Thử một số tác dụng sinh học của các mẫu cao chiết từ thân và lá lược vàng trên thực nghiệm, mỗi mẫu 2-3 liều: - Tác dụng kháng khuẩn trên một số chủng vi khuẩn điển hình thường gây viê
Trang 1BỘ Y TẾ
BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ
NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG SINH HỌC VÀ ĐỘC TÍNH CỦA CÂY LƯỢC VÀNG
CALLISIA FRAGRANS (LINDL.) WOODS.
Chủ nhiệm đề tài: TSKH Nguyễn Minh Khởi
Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Dược liệu
8852
Năm 2010
Trang 2NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT
BCMTT Bạch cầu múi trung tính
BSA Bovine Serum Albumin
LVL Cao đông khô dịch ép lá lược vàng
LVT Cao chiết bằng cồn 50% thân bồ lược vàng MDA Malonyl dialdehyd
MHC Major histocompatibility complex
OA Ovalbumin
TBTHHMC Tế bào lympho lách tạo hoa hồng mẫn cảm TBTQDH Tế bào lympho lách tạo quầng dung huyết
Trang 31.2 Thành phần hóa học của chi Callisia Loefling 4
1.3 Tác dụng sinh học của các cây thuốc chi Callisia Loefling 8
1.4 Tác dụng sinh học của một số chất có trong C fragrans 10
2.3.1 Phương pháp lấy mẫu nguyên liệu và xác định về thực vật 272.3.2 Phương pháp thử độc tính cấp 282.3.3 Phương pháp thử độc tính bán trường diễn 282.3.4 Phương pháp thử tác dụng kháng khuẩn 302.3.5 Phương pháp thử tác dụng chống viêm mạn 332.3.6 Phương pháp thử tác dụng giảm đau 34
2.3.6.2 Thực nghiệm gây đau xoắn bụng bằng acid acetic 352.3.7 Phương pháp thử tác dụng tăng cường miễn dịch 362.3.7.1.Mô hình gây suy giảm miễn dịch bằng hoá chất 372.3.7.2 Mô hình gây suy giảm miễn dịch bằng tia xạ 37
2.3.9 Phương pháp thử tác dụng chống oxy hóa in vivo 42
2.3.10 Phương pháp thử tác dụng trên enzym xanthine oxidase và
lypoxigenase
43
2.3.11 Phương pháp thử tác dụng độc tế bào in vitro 45
2.3.12 Phương pháp xử lý số liệu 47
3.1 Kết quả nghiên cứu độc tính của lá và thân bồ lược vàng 48
Trang 43.1.2 Kết quả thử độc tính bán trường diễn 493.1.2.1 Kết quả theo dõi tình trạng chung và cân nặng động vật thí
nghiệm
49
3.1.2.2 Kết quả theo dõi các chỉ số huyết học 513.1.2.3.Kết quả theo dõi các chỉ số thuộc chức năng gan 543.1.2.4.Kết quả theo dõi các chỉ số thuộc chức năng thận 593.1.2.5 Kết quả xét nghiệm mô học 61
3.2 Kết quả nghiên cứu một số tác dụng sinh học của lá và thân bồ
3.2.2 Kết quả thử tác dụng chống viêm mạn 74
3.2.3.1 Tác dụng giảm đau trên mô hình gây đau xoắn bụng bằng acid
acetic
75
3.2.3.2 Tác dụng giảm đau trên mô hình gây đau bằng tấm nóng 76
3.2.4 Kết quả thử tác dụng tăng cường miễn dịch 793.2.4.1.Kết quả thử tác dụng trên mô hình gây suy giảm miễn dịch bằng
3.2.5 Kết quả thử tác dụng hạ huyết áp 97
3.2.6 Kết quả thử tác dụng chống oxy hóa in vivo 102
