi gây mê gấu và siêu âm túi mật. Túi mật phơi hoặc sấy khô, gói kín để vào hộp kín có chất hút ẩm, để nơi mát. Nếu để ở nơi ẩm, nhiệt độ cao, mật gấu chảy nước, rất nhanh hỏng [15]. Dịch mật tươi hút vào dụng cụ sạch, khô, nút kín, để 0°c. Hoặc pha ngay vào rượu hoặc cồn. 1.1.4 Thử mật gấu [2,15] * Thử theo kinh nghiệm nhân dân: - Nếm lúc đầu vị đắng, sau ngọt mát, dính lưỡi,ngậm lâu tan hết.Các mật khác đắng mà không mát, không dính lưỡi, mùi tanh, khó ngửi. - Thả vài hạt mật gấu vào bát nước, hạt mật quay tròn rồi chìm xuống đáy và cho một sợi màu vàng không lan tỏa ra. - Lấy vài hạt mật đốt trên ngọn đèn cồn, hạt mật sủi bọt mà không cháy. * Thử bằng phương pháp hoá học: - Định lượng: Cân chính xác 0,5g mật gấu, hòa tan vào dung dịch KOH 5%. Đun sôi. Sau khi hòa tan, acid hóa bằng HC1, lắc với ete etylic 3 lần, mỗi lần 10ml. Hợp các dung dịch ete lại, dùng nước rửa sạch, bốc hơi hết ete. Ta sẽ có hỗn hợp CDCA và UDCA. Hòa tan cặn này trong 10ml dung dịch 4 amoniac 12%, thêm 10ml dung dịch 10% BaCl2. Lọc lấy kết tủa, được muối bari của các acid trên. Thêm 10ml dung dịch 10% Na2C 03, đun nóng để loại bỏ Ba++. Acid hóa bằng HC1. Lắc với ete 3 lần, mỗi lần 10ml. Hợp các dung dịch ete lại, cất thu hồi ete. Hòa tan cặn trong ethyl acetat. Để yên cho kết tinh, sau đó lọc lấy tinh thể (CDCA không kết tinh). Để khô. Cân UDCA chiết xuất được. Phải được 0,10g tức là trong mật gấu phải có tới trên 20% UDCA. - Định tính: . Đo độ chảy phải thấy 202°c, là độ chảy của UDCA. . Phản ứng Pettenkofer: Lấy ít hạt nhỏ tinh thể UDCA hòa tan trong lml nước cất và một ít saccarose, thêm 1-2 giọt acid sulfuric đặc sẽ thấy xuất hiện màu đỏ rất đẹp. . Phản ứng Lieberman-Surchard: Hòa tan một hạt tinh thể UDCA trong 0,5ml cloroform, thêm 0,5ml anhydrit acetic và một giọt acid sulfuric đặc. Bắt đầu có màu đỏ hồng, sau chuyển sang xanh lam và xanh lục. 1.2. VAI TRÒ CỦA MẬT TRÊN CHUYEN h ó a LIPID [7,18, 27,28] 1.2.1. Trên quá trình nhũ tương hoá lipid: Muối mật làm giảm sức căng bề mặt của các hạt mỡ, phân chia chúng thành những hạt có kích thước rất nhỏ. Đó là quá trình nhũ tương hoá lipid. Muối mật có tác dụng trên bởi có cấu trúc không gian đặc biệt: tất cả các nhóm có cực nằm về một phía, các nhóm không cực nằm về phía ngược lại (hình 1.2). Các phân tử này nằm ở mặt phẳng ranh giới giữa hai pha dầu- nước tạo ra nhũ tương rất bền vững, làm tăng diện tích bề mặt tiếp xúc với lipase. Hình 1.2 Cấu trúc không gian của acid cholic 5 1.2.2 Trên quá trình thuỷ phân triglycerid Lipase do tuyến tụy tiết ra, được acid mật hoạt hóa, có tác dụng thủy phân liên kết ester giữa acid béo (AB) và glycerol trong triglycerid. Lipase tan trong nước nên có thể tấn công vào bề mặt các hạt cầu mỡ. TG — AB DG J3MG aMG Glycerol lipạse AB lipạse r____OH AB — AB AB- OH-* OH —AB - OH OH OH OH AB AB AB Hình 1.3: Tác dụng của lipase thủy phân triglycerid. 1.2.3. Trẽn quá trình hấp thu lipid Muối mật tạo với lipid những phức hợp rất nhỏ gọi là các hạt micelle. Các hạt này có thể tan trong nước và được hấp thu qua màng ruột nhờ các nhóm ưa nước của muối mật. 1.3. QUÁ TRÌNH ĐÔNG MÁU VÀ TIÊU FIBRIN [5,11,16, 20] Đông máu và chống đông máu là hai quá trình phức tạp tồn tại song song trong cơ thể. Quá trình đông máu giúp cầm máu còn chống đông máu ngăn cản hiện tượng đông lan tràn, làm tiêu cục máu để lưu thông huyết mạch. 1.3.1. Quá trình đông máu Khi thành mạch bị tổn thương, lập tức xảy ra các hiện tượng: - Hiện tượng co mạch: theo cơ chế phản xạ thần kinh và tác động thể dịch, tiểu cầu dính và ngưng tập tạo thành đinh Hayem tại nơi bị tổn thương. - Hiện tượng đông máu: các yếu tố đông máu hoạt động tạo thành mạng lưới fibrin, ôm lấy hồng cầu bạch cầu tạo thành cục máu đông. - Hiện tượng co cục máu: làm cho cục máu đông trở nên chắc và ổn định hơn, sự cầm máu tốt hơn và kéo dài hơn. 6 Quá trình đông máu tiếp xúc bề mặt Hệ thống nội mạch Hệ thống ngoại mạch XII — *-> Xlla HMWK, Prekallikrein TT. XI Ca4 (1)IX Tổn thương mô IXa + \TlIa + PLjI m +1 I :::::. Ca+ (1)X. VII ị) Ca+ Ngưng kết tiểu cầu (Ị) AntithrombinllỊ ▼ ▼ Ca1 (1) Prothrombin ...........