nghiên cứu tác dụng sinh học và độc tính của cây lược vàng callisia fragrans (lindl.) woods.

BỘ Y TẾ BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG SINH HỌC VÀ ĐỘC TÍNH CỦA CÂY LƯỢC VÀNG CALLISIA FRAGRANS (LINDL.) WOODS. Chủ nhiệm đề tài: TSKH. Nguyễn Minh Khởi Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Dược liệu 8852 Năm 2010 NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT ALT Alanine aminotransferase AST Aspartate aminotransferase BCMTT Bạch cầu múi trung tính BSA Bovine Serum Albumin CD Cluter of differentiation cs. Cộng sự CY Cyclophosphamid DMSO Dimethylsulfoxyd ĐƯMD Đáp ứng miễn dịch HCC Hồng cầu cừu HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao IL Interleukin INF Interferon KN Kháng nguyên KTMD Kích thích miễn dịch LVL Cao đông khô dịch ép lá lược vàng LVT Cao chiết bằng cồn 50% thân bồ lược vàng MDA Malonyl dialdehyd MHC Major histocompatibility complex NK Natural killer OA Ovalbumin TBTHHMC Tế bào lympho lách tạo hoa hồng mẫn cảm TBTQDH Tế bào lympho lách tạo quầng dung huyết MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ 1 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Thực vật học 3 1.2. Thành phần hóa học của chi Callisia Loefling 4 1.3. Tác dụng sinh học của các cây thuốc chi Callisia Loefling 8 1.4. Tác dụng sinh học của một số chất có trong C. fragrans 10 1.5. Một số chế phẩm chứa lược vàng 24 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1. Đối tượng nghiên cứu 25 2.2. Nguyên vật liệu 25 2.3. Phương pháp nghiên cứu 27 2.3.1. Phương pháp lấ y mẫu nguyên liệu và xác định về thực vật 27 2.3.2. Phương pháp thử độc tính cấp 28 2.3.3. Phương pháp thử độc tính bán trường diễn 28 2.3.4. Phương pháp thử tác dụng kháng khuẩn 30 2.3.5. Phương pháp thử tác dụng chống viêm mạn 33 2.3.6. Phương pháp thử tác dụng giảm đau 34 2.3.6.1. Thực nghiệm gây đau bằng tấm nóng 34 2.3.6.2. Thực nghiệm gây đau xoắn bụng bằng acid acetic 35 2.3.7. Phương pháp thử tác dụng tăng cường miễn d ịch 36 2.3.7.1.Mô hình gây suy giảm miễn dịch bằng hoá chất 37 2.3.7.2. Mô hình gây suy giảm miễn dịch bằng tia xạ 37 2.3.8. Phương pháp thử tác dụng hạ huyết áp 41 2.3.9. Phương pháp thử tác dụng chống oxy hóa in vivo 42 2.3.10. Phương pháp thử tác dụng trên enzym xanthine oxidase và lypoxigenase 43 2.3.11. Phương pháp thử tác dụng độc tế bào in vitro 45 2.3.12. Phương pháp xử lý số liệu 47 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 48 3.1. Kết quả nghiên cứu độc tính của lá và thân bồ lược vàng 48 3.1.1. Kết quả thử độc tính cấp 48 3.1.2. Kết quả thử độc tính bán trường diễn 49 3.1.2.1. Kết quả theo dõi tình trạng chung và cân nặng động vật thí nghiệm. 