3.2.7 Kết quả thử tác dụng trên enzym xanthine oxidase và 104
Trang 53.2.8.1 Kết quả thử độc tính của các mẫu chiết từ lá và thân bồ lược vàng
trên dòng tế bào A549
106
3.2.8.2 Kết quả thử độc tính của các mẫu chiết từ lá và thân bồ lược vàng
trên dòng tế bào H358
107
3.2.8.3 Kết quả thử độc tính của các mẫu chiết từ lá và thân bồ lược vàng
trên dòng tế bào Hela
108
3.2.8.4 Kết quả thử độc tính của các mẫu chiết từ lá và thân bồ lược vàng
trên dòng tế bào H460
109
3.2.8.5 Kết quả thử độc tính của các mẫu chiết từ lá và thân bồ lược vàng
trên dòng tế bào Hep-G2
110
3.2.8.6 Kết quả thử độc tính của các mẫu chiết từ lá và thân bồ lược vàng
trên dòng tế bào Cos-7
Trang 6ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây lược vàng là một cây cảnh mới được du nhập vào nước ta trong những năm gần đây Từ năm 2006, bắt đầu rộ lên thông tin một số người dân ở Thanh Hóa sử dụng lược vàng làm thuốc dựa trên một số tài liệu không chính thức của Nga để chữa nhiều chứng bệnh khác nhau thấy có hiệu quả như viêm đường hô hấp, viêm răng lợi, viêm đường tiết niệu, bệnh dạ dày, đau xương khớp, các bệnh tim mạch, huyết áp thậm chí cả ung thư… Từ đó, “cơn sốt lược vàng” bắt đầu bùng phát ở Thanh Hóa, sau đó lan truyền ra nhiều tỉnh và thành phố, từ Bắc chí Nam
Ở Việt Nam, lược vàng là đối tượng hoàn toàn mới chưa từng có tên trong một tài liệu về cây thuốc nào, thậm chí chưa có tài liệu về thực vật học nào đề cập đến
Ở Nga đã có một số kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học nhưng nghiên cứu về tác dụng sinh học của lược vàng còn rất ít Mặc dù vậy, cây lược vàng hiện vẫn đang được ứng dụng rất rộng rãi để chữa các bệnh dạ dày – ruột, bệnh túi mật, lá lách; các bệnh đường hô hấp như ho, viêm họng, viêm phế quản, hen phế quản; các bệnh đường tiết niệu; các bệnh ngoài da như viêm da, zona, chàm, làm thuốc giảm đau, chống nóng rát, giúp vết thương chóng lành Các sách báo về lược vàng, các loại thuốc chữa bệnh, thực phẩm chức năng với lược vàng là dược liệu chính đang xuất hiện ngày càng nhiều [41], [42], [43]
Nhìn chung, lược vàng hầu như mới chỉ được dùng theo kinh nghiệm dân gian, chưa được nghiên cứu đầy đủ về mặt dược liệu học Để có thể sử dụng lược vàng làm thuốc một cách hiệu quả và an toàn thì việc nghiên cứu thử nghiệm tác dụng sinh học, xác định độ an toàn của dược liệu là một việc làm cần thiết Trước nhu cầu bức thiết về thông tin khoa học của nhân dân, được phép của Bộ Y tế, Vụ
KH-ĐT Bộ Y tế, Viện Dược liệu tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu tác dụng
sinh học và độc tính của cây lược vàng Callisia fragrans (Lindl.) Woods.”