Ả v + PL| Ỷ (2) ^ Hạ Ẳểu cầu ( 2) Fibrinogen (4 ) ▼^ Fibrin Caịí............. Quá trình tiêu ílbrin XIII Fibrin bền vững Yếu tô'hoạt hoá (9) (9) Plasminogen__▼(6)(7) ► Plasmin (8) Sản phẩm tiêu fibrin Hình 1. 4 Quá trình đông máu và tiêu fibrin. Chú thích: PL: phospholipid (yếu tố tiểu cầu 3) -------- ► Chuyển dạng . Hoạt hoá (1) Coumarin và dẫn chất (2) Heparin - ức chế sự tạo thành và hoạt động của Thrombin (3) Heparin liều thấp tăng tác dụng của kháng thrombin II và tăng hiệu lực của các chất ức chế các yếu tố IX, X, XI, XII và của plasmin (4) Ancrod - ngăn cản chuyển I thành la (5)Thuốc ức chế kết dính tiểu cầu (6) Streptokinase (7)Urokinase (8) Chất kích thích tiêu fibrin: Ethyloestrenol, Stanozolol... (9 )Chất chống tiêu fibrin: s aminocaproic acid... 7 QTĐM là chuỗi các phản ứng dây chuyền để biến đổi fibrinogen thành fibrin, tạo cục máu đông, với sự tham gia của các yếu tố đông máu. a. Các yếu tố đông máu Các yếu tố này được ký hiệu bằng các chữ số La mã: Fibrinogen (I), Prothrombin (II), Thromboplastin tổ chức (III), Ion calci (IV), Proaccelerin (X), Proconvertin (VII), yếu tố chống chảy máu A (VIII), yếu tố chống chảy máu B (IX), yếu tố Stuart-Prower (X), Thromboplastin huyết tương (XI), yếu tố Hageman (XII), yếu tố làm bền vững fibrin (XIII), Prekallikrein, HMWK. b. Các giai đoạn quá trình đông máu: QTĐM được chia làm ba giai đoạn, theo cách phân chia của Howell. Giai đoạn ỉ: Hình thành thromboplastin (chất xúc tác chuyển prothrombin thành thrombin), xảy ra theo cả hai con đường nội mạch và ngoại mạch với sự tham gia của các yếu tố đông máu của huyết tương, tiểu cầu và tổ chức. Trong giai đoạn này các yếu tố đông máu hoạt hoá trình tự theo kiểu bậc thang. Giai đoạn 2: Chuyển prothrombin thành thrombin dưới tác dụng của các yếu tố Xa, Va và Ca++. Giai đoạn 3: Tạo fibrin từ fibrinogen dưới tác dụng của thrombin, Ca++ và yếu tố XlIIa. Fibrin ở dạng đơn phân trùng hợp ngay thành fibrin đa phân. Fibrin đa phân không bền do phản ứng trùng hợp có tính thuận nghịch, dưới xúc tác của yếu tố XlIIa tạo thành mạng lưới fibrin bền vững. c. Các chất ức chê đông máu : Nhóm ỉ: các chất ức chế của serin protease: Antithrombin III, a-, macroglobulin, a t antitripsin, đồng yếu tố heparin. Nhóm 2: hệ thống protein C: Protein c, Thrombomodulin, Protein s. 1.3.2 Quá trình tiêu fibrin a. Các yếu tố tham gia trong hệ thống tiêu fibrin - Plasminogen: Được tổng hợp ở gan, có trong nhiều tổ chức khác nhau, là protein đơn chuỗi có 791 acid amin, không bền với nhiệt và pH trung tính. 8 - Plasmin: Gồm hai chuỗi protein nối với nhau bằng cầu nối disulfua, hoạt động ở pH trung tính, phân hủy cả fibrin, fibrinogen, yếu tố V, VIII, XlIIa, ... Có nhiều cách hoạt hoá plasminogen thành plasmin: nhờ fibrinokinase trong mô và huyết tương, yếu tố hoạt hoá plasminogen của mô (t-PA: tissue plasminogen activator), urokinase có trong nước tiểu, streptokinase và staphylokinase phân lập từ vi khuẩn. b. Các giai đoạn quá trình tiêu fibrin Giai đoạn ỉ: Hoạt hóa plasminogen thành plasmin. Tất cả các chất hoạt hoá đều theo cơ chế cắt liên kết giữa arginin và valin trong phân tử plasminogen tạo ra hai chuỗi A và B liên kết nhau bằng cầu nối disulfua. Giai đoạn 2: Tiêu fibrin. Plasmin làm phân huỷ fibrin không hoà tan, tạo ra các sản phẩm thoái hoá có trọng lượng phân tử thấp, hoà tan. Plasmin còn phân huỷ cả fibrinogen. (Sản phẩm thoái giáng của fibrin và fibrinogen quay lại ức chế quá trình hình thành fibrin). c.Các chất điều hoà quá trình tiêu fibrin - Các chất ức chế sự hoạt hoá plasminogen 1, 2 (PAI-1, PAI-2: Plasminogen activated inhibitor -1,-2) - Các chất kháng plasmin: oc 2 “ antiplasmin, chất ức chế Cj, glycoprotein giàu histidin, s-aminocaproic acid (EACA),1-antitrypsin, antithrombin III ... - Các hormon: TSH (kích giáp trạng tố), STH (kích phát triển tố) có tác dụng thúc đẩy tiêu fibrin; ACTH (kích thượng thận tố) ức chế sự tiêu fibrin. 