49 3.1.2.2. Kết quả theo dõi các chỉ số huyết học 51 3.1.2.3.Kết quả theo dõi các chỉ số thuộc chức năng gan 54 3.1.2.4.Kết quả theo dõi các chỉ số thuộc chức năng thận 59 3.1.2.5. Kết quả xét nghiệm mô học 61 3.2. Kết quả nghiên cứu một số tác dụng sinh học củ a lá và thân bồ lược vàng 64 3.2.1. Kết quả thử tác dụng kháng khuẩn 64 3.2.1.1. Kết quả thử trên chủng S. pneumoniae 64 3.2.5.2. Kết quả thử trên chủng K. pneumoniae 66 3.2.1.3. Kết quả thử trên chủng H.influenza 68 3.2.1.4. Kết quả thử trên chủng S. aureus 70 3.2.1.4. Kết quả thử trên chủng P. aeruginosa 72 3.2.2. Kết quả thử tác dụng chống viêm mạn 74 3.2.3. Kết quả thử tác dụng giảm đau 75 3.2.3.1. Tác dụng giảm đau trên mô hình gây đau xoắn bụng bằng acid acetic 75 3.2.3.2. Tác dụng giảm đau trên mô hình gây đau bằng tấm nóng 76 3.2.4. Kết quả thử tác dụng tăng cường miễn dịch 79 3.2.4.1.Kết quả thử tác dụng trên mô hình gây suy giảm miễn dịch bằng hóa chất 79 3.2.4.1.1. Nghiên cứu đánh giá tình trạng chung hệ miễn dịch 79 3.2.4.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của LVL và LVT lên đáp ứng miễn dịch d ịch thể với kháng nguyên 82 3.2.4.1.3. Nghiên cứu đánh giá đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào 85 3.2.4.2. Kết quả thử tác dụng trên mô hình gây suy giảm miễn dịch bằng tia xạ 88 3.2.4.2.1. Nghiên cứu đánh giá tình trạng chung của hệ miễn dịch 88 3.2.4.2.2. Nghiên cứu đánh giá đáp ứng miễn dịch dịch thể 92 3.2.4.2.3. Nghiên cứu đánh giá đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào 3.2.5. Kết quả thử tác dụng hạ huy ết áp 97 3.2.6. Kết quả thử tác dụng chống oxy hóa in vivo 102 3.2.7. Kết quả thử tác dụng trên enzym xanthine oxidase và 104 lypoxigenase in vitro 3.2.7.1. Hoạt tính ức chế enzym xanthine oxidase của các mẫu chiết từ lá và thân bồ lược vàng 104 3.2.7.2. Hoạt tính ức chế enzym lipoxygenase của các mẫu chiết từ lá và thân bồ lược vàng 105 3.2.8. Kết quả thử tác dụng độc tế bào của các mẫu chiết từ lá và thân bồ lược vàng 106 3.2.8.1. Kết quả thử độc tính của các mẫu chiết từ lá và thân bồ lược vàng trên dòng tế bào A549 106 3.2.8.2. Kết quả thử độc tính của các mẫu chiết từ lá và thân bồ lược vàng trên dòng tế bào H358 107 3.2.8.3. Kết quả thử độc tính của các mẫu chiết từ lá và thân bồ lược vàng trên dòng tế bào Hela 108 3.2.8.4. Kết quả thử độc tính của các mẫu chiết từ lá và thân bồ lược vàng trên dòng tế bào H460 109 3.2.8.5. Kết quả thử độc tính của các mẫu chiết từ lá và thân bồ lược vàng trên dòng tế bào Hep-G2 110 3.2.8.6. Kết quả th ử độc tính của các mẫu chiết từ lá và thân bồ lược vàng trên dòng tế bào Cos-7 111 3.2.8.7. Kết quả thử độc tính của các mẫu chiết từ lá và thân bồ lược vàng trên dòng tế bào MCF-7 112 3.2.8.8. Kết quả thử độc tính của các mẫu chiết từ lá và thân bồ lược vàng trên tế bào dòng KPL-4 113 4. BÀN LUẬN 115 5. KẾT LUẬN 136 6. KIẾN NGHỊ 138 TÀI LIỆU THAM KHẢO 139 PHỤ LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Cây lược vàng là một cây cảnh mới được du nhập vào nước ta trong những năm gần đây. Từ năm 2006, bắt đầu rộ lên thông tin một số người dân ở Thanh Hóa sử dụng lược vàng làm thuốc dựa trên một số tài liệu không chính thức của Nga để chữa nhiều chứng bệnh khác nhau thấy có hiệu quả như viêm đường hô hấp, viêm răng lợi, viêm