1.3.3. Một số thuốc chống đông máu và tiêu fibrin (xem hình 1.4) a. Thuốc chống đông máu [3, 10, 23, 24] - Thuốc ức chế tác dụng của các yếu tố đông máu: Heparin là một mucopolysaccharid, ức chế sự tạo thành và tác dụng của thrombin do tạo phức với antithrombin III. Phức hợp này còn ức chế các yếu tố IX, X, XI, XII. Heparin còn có tác dụng chống kết vón tiểu cầu, ức chế kallikrein. Ngoài ra 9 heparin hoạt hoá lipoprotein-lipase, làm tăng chuyển hoá chylomicron và VLDL, nên có tác dụng làm giảm TG và VLDL. - Thuốc ức chế sự tổng hợp các yếu tố đông máu ở gan: Các kháng Vitamin K (dẫn chất 4-hydroxycoumarol, dẫn chất indan-l,3-dion). Các chất này cạnh tranh với vitamin K gây ức chế quá trình chuyển PIVKA (Protein induced by vitamin K antagonists) thành các yếu tố II, VII, IX, X có hoạt tính. - Thuốc chống kết dính tiểu cầu: Aspirin: ức chế enzym prostaglandin cyclooxygenase của màng tiểu cầu, ngăn cản tổng hợp thromboxan A2, là chất gây giãn mạch và làm kết dính tiểu cầu mạnh. Ngoài ra Aspirin còn ức chế phosphodiesterase làm tăng nồng độ AMP vòng, ức chế giải phóng ADP nội tại, là chất kích thích tiểu cầu phóng thích yếu tố tiểu cầu 3. Một sô thuốc khác: Phenylbutazol, oxyphenbutazon, sulfinpyrazon, Indomethacin, Dipyridamol, Ticlodipin. b. Thuốc làm tiêu fibrin [3, 10, 23] Các chất này làm tăng nhanh quá trình tiêu fibrin sinh lý ở các huyết khối. Hiện nay hay dùng urokinase (UK) và streptokinase (SK). Urokinase: Là một protease phân lập từ nước tiểu người hoặc từ nuôi cấy tế bào phôi thận người. UK hoạt hoá trực tiếp plasminogen thành plasmin có sự phối hợp chặt chẽ với yếu tố hoạt hoá plasminogen tổ chức t-PA. Thời gian bán huỷ của UK ngắn, 10-15 phút. Streptokinase: Phân lập từ môi trường nuôi cấy liên cầu khuẩn Ị3 tan máu nhóm c. SK hoạt hoá plasminogen bằng cách liên kết với plasminogen với tỉ lệ 1 : 1 hoặc liên kết với plasmin. SK còn có tác dụng làm giảm fibrinogen và có tính kháng nguyên. Thời gian bán hủy là 20 phút. * Các thuốc tiêu fibrin còn có tác dụng: - Làm giảm độ quánh máu, cải thiện các điều kiện huyết động. - Cải thiện tuần hoàn trong các vùng cạnh khu vực có huyết khối hoặc có nhồi máu cơ tim do làm tiêu các vi huyết khối. 10 * Để đánh giá tác dụng của thuốc, các xét nghiệm thường dùng là: - Nghiệm pháp Milstone xác định thời gian tiêu cục fibrin trong điều kiện loại trừ các chất ức chế hệ thống tiêu fibrin. - Định lượng các chất do tiêu cục fibrin tạo thành. c. Một sô' thuốc đông dược có tác dụng chống đông máu [1] Theo y học cổ truyền, thuốc hoạt huyết là những thuốc có tác dụng lưu thông huyết mạch, thường dùng trong các trường hợp huyết ứ do sang chấn, viêm tắc gây đau đớn, huyết ứ do kinh bế, sau đẻ, sưng tấy, đau nhức.... Thuốc được chia làm hai loại: - Thuốc hoạt huyết: tác dụng hành huyết ở mức độ nhẹ như đương quy, xuyên khung, đan sâm..., loại này dùng đối với các bệnh do huyết mạch lưu thông kém gây sưng đau. - Thuốc phá huyết: tác dụng hành huyết mạnh hơn như đào nhân, hồng hoa, nga truật, tô mộc..., dùng với các bệnh huyết ứ đọng, gây đau đớn mãnh liệt. * Mật gấu cũng được dùng trong những trường hợp tụ máu, sưng đau... và cũng như đa số các thuốc đông dược, cơ chế tác dụng của mật gấu chưa rõ. 1.4. SẮC KÝ LỚP MỎNG [4, 8, 13, 29] Lý thuyết SKLM một phần dựa trên lý thuyết sắc ký hấp phụ và một phần dựa trên lý thuyết sắc ký phân bố. 1.4.1. Nguyên tác của SKLM Nguyên tắc tách chiết các chất trong SKLM dựa trên sự phân bố của các chất giữa hai pha tĩnh và động. Pha tĩnh là chất hấp phụ được rải thành lớp mỏng trên một mặt tấm kính, chất dẻo hay kim loại. Pha động là dung môi sẽ t thấm và chạy trên lớp mỏng do tác động của lực mao dẫn, đôi khi là lực điện hay trọng lực, làm chuyển dịch các chất và tạo ra các vết trên bản mỏng. Phát hiện ra các vết này bằng các phương pháp lý, hoá sau khi làm bay hơi dung môi pha động. 11 1.4.2 Kỹ thuật SKLM: a. Trang bị: - Chất hấp phụ: Trong SKLM cần dùng bột chất hấp phụ rất mịn. Các chất hấp phụ thường dùng là: Silicagel, nhôm oxyd, Kieselgur, thạch cao (calci sulfat), cellulose, bột polyamid, các ionid, sephadex. Trên thị trường còn có các loại silicagel G, Kieselgur G, nhôm oxyd G đã trộn sẵn 5% thạch cao, loại silicagel H, nhôm oxyd H không trộn thạch cao, loại silicagel thạch cao F254 có chất huỳnh quang. - Bản mỏng: Bản mỏng dính chắc: chất hấp phụ trộn thêm 5 - 15% chất kết dính như thạch cao, tinh bột, dextrin. Bản mỏng không dính chắc: rải bột có hoạt độ thích hợp lên tấm kính, san bằng với một đũa thép hai đầu dầy lên khoảng 0,5-lmm, hoặc một đũa thuỷ tinh hai đầu lồng hai đoạn ống cao su, hoặc dùng dụng cụ rải riêng. - Dung môi: Dung môi phải tinh khiết. Tốc độ dịch chuyển của một chất trên một chất hấp phụ nhất định phụ thuộc vào dung môi sử dụng. Đôi khi hỗn hợp 2-3 dung môi có độ phân cực khác nhau lại tách tốt hơn những dung môi đồng đều về mạt hoá học. - Bình sắc ký: Có thể dùng các loại bình chuyên dùng cho SKLM hoặc các lọ rộng miệng, bình hình trụ có nút mài hoặc nắp đậy thông thường. b. Quá trình và kỹ thuật sắc ký - Chuẩn bị bản mỏng, bình sắc ký thích hợp, quanh bình lót giấy lọc để bão hoà dung môi nhanh. - Chấm mẫu thử lên bản mỏng: đánh dấu đường xuất phát cách mép dưới khoảng lcm. Dùng micropipet hay ống mao quản chấm dung dịch lên những điểm cách nhau ít nhất lcm. Vết chấm phải gọn nhỏ, lượng chất chấm có ảnh hưởng tới sự di chuyển và vị trí của vết trên sắc đồ. 12 - Khai triển sắc ký: đặt bản mỏng vào bình sắc ký đã bão hoà dung môi pha động, mép phía chấm mẫu chạm trực tiếp vào dung môi. Khi dung môi chạy được khoảng 10 cm lấy ra đánh dấu tiền tuyến dung môi, để khô. Có thể chạy sắc kỷ đi lên, đi xuống hoặc nằm ngang, chạy một chiều hoặc hai chiều. Trường hợp SKLM với bản mỏng không dính chắc thì dùng chậu thuỷ tinh có kích thước phù hợp với bản mỏng, đặt bản mỏng nằm nghiêng 15-20° nhúng vào dung môi để ở đáy chậu. - Phát hiện các vết trên bản mỏng: * Dùng ánh sáng tử ngoại để phát hiện. * Dùng thuốc thử hoá học: phun thuốc thử lên bản mỏng (acid sulfuric đậm đặc hoặc thuốc thử đặc hiệu với từng loại chất), hoặc dùng hơi iod. Vị trí các vết trên sắc đồ có thể xác định nhờ chỉ số Rf, phản ánh tốc độ di chuyển của các chất: Rf =-2^đm Trong đó: Sct, Sdmlà đường đi của chất thử và dung môi. * Cách tốt nhất là cho chạy song song những chất chuẩn trên cùng bản mỏng và tính giá trị Rs Trong đó: - Rf(ct), Rf(cc) là tốc độ di chuyển của chất thử và chất chuẩn. - Scc là đường đi của chất chuẩn. 1.4.3. Ưu điểm của phương pháp SKLM - Nhanh (15 phút - 3 giờ), trang thiết bị tương đối đơn giản, do đó có thể tiến hành nhanh chóng và ít tốn kém các thí nghiêm thăm dò cho sắc ký cột. - Dễ kết hợp định tính với định lượng, bán định lượng. - Tách nhiều hỗn hợp phức tạp. - Được dùng để thử độ tinh khiết của sản phẩm, được dùng nhiều trong các phòng thí nghiệm lâm sàng, trong nghiên cứu sinh học, hoá sinh. 13 PHẨN 2 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ■ ■ 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 2.1.1 Nguyên vật liệu - Dịch mật gấu tươi: được lấy từ gấu chó, nuôi tại trại chăn nuôi Khoa Dược, Bệnh viện Y học cổ truyền - Bộ Công an, đựng trong lọ sạch, nút kín, bảo quản ở 0°c. Khi dùng pha thành các nồng độ cần thiết trong dung dịch NaCl 0,9%. - Dịch mật lợn, bò, gà, cóc, cá trắm: được lấy từ các súc vật trên khi giết thịt, đựng trong lọ, sạch, nút kín, bảo quản ở 0°c. - Dịch chiết tụy được chiết từ lOg tuỵ tươi với 30ml NaCl 0,9%, điều chế thành dịch tuỵ 5% (5ml dịch chiết tuỵ/lOOml NaHC03 1%), bảo quản 4°c, dùng trong vòng 12 giờ. - Huyết tương người: Máu người bình thường (người hiến máu tại Bệnh viện Việt Đức) được chống đông bằng dung dịch natri citrat 3,8% theo tỉ lệ 1 thể tích citrat : 9 thể tích máu, để lắng hoặc li tâm chậm 500 vòng/5 phút lấy huyết tương giàu tiểu cầu, hoặc li tâm 3500 vòng/20 phút để lấy huyết tương nghèo tiểu cầu, dùng ngay. - Sữa: Sữa tươi không đường Vinamilk. - Bản mỏng chạy sắc kỷ silicagel aluminum 60 F254 của Merck (Đức). - Hoá chất, thuốc thử: + Dung dịch NaCl 0,9%. + Dung dịch CaCl2 0,1M, 0,025M. 14 + Dung dịch acid acetic 1%, 0,016%. + Dung dịch đệm Borat pH 7,6. + Dung dịch NaHCOj 1%. + Dung dịch Na2C 03 1%. + Dung dịch acid phosphomolipdic 5% trong ethanol: ether (1:1). - Máy móc thiết bị: + Máy điều nhiệt CLIFTON (Nickel Electro - Anh). + Máy li tâm EBA 21 (Hettich Zentrifligen - Đức. + Máy đo pH MODEL 3305 (Jenway - Anh). + Các dụng cụ thông thường dùng trong phòng thí nghiệm. 