đường tiết niệu, bệnh dạ dày, đau xương khớp, các bệnh tim mạch, huyết áp thậm chí cả ung thư…. Từ đó, “cơn sốt lược vàng” bắt đầu bùng phát ở Thanh Hóa, sau đó lan truyền ra nhiều tỉnh và thành phố, từ Bắc chí Nam. Ở Việt Nam, lược vàng là đối tượng hoàn toàn mới chưa từng có tên trong một tài liệu về cây thuốc nào, thậm chí chưa có tài liệu về thực vật học nào đề cập đến. Ở Nga đã có mộ t số kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học nhưng nghiên cứu về tác dụng sinh học của lược vàng còn rất ít. Mặc dù vậy, cây lược vàng hiện vẫn đang được ứng dụng rất rộng rãi để chữa các bệnh dạ dày – ruột, bệnh túi mật, lá lách; các bệnh đường hô hấp như ho, viêm họng, viêm phế quản, hen phế quản; các bệnh đường tiết niệu; các bệnh ngoài da như viêm da, zona, chàm, làm thuốc giảm đau, chống nóng rát, giúp vết thương chóng lành Các sách báo về lược vàng, các loại thuốc chữa bệnh, thực phẩm chức năng với lược vàng là dược liệu chính đang xuất hiện ngày càng nhiều [41], [42], [43]. Nhìn chung, lược vàng hầu như mới chỉ được dùng theo kinh nghiệm dân gian, chưa được nghiên cứu đầy đủ về mặt dược liệu học. Để có thể sử dụng lược vàng làm thuốc mộ t cách hiệu quả và an toàn thì việc nghiên cứu thử nghiệm tác dụng sinh học, xác định độ an toàn của dược liệu là một việc làm cần thiết. Trước nhu cầu bức thiết về thông tin khoa học của nhân dân, được phép của Bộ Y tế, Vụ KH-ĐT Bộ Y tế, Viện Dược liệu tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu tác dụng sinh học và độc tính của cây lược vàng Callisia fragrans (Lindl.) Woods.” M ục tiêu của đề tài: - Đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn của thân bồ và lá lược vàng. - Đánh giá một số tác dụng sinh học của thân bồ và lá lược vàng. Nội dung nghiên cứu: 1 Xác định độ an toàn của dược liệu: - Thử độc tính cấp của cao chiết toàn phần từ lá và thân bồ lược vàng. - Thử độc tính bán trường diễn của các cao chiết trên, mỗi mẫu 3 liều (kéo dài thời gian uống thuốc của thỏ thí nghiệm lên 60 ngày) 2. Thử một số tác dụng sinh học của các mẫu cao chiết từ thân và lá lược vàng trên thực nghiệm, mỗi mẫu 2-3 liều: - Tác dụng kháng khuẩn (trên một số chủng vi khuẩn điển hình thườ ng gây viêm răng lợi, viêm họng, viêm phế quản) - Tác dụng chống viêm, giảm đau - Tác dụng tăng cường miễn dịch trên 2 mô hình thực nghiệm: gây suy giảm miễn dịch bằng hóa chất và bằng tia xạ. - Tác dụng hạ huyết áp - Tác dụng chống oxy hóa - Tác dụng độc tế bào (trên 8 dòng tế bào gây ung thư) 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Thực vật học 1.1.1. Vài nét về chi Callisia Loefling Callisia Loefling là một chi nhỏ thuộc họ Commelinaceae (Thài lài). Chi này có khoảng 20 loài tập trung ở châu Mỹ với trung tâm phân bố là Mexico. Những loài thuộc chi có dạng thân thảo, sống nhiều năm hiếm khi là cây một năm. Rễ mảnh, vài loài có dạng củ. Thân trườn hoặc bò sát đất. Lá lưỡng phân hoặc xếp xoắn ở ngọn, không cuống. Cụm hoa dạng xim, như tán, xếp xít, không