2.1.2 Phương pháp nghiên cứu a. Phân tách thành phần của mật gấu và phân biệt mật gấu với một số mật khác bằng phương pháp SKLM [4, 8, 13, 22] Dụng cụ, thuốc thử: - Mật gấu và các mật bò, lợn, gà, cóc, cá trắm (dịch mật nguyên). - Bản mỏng chạy sắc ký. - Dung môi: là pha trên của hỗn hợp n-butanol: acid acetic : nước có tỉ lệ 4:1:5. - Chất hiện màu: Dung dịch acid phosphomolipdic 5% trong ethanol : ether với tỉ lệ 1:1 (pha ngay trước khi dùng). Các bước tiến hành: xem phần 1.4. (Chú ý sau khi phun chất hiện màu, sấy ở 100°C/5 phút). b. Đánh giá tác dụng chống đông máu của mật gấu [12, 16, 20, 21] Tác dụng chống đông máu của mật gấu được thực hiện bằng phương pháp invitro trên huyết tương người với các xét nghiệm sau: 15 * Xắc định thời gian Howell theo kỹ thuật Howell Nguyên tác Thời gian Howell (còn gọi là thời gian phục hồi calci) phản ánh quá trình đông máu nội sinh của huyết tương, là thời gian hình thành sợi fibrin của huyết tương khi thêm ion calci. Dụng cụ, thuốc thử - Mật gấu pha thành dung dịch có nồng độ 1/40 trong NaCl 0,9%. - Huyết tương giàu tiểu cầu. - Dung dịch CaCU 0,025M pha ngay trước khi dùng từ dung dịch CaCl2. - Máy điều nhiệt, máy li tâm, đồng hồ bấm giây, ống nghiêm, pipet... Tiến hành —— Thuốc thử ~~~~~ Huyết tương giàu tiểu cầu (ml) — ——__ Dung dịch NaCl 0,9% (ml) Mẫu chứng Mẫu thử 0,2 0,2 0,05 Dung dịch mật 1/40 (ml) 0,05 Lắc trộn đều, ủ 37°c trong 2 phút. Dung dịch CaCl2 0,025M (ml) 0,2 0,2 Khởi động đồng hồ. Lắc trộn đều. Ghi thời điểm đông. Mỗi mẫu được tiến hành hai lần, lấy giá trị trung bình. * Xác định thời gian tiêu fibrin theo kỹ thuật Milstone Nguyên tắc Thời gian tiêu fibrin là thời gian từ khi fibrin hình thành đến khi tan hết trong môi trường không có chất ức chế plasminogen. Việc tủa euglobulin bằng cách pha loãng và acid hóa huyết tương đã loại trừ được các chất ức chế tiêu fibrin ở phần dịch trong, làm cho hiện tượng tiêu fibrin trở nên nhanh hưn. Hoà tan tủa này bằng đệm Borat, sau đó thực hiện quá trình tạo fibrin bằng cách bổ sung ion calci. 16 Dụng cụ, thuốc thử - Mật gấu pha thành dung dịch có nồng độ 1/40 trong dung dịch NaCl 0,9%. - Huyết tương nghèo tiểu cầu. - Dung dịch acid acetic 0,016% pha ngaytrước khi dùng từ dung dịch acid acetic 1%. - Dung dịch CaCl2 0,025M pha ngay trước khi dùng từ dung dịch CaCl2 0,1M. - Đệm Borat pH 7,6. - Máy điều nhiệt, máy li tâm,ống nghiệm, pipet, đũathuỷ tinh, giấy lọc... Tiến hành Mẫu Mẫu chứng Mẫu thử Điều kiện Huyết tương nghèo tiểu cầu (ml) 0,4 0,4 4°c Dung dịch acid acetic 0,016% (ml) 7,6 7,6 4°c Thuốc thử Nút kín, trộn đều, để 0°c/10 phút, li tâm 3500 vòng/10 phút, đổ dịch trong lấy tủa, lau khô miệng ống. Dung dịch đệm Borat pH 7,6 (ml) 0,4 Dung dịch NaCl 0,9% (ml) 0,1 Dung dịch mật gấu 1/40 (ml) 0,4 37°c 0,1 37°c 0,4 37°c Trộn đều, ủ 37°c trong 2 phút để cân bằng nhiệt Dung dịch CaCl20,025M (ml) 0,4 Ghi thời điểm cục đông hình thành. Ghi thời điểm cục đông tan hoàn toàn. ..... - c. Phương pháp đánh giá tác dụng trên thủy phân tríglycerid [6] Nguyên tắc: Trong điều kiện tối thích (môi trường kiềm, lipid được nhũ tương hóa), lipase xúc tác sự thuỷ phân TG trong sữa tạo ra glycerol và AB. Sự giải phóng của AB tự do làm giảm pH của môi trường, có thể nhận biết bằng cách đo pH. Dụng cụ, thuốc thử - Sữa. - Mật gấu, mật lợn (dịch tươi). - Dịch tụy 5% trong NaHC03 1%. - Dung dịch NaCl 0,9%, Na2C 03 