cuống, được bao bởi lá bắ c; phát hoa ở ngọn hoặc nách lá, thường gồm nhiều chùy hoặc gié, đơn vị được tạo thành bởi các cặp xim. Lá bắc khó nhận, nhỏ hơn 1cm; không có mo; có các lá dạng lá bắc tồn tại. Hoa lưỡng tính (cả lưỡng tính và có hoa đực ở C. repens), đối xứng tỏa tròn; đài rời, gần bằng nhau; cánh hoa rời, trắng hoặc hồng (hiếm khi có màu xanh), dài bằng nhau, có dạng vuốt; nhị (1-3) hoặc 6, hữu thụ, bằng nhau; chỉ nhị trơn hoặc có rãnh; bầu 2-3 ô, lá noãn (1) 2 mỗi ô. Quả nang, 2-3 mảnh. Hạt (1) 2 hoặc 3 mỗi mảnh, có dạng hình trụ ngắn, rốn hạt dạng điểm [34]. Đa số các loài thuộc chi Callisia được trồng làm cảnh như Callisia repens (Jacquin) Linnaeus, Callisia elegans Alexander ex H. E. Moore Ở Trung Quốc chỉ có 1 loài là Callisia repens (Jacquin) Linnaeus được nhập trồng làm cảnh ở Hồng Kông [33]. Ở Việt Nam, chưa phát hiện thấy các loài thuộc chi này phân bố trong tự nhiên. Trong vài n ăm trở lại đây loài Callisia fragrans (Lindl.) Woods. được nhập trồng vào nước ta với tên gọi là lan vòi hay lược vàng. 1.1.2. Loài Callisia fragrans (Lindl.) Woods. Đặc điểm thực vật: Callisia fragrans (Lindl.) Woods. là cây thảo nhiều năm, thân mọng nước có thể dài tới 100cm hoặc hơn, phân nhánh với thân bò ở gốc. Lá mọc tập trung ở ngọn thân; rải rác ở phía dưới, dạng mác thuôn, dài 18-25cm, rộng 3,5-4cm, cuống lá có gân rõ, ôm thân, có lông mịn và thường có sọc tía. Hoa mọc thành cụm 2-3 hoa dạng xim trên phát hoa hình chu ỳ dài tới 60cm, mỗi cặp xim được ôm bởi các lá bắc dạng răng cưa (3 răng) dài 10-15mm; lá đài trong suốt, màu trắng, khô xác, dạng mác, dài 5-6mm; cánh hoa bóng, trong suốt, màu trắng, mỏng, có dạng trứng hẹp; nhị 6. Cây ra hoa vào mùa xuân [34]. Cây ưa những nơi đất màu mỡ, ẩm, thoát nước tốt và che bóng một phần. Nếu trồng ở nơi nhiều ánh sáng, lá thường chuyển sang màu tía và thân mọc thấp. Cây được nhân trồng bằng hạt và cành giâm. Callisia fragrans được trồng làm cảnh ở nhiều nước bởi có thân bò khá đẹp và dễ trồng. Người ta thường trồng Callisia fragrans trong các chậu treo để thân buông rủ tạo dáng hoặc phủ kín mặt đất tạo thảm xanh trong vườn nhà. Do khả năng phát triển nhanh, ở Florida - Mỹ, loài cây này được xếp vào danh sách “Các loài thực vật nhập trồng xâm lấn” [45]. 1.2. Thành phần hóa học của chi Callisia Loefling Trong các loài Callisia có một số loài như C. elegans, C. fragrans, C. insignis, C. macdougallii, C. repens, C. soconusensis đã được Maria A và cs. khảo sát sơ bộ bằng sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng cho thấy đều có chứa flavon C- glycosid, một nhóm chất thường gặp trong các cây thuộc họ Commelinaceae [67]. Lá của các loài C. elegans, C. insignis, C. macdougallii được xác định có cyanidin 3,7,3’-triglucosid acyl hóa [46]. Từ năm 2007, các tác giả Nga và Việt Nam bắt đầu nghiên cứu sâu về thành phần hóa học loài C. fragrans và cho thấy loài cây này chứa nhiều các nhóm chất khác nhau như chất béo, carotenoid, terpenoid, acid hữu cơ, hợp chất phenol, flavonoid, dẫ n chất anthocyan, acid amin, đường tự do và polysaccharid [25], [77], [78], [104]. Dưới đây là tổng hợp các kết quả nghiên cứu hóa học về loài cây này. Các hợp chất phenol Bằng phương pháp sắc ký cột kết hợp sắc ký lớp mỏng điều chế, Olennikov D.N. và cs đã phân lập được từ dịch ép thân bồ lược vàng 7 hợp chất phenol là aloe-emodin, umbelliferon, scopoletin, quercetin, acid gallic, acid caffeic và acid chicoric [77]. Aloe emodin C 15 H 10 O 5 Umbelliferon C 9 H 6 O 3 Scopoletin C 10 H 8 O 4 Quercetin C 15 H 10 O 7 Acid gallic C 7 H 6 O 5 Acid caffeic C 9 H 8 O 4 Acid chicoric C 22 H 18 O 12 Khi phân tích dịch ép này bằng HPLC, đối chiếu với các chất chuẩn đã biết, đã xác định ngoài 7 chất nói trên còn có kaempferol, acid ferulic [78]. Kết quả định lượng cho thấy hàm lượng các nhóm hợp chất phenol chính trong dịch ép này (so với cắn khô kiệt) là: coumarin (umbelliferon, scopoletin) 0,14%, anthraquinon (aloe-emodin) 0,008%, acid phenolic (acid gallic, caffeic và chicoric) 0,37%, flavonoid (kaempferol, quercetin) 0,05% [78]. Năm 2009, Châu Văn Minh và cs. đã công bố phân lập được 1 hợp chất flavon C-glycosid là isoorientin từ dịch chiết methanol toàn cây lược vàng [14]. [...]... virus type 2 (HSV-2) với trị số EC50 = 10,5 µg/ml [19] 1.4 Tác dụng sinh học của một số chất có trong C fragrans Các chất đã được biết có trong lược vàng đều là những chất quen biết đã được phân lập từ nhiều cây thuốc khác và đã được nghiên cứu chứng minh có nhiều tác dụng sinh học đáng chú ý Sau đây là một số kết quả nghiên cứu về tác dụng sinh học của các hợp chất này Quercetin Quercetin là một flavonoid... trong đó Ba, Mn và Cu có hàm lượng cao nhất [74] Nhìn chung, chi Callisia còn ít loài được nghiên cứu về thành phần hóa học, chỉ có loài C fragrans được chú ý nghiên cứu Mặc dù mới được bắt đầu nghiên cứu từ 2007, nhưng cho đến nay các tác giả Nga và Việt Nam đã có được khá nhiều kết quả về thành phần hóa học của cây lược vàng C fragrans này với 10 chất đã được phân lập và xác định cấu trúc và những phân... một chất có nhiều tác dụng sinh học đáng chú ý như tác dụng chống viêm, chống oxy hóa, chống lão hóa, tác dụng bảo vệ gan, điều biến miễn dịch và phòng chống ung thư Hoạt tính chống oxy hóa, chống lão hóa của quercetin được nghiên cứu khá kỹ trong một số nghiên cứu gần đây Quercetin và dẫn xuất của nó, cụ thể là quercetin caprylat (QU-CAP) là một chất hoạt hóa mạnh proteasom, với tác dụng chống oxy hóa,... Cây hoàn ngọc (rễ, thân, lá) 40%, Cúc hoa 20%, Kim ngân hoa 20%, Cây lược vàng 20% Chức năng: Hỗ trợ điều trị rối loạn tiêu hóa, thanh nhiệt giải độc cho cơ thể Cách sử dụng: Mỗi lần cho túi lọc vào cốc nước sôi, sau 3-5 phút là uống được, có thể uống nhiều lần, dùng thay nước uống hằng ngày 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là lá và thân bồ lược vàng. .. Như vậy, tác dụng điều biến miễn dịch của quercetin cũng góp phần chống xơ vữa động mạch [73] Một tác