1%. - Máy điều nhiệt, máy đo pH, pipet,cốc thuỷ tinh... Tiến hành * Điều chế dịch tụy: Tụy lợn rửa sạch, lau hết nước bằng bông. Cân lOg, nghiền với 10ml dung dịch NaCl 0,9%, gạn lấy dịch. Làm như vậy 3 lần. Tập hợp các dịch gạn, lọc qua bông. Từ dịch chiết tụy pha thành dung dịch 5% trong NaHC03 1% (lml chứa l/60g tụy tươi). * Tiến hành trong cốc thủy tinh 25ml sạch, khô: Mẫu Mẫu chứng Mẫu thử 1 Mẫu thử 2 6,0 6,0 6,0 Dung dịch Na2C 03 1% (ml) 0,5 0,5 0,5 Dung dịch NaCl 0,9% (ml) 0,1 Thuốc thír Sữa (ml) Mật gấu (ml) 0,1 Mật lợn (ml) 0,1 Trộn đều, để 37°C/2 phút Dịch tuỵ 5% (ml) 3 3 3 Trộn đều, để ở 37°c, theo dõi biến đổi pH trong 10 phút, ghi giá trị pH sau mỗi phút. 18 2.1.3 Phương pháp xử lý số liệu [22] Theo phương pháp thống kê có dùng thông số. a. Biểu thị trị số trung bình: x±ơ Trong đó: . X là giá trị trung bình: I =- Ỹ I n ,= 1 n: số lượng phép thử giá trị của phép thử i. ơ là độ lệch chuẩn: ơ = é ^ - x y 7= 1 n -1 b. Cách tính độ tin cậy t (trị số Student) theo Urbrach: Tính t để so sánh hai giá trị trung bình (áp dụng cho các chỉ số: thời gian phục hồi calci, thời gian tiêu fibrin): ỵ,-ỵ t= JhĨL. V"l +"; ỵ(x„-xo!+é(ỵ2,-x>) i= 1 1 1=1 n\ + n2~ 2 c. Đối chiếu với bảng t - Student rồi phân tích kết quả: Nếu t lớn hơn giá trị t tương ứng với p = 0,05 thì độ tin cậy đạt trên 95%. Nếu t lớn hơn giá trị t tương ứng với p = 0,01 thì độ tin cậy đạt trên 99%. Nếu t lớn hơn giá trị t tương ứng với p = 0,001 thì độ tin cậy đạt trên 99,9%. 19 2.2 KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u VÀ NHẬN XÉT 2.2.1. Phân tách thành phần của mật gấu và so sánh vớỉ một số mật khác bằng phương pháp SKLM a. Phân tách thành phần của mật gấu bằng phương pháp SKLM: - Quá trình sắc ký được tiến hành trên chất hấp phụ là silicagel aluminum F254 có chất huỳnh quang. - Dung môi: Chưa có tài liệu nêu cụ thể về dung môi chạy sắc ký lớp mỏng đối với dịch mật, vì vậy chúng tôi dựa vào dung môi sắc ký acid mật là n-butanol: acid acetic : nước với tỉ lệ 8 : 1 : 1 để chạy thử [8, 14, 23], nhưng trên sắc ký đồ các vết tách chưa tốt. Sau đó chúng tôi tiến hành thăm dò hệ dung môi trên với nhiều tỉ lệ khác nhau và đã chọn được tỉ lệ tách tốt nhất là 4 : 1 :5. - Kết quả: Qua chạy sắc ký nhiều lần với hệ dung môi trên, mật gấu đã được tách thành ba vết (Hình 2.1). R0 = 0,82 Ệ k Rc = 0,41 R,, = 0,21 Hình 2.1 Sắc ký đồ dịch mật gấu. 20 Theo thứ tự từ dưới lên thì giá trị Rf của các vết là: 0,21; 0,41; 0,82. Trong các vết trên thì vết thứ hai có đậm độ lớn nhất, tiếp đó là vết thứ nhất và vết thứ ba. Chúng tôi chưa biết các vết đó tương ứng với thành phần muối mật nào trong mật gấu. Sau đó cho chạy sắc ký mật gấu song song với một số chất chuẩn là cholat natri, desoxycholat natri, chenodesoxycholat natri, thì thấy hai vết thứ nhất và thứ hai không tương ứng với muối mật nào, vết thứ ba có thể tương ứng với chenodesoxycholat natri 0Hình 2.2). Theo chúng tôi, các acid mật trong mật gấu có thể ở dạng liên kết với glycine và taurine nên Rf đã thay đổi. 21 C h c. d o Hình 2.2 Sắc ký đồ của mật gấu và một số chất chuẩn (C: Cholat natri, Cd: Chenodesoxycholat natri, D: Desoxycholat natri, M: Mật gấu). Giá ừị Rf của các chất chuẩn: Cholat natri: Rfc = 0,78 Chenodesoxycholat natri: Rfcđ = 0,81 Desoxycholat natri'.Rfl) = 0,79 22 b. So sánh thành phần của mật gấu với các mật khác bằng phương pháp SKLM Chúng tôi tiến hành chạy sắc ký song song mật gấu với các mật bò, lợn, gà, cóc, cá trắm cũng với hệ dung môi trên, các mật phân tách rất khác nhau. (Hình 2.3). Hình 2.3 Sắc ký đồ của mật gấu và một số mật khác (Từ trái sang phải: mật gấu, bò, lợn, gà, cóc, cá trắm) Theo hình 2.3, mật cóc có hai vết, mật gấu và mật cá trắm có ba vết, mật lợn và mật gà có bốn vết, và mật bò có sáu vết. Sự khác biệt giữa mật gấu và các mật khác còn thể hiện qua giá trị Rf của các vết (Bảng 2.1). 23 Bảng 2.1 Giá trị Rf của các vết (theo chiều từ dưới lên ở hình 2.3) Rf Đối tương 1 2 3 4 5 6 7 8 Mật gấu 0,21 0.41 Mật lợn 0,21 0,40 0,63 0,83 Mật bò 0,21 0,36 0.42 0,55 0,62 0,83 Mật gà 0,22 0,35 0,42 0,82 Mật cóc 0,43 0,83 Mật cá trắm 0,42 0,82 0,49 0,84 Cholat 0,78 Desoxycholat 0,79 Chenodesoxy cholat 0,82 Qua sắc ký đồ cho thấy chỉ có mật gấu và mật cá trắm cùng tách được ba vết, nhưng vị trí và Rf của các vết khác nhau. Cụ thể xem hình 2.4. Mật gấu có một vết với Rf = 0,21 là hoàn toàn khác với mật cá trắm. 24 Giá trị Rị của mật gấu: Giá trị Rị của mật cá trắm: Rfy = 0,84 Rf3 = 0,82 = 0,49 RfV = 0,42 R0 = 0,41 Rfl = 0,21 Hình 2.4 Sắc ký đồ của mật gấu và mật cá trắm Trên thực tế, mật bò và mật lợn hay được dùng để giả mạo mật gấu, nhưng trên sắc ký đồ các mật này rất khác với mật gấu, chúng tách thành nhiều vết: mật bò có 6 vết, mật lợn có 4 vết (Hình 2.3). Mật gà và mật cóc cũng khác với mật gấu về số lượng và giá trị Rf của các vết. Như vậy có thể phân biệt mật gấu với các mật khác thông qua số lượng và giá trị Rf của các vết trên sắc ký đồ. 2.2.2 Tác dụng của mật gấu tớỉ thời gian phục hồi calci (thời gian Howell) Để theo dõi ảnh hưởng của mật gấu đến thời gian phục hồi calci, chúng tôi tiến hành thăm dò lượng mật gấu thích hợp cho mỗi thử nghiệm và đã xác định được lượng mật gấu cần dùng là 0,05 ml dung dịch nồng độ 1/40 (có tác dụng kéo dài thời gian Howell trên 10% so với mẫu chứng). 25 Với nồng độ này chúng tôi khảo sát trên 20 mẫu huyết tương của 20 người bình thường. Mỗi ngày chỉ tiến hành trên 3-4 mẫu. Kết quả ống thử được đối chiếu với ống chứng cùng mẫu huyết tương. Bảng 2.2 Tác dụng của mật gấu trên thời gian Howell Mẫu 1 Mẫu chứng (giây) 135 Mẫu thử (giây) 165 2 150 200 3 125 200 4 135 170 5 135 200 6 105 165 7 135 170 8 135 200 9 135 185 10 145 205 11 135 170 12 140 165 13 150 175 14 150 180 15 135 190 16 135 185 17 135 170 18 125 150 19 135 155 20 135 150 X + C5- 136 ± 10 176 ± 20 A% 29% t 9,126 p < 0,001 26 Nhận xét: Qua bảng 2.2 ta thấy thời gian Howell của mẫu chứng là 136 ± 10 giây nằm trong giới hạn của huyết tương người bình thường (90 - 150 giây), ơ chiếm 7% so với X , chứng tỏ các mẫu huyết tương và điều kiện thực nghiệm có thể tín cậy được. Dịch mật gấu nồng độ 1/40 (ml/ml) làm tăng thời gian Howell so với chứng là 29% với p < 0,001. Sự tăng này có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 99,9%. Cơ chế kéo dài thời gian đông máu của mật gấu chưa rõ. Theo chúng tôi có thể mật gấu đã ức chế một số yếu tố trong quá trình đông máu. □ Chứng ■ Mật gấu t (giây) 18 15 12 9 6 3 Hình 2.5 Ả nh hưởng của mật gấu đến thời gian Howell 27 2.2.3 Tác dụng của mật gấu tới thời gian tiêu ỉibrin Thử nghiệm được tiến hành trên 15 mẫu huyết tương khác nhau. Sau khi đã thăm dò lượng mật gấu thích hợp cho một thử nghiệm, chúng tôi đã xác định được lượng mật gấu cần thiết là 0,1 ml dung dịch có nồng độ 1/40 (có tác dụng làm giảm thời gian tiêu fibrin trên 10% so với mẫu chứng). Bảng 2.3 Tác dụng của mật gấu tới thời gian tiêu fibrin Mẫu Mẫu chứng (phút) Mẫu thử (phút) 1 285 230 2 340 225 3 330 225 4 355 295 5 190 160 6 330 280 7 350 300 8 355 255 9 210 150 10 290 250 11 330 290 12 240 190 13 320 280 14 275 240 15 250 210 x±ơ 297 ± 54 239 ± 47 A% -20% t 3,145 p [...]... các mật này rất khác với mật gấu, chúng tách thành nhiều vết: mật bò có 6 vết, mật lợn có 4 vết (Hình 2.3) Mật gà và mật cóc cũng khác với mật gấu về số lượng và giá trị Rf của các vết Như vậy có thể phân biệt mật gấu với các mật khác thông qua số lượng và giá trị Rf của các vết trên sắc ký đồ 2.2.2 Tác dụng của mật gấu tớỉ thời gian phục hồi calci (thời gian Howell) Để theo dõi ảnh hưởng của mật gấu. .. phần của mật gấu với các mật khác bằng phương pháp SKLM Chúng tôi tiến hành chạy sắc ký song song mật gấu với các mật bò, lợn, gà, cóc, cá trắm cũng với hệ dung môi trên, các mật phân tách rất khác nhau (Hình 2.3) Hình 2.3 Sắc ký đồ của mật gấu và một số mật khác (Từ trái sang phải: mật gấu, bò, lợn, gà, cóc, cá trắm) Theo hình 2.3, mật cóc có hai vết, mật gấu và mật cá trắm có ba vết, mật lợn và