dụng khác của quercetin cũng được quan tâm nhiều là tác dụng chống viêm Quercetin ức chế đáng kể mức độ mARN của iNOS, COX-2 và CRP của tế bào gan Chang Flavonoid này cũng có tác dụng ức chế trên NF-kappaB hoạt động và trên protein cô đặc của mẫu phosphoryl hóa của chất ức chế IkappaB alpha và IKK (IkappaB... isoorientin còn thể hiện những nhiều tác dụng khác như bảo vệ gan, thận [35], [79] Scopoletin Scopoletin là một coumarin có nhiều tác dụng sinh học Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy rằng scopoletin có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm khớp, chống ung thư, làm hạ huyết áp và có tác dụng chống trầm cảm Năm 2003, Shaw CY và cộng sự đã tiến hành thử tác dụng chống oxy hóa của scopoletin phân lập từ Sinomonium... Văn Kiệm và cs phân lập từ cây lược vàng trồng tại Việt Nam [13] Ginsenosid Rg1 Các acid hữu cơ Ngoài các acid phenolic nói trên, trong thân và lá cây lược vàng có acid ascorbic [77][78] Hàm lượng tổng các acid hữu cơ trong dịch ép thân bồ lược vàng là 37,05% so với cắn khô kiệt [78] Dầu béo Phân tích dầu béo trong thân và lá C fragrans, Chernenco T.V và cs thấy có [25]: - Phân đoạn trung tính: hydrocarbon... Trong mô gan và thận của chuột bị tiểu đường TC, TG, FFA, và PL có nồng độ cao Ở chuột được điều trị tiểu đường bằng umbelliferon, các chỉ số TC, TG, PL và FFA trong huyết tương và mô; và LDL-C, VLDL-C, và HDL-C huyết tương gần trở lại như bình thường [85] Aloe emodin Aloe emodin là một hydroxyanthraquinon, có một số tác dụng sinh học đáng chú ý như tác dụng chống viêm, chống virus và tác dụng chống... nhiều tác dụng sinh học tương tự như quercetin Nó cũng có tác dụng chống oxy hóa và chống viêm; ngoài ra còn có tác dụng gây chết tế bào theo chương trình (apoptosis) trên nhiều dòng tế bào ung thư Giống như quercetin, tác dụng chống viêm của kaempferol một phần là do tác dụng điều chỉnh iNOS, COX-2 và CRP trong tế bào gan Chang thông qua các cơ chế có liên quan đến việc phong tỏa NF-kappaB hoạt động và. .. tìm thấy một số công bố trong 2 năm gần đây của các tác giả Nga về C fragrans và một bài báo nói đến tác dụng chống herpes virus của dịch chiết cồn C grasilis Sau đây là những kết quả cụ thể Tác dụng chống oxy hóa Dịch ép thân bồ của loài C fragrans có tác dụng chống oxy hóa in vitro trên mô hình thử nghiệm với DPPH với IC50 = 1,07mg/ml Các phân đoạn có tác dụng mạnh nhất lần lượt là phân đoạn chiết . học của nhân dân, được phép của Bộ Y tế, Vụ KH-ĐT Bộ Y tế, Viện Dược liệu tiến hành thực hiện đề tài Nghiên cứu tác dụng sinh học và độc tính của cây lược vàng Callisia fragrans (Lindl. ) Woods. ”. BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG SINH HỌC VÀ ĐỘC TÍNH CỦA CÂY LƯỢC VÀNG CALLISIA FRAGRANS (LINDL. ) WOODS. Chủ nhiệm đề tài:. M ục tiêu của đề tài: - Đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn của thân bồ và lá lược vàng. - Đánh giá một số tác dụng sinh học của thân bồ và lá lược vàng. Nội dung nghiên cứu: 1 Xác