mật. .. có mật gấu và mật cá trắm cùng tách được ba vết, nhưng vị trí và Rf của các vết khác nhau Cụ thể xem hình 2.4 Mật gấu có một vết với Rf = 0,21 là hoàn toàn khác với mật cá trắm 24 Giá trị Rị của mật gấu: Giá trị Rị của mật cá trắm: Rfy = 0,84 Rf3 = 0,82 = 0,49 RfV = 0,42 R0 = 0,41 Rfl = 0,21 Hình 2.4 Sắc ký đồ của mật gấu và mật cá trắm Trên thực tế, mật bò và mật lợn hay được dùng để giả mạo mật gấu, ... Máy đo pH MODEL 3305 (Jenway - Anh) + Các dụng cụ thông thường dùng trong phòng thí nghiệm 2.1.2 Phương pháp nghiên cứu a Phân tách thành phần của mật gấu và phân biệt mật gấu với một số mật khác bằng phương pháp SKLM [4, 8, 13, 22] Dụng cụ, thuốc thử: - Mật gấu và các mật bò, lợn, gà, cóc, cá trắm (dịch mật nguyên) - Bản mỏng chạy sắc ký - Dung môi: là pha trên của hỗn hợp n-butanol: acid acetic : nước... nhiều hơn của mật gấu thật) Mật gấu có tác dụng chống đông máu và tiêu fibrin thể hiện qua tác dụng kéo dài thời gian Howell và rút ngắn thời gian tiêu fibrin Cả hai tác dụng này phù hợp với công năng chống tụ máu, tán huyết ứ theo như kinh nghiệm sử dụng mật gấu trong dân gian Về tác dụng tới thuỷ phân triglycerid, mật gấu đã làm tăng nhanh quá trình thuỷ phân TG Điều này cũng phù hợp với tác dụng kích... thể tách mật gấu thành ba vết khác nhau, trong đó vết có Rf = 0,21 là đặc trưng vì trên sắc kỷ đồ của mật cá trắm cũng có ba vết nhưng không có vết này Số lượng vết và Rf của từng vết cho thấy mật gấu khác hẳn với các cá trắm, mật cóc, bò, lợn, gà Theo chúng tôi, sắc ký đồ có thể là dấu hiệu đầu tiên để phân biệt mật gấu thật hay giả, đặc biệt với mật gấu giả dùng mật bò, mật lợn (sắc ký đồ có số vết... hạn của người bình thường (trên 180 phút) Dịch mật gấu nồng độ 1/40 làm giảm thời gian tiêu fibrin so với mẫu chÚQg là 20% với p < 0,01 □ Chứng I Mật gấu t (phút) 300 250 200 150 100 50 0 Hình 2.6 Ả nh hưởng của mật gấu đến thời gian tiêu fibrin 2.2.4 Tác dụng của mật gấu tói quá trình thủy phân triglycerỉd Chúng tôi tiến hành theo dõi ảnh hưởng của mật gấu đến quá trình thuỷ phân TG trong sữa dưới tác. .. giảm từ 8,1 xuống 7,33, với dịch tụy đơn thuần (không có mật) cần thời gian là 10 phút, với dịch tuỵ có mật lợn cần 7 phút, nhưng với dịch tuỵ có mật gấu chỉ cần có 2 phút, bằng 1/5 thời gian so với mẫu so với mẫu chứng Qua đó ta thấy có thể mật gấu đã có tác dụng hoạt hoá lipase dịch tụy và nhũ tương hoá lipid trong sữa Điều này phù hợp với tác dụng kích thích tiêu hoá của mật gấu 30 2.3 NHẬN XÉT TổNG... chúng tôi có thể mật gấu đã ức chế một số yếu tố trong quá trình đông máu □ Chứng ■ Mật gấu t (giây) 18 15 12 9 6 3 Hình 2.5 Ả nh hưởng của mật gấu đến thời gian Howell 27 2.2.3 Tác dụng của mật gấu tới thời gian tiêu ỉibrin Thử nghiệm được tiến hành trên 15 mẫu huyết tương khác nhau Sau khi đã thăm dò lượng mật gấu thích hợp cho một thử nghiệm, chúng tôi đã xác định được lượng mật gấu cần thiết là... hơn giá trị t tương ứng với p = 0,01 thì độ tin cậy đạt trên 99% Nếu t lớn hơn giá trị t tương ứng với p = 0,001 thì độ tin cậy đạt trên 99,9% 19 2.2 KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u VÀ NHẬN XÉT 2.2.1 Phân tách thành phần của mật gấu và so sánh vớỉ một số mật khác bằng phương pháp SKLM a Phân tách thành phần của mật gấu bằng phương pháp SKLM: - Quá trình sắc ký được tiến hành trên chất hấp phụ là silicagel aluminum ... gấu sơ phân biệt với sô' mật khác với mục tiêu là: - Góp phần tìm hiểu tác dụng chống đông máu tác dụng trình thủy phân triglycerid mật gấu - Sơ phân tách thành phần mật gấu phân biệt với số mật. .. thêm tác dụng sinh học mật gấu sơ phân biệt mật gấu thật hay giả Nhưng kết bước đầu, thấy cần nghiên cứu tiếp tác dụng khác thành phần mật gấu 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO * Tiếng Việt: Bộ môn Dược học. .. hiệu để phân biệt mật gấu thật hay giả, đặc biệt với mật gấu giả dùng mật bò, mật lợn (sắc ký đồ có số vết nhiều mật gấu thật) Mật gấu có tác dụng chống đông máu tiêu fibrin thể qua tác dụng kéo