Mục tiêu của đề tài:
- Đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn của thân bồ và lá lược vàng
- Đánh giá một số tác dụng sinh học của thân bồ và lá lược vàng
Nội dung nghiên cứu:
1 Xác định độ an toàn của dược liệu:
Trang 7- Thử độc tính cấp của cao chiết toàn phần từ lá và thân bồ lược vàng
- Thử độc tính bán trường diễn của các cao chiết trên, mỗi mẫu 3 liều (kéo dài thời gian uống thuốc của thỏ thí nghiệm lên 60 ngày)
2 Thử một số tác dụng sinh học của các mẫu cao chiết từ thân và lá lược vàng trên thực nghiệm, mỗi mẫu 2-3 liều:
- Tác dụng kháng khuẩn (trên một số chủng vi khuẩn điển hình thường gây viêm răng lợi, viêm họng, viêm phế quản)
- Tác dụng chống viêm, giảm đau
- Tác dụng tăng cường miễn dịch trên 2 mô hình thực nghiệm: gây suy giảm miễn dịch bằng hóa chất và bằng tia xạ
- Tác dụng hạ huyết áp
- Tác dụng chống oxy hóa
- Tác dụng độc tế bào (trên 8 dòng tế bào gây ung thư)
Trang 81 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Thực vật học
1.1.1 Vài nét về chi Callisia Loefling
Callisia Loefling là một chi nhỏ thuộc họ Commelinaceae (Thài lài) Chi này
có khoảng 20 loài tập trung ở châu Mỹ với trung tâm phân bố là Mexico Những loài thuộc chi có dạng thân thảo, sống nhiều năm hiếm khi là cây một năm Rễ mảnh, vài loài có dạng củ Thân trườn hoặc bò sát đất Lá lưỡng phân hoặc xếp xoắn ở ngọn, không cuống Cụm hoa dạng xim, như tán, xếp xít, không cuống, được bao bởi lá bắc; phát hoa ở ngọn hoặc nách lá, thường gồm nhiều chùy hoặc gié, đơn vị được tạo thành bởi các cặp xim Lá bắc khó nhận, nhỏ hơn 1cm; không
có mo; có các lá dạng lá bắc tồn tại Hoa lưỡng tính (cả lưỡng tính và có hoa đực ở
C repens), đối xứng tỏa tròn; đài rời, gần bằng nhau; cánh hoa rời, trắng hoặc hồng (hiếm khi có màu xanh), dài bằng nhau, có dạng vuốt; nhị (1-3) hoặc 6, hữu thụ, bằng nhau; chỉ nhị trơn hoặc có rãnh; bầu 2-3 ô, lá noãn (1) 2 mỗi ô Quả nang, 2-3 mảnh Hạt (1) 2 hoặc 3 mỗi mảnh, có dạng hình trụ ngắn, rốn hạt dạng điểm [34]
Đa số các loài thuộc chi Callisia được trồng làm cảnh như Callisia repens (Jacquin) Linnaeus, Callisia elegans Alexander ex H E Moore Ở Trung Quốc chỉ có 1 loài là Callisia repens (Jacquin) Linnaeus được nhập trồng làm cảnh ở Hồng Kông [33] Ở Việt Nam, chưa phát hiện thấy các loài thuộc chi này phân bố
trong tự nhiên Trong vài năm trở lại đây loài Callisia fragrans (Lindl.) Woods
được nhập trồng vào nước ta với tên gọi là lan vòi hay lược vàng
1.1.2 Loài Callisia fragrans (Lindl.) Woods
Đặc điểm thực vật: Callisia fragrans (Lindl.) Woods là cây thảo nhiều năm,
thân mọng nước có thể dài tới 100cm hoặc hơn, phân nhánh với thân bò ở gốc Lá mọc tập trung ở ngọn thân; rải rác ở phía dưới, dạng mác thuôn, dài 18-25cm, rộng 3,5-4cm, cuống lá có gân rõ, ôm thân, có lông mịn và thường có sọc tía Hoa mọc thành cụm 2-3 hoa dạng xim trên phát hoa hình chuỳ dài tới 60cm, mỗi cặp xim được ôm bởi các lá bắc dạng răng cưa (3 răng) dài 10-15mm; lá đài trong suốt, màu trắng, khô xác, dạng mác, dài 5-6mm; cánh hoa bóng, trong suốt, màu trắng, mỏng, có dạng trứng hẹp; nhị 6 Cây ra hoa vào mùa xuân [34]
Cây ưa những nơi đất màu mỡ, ẩm, thoát nước tốt và che bóng một phần Nếu trồng ở nơi nhiều ánh sáng, lá thường chuyển sang màu tía và thân mọc thấp Cây được nhân trồng bằng hạt và cành giâm
Trang 9Callisia fragrans được trồng làm cảnh ở nhiều nước bởi có thân bò khá đẹp
và dễ trồng Người ta thường trồng Callisia fragrans trong các chậu treo để thân
buông rủ tạo dáng hoặc phủ kín mặt đất tạo thảm xanh trong vườn nhà Do khả năng phát triển nhanh, ở Florida - Mỹ, loài cây này được xếp vào danh sách “Các loài thực vật nhập trồng xâm lấn” [45]
1.2 Thành phần hóa học của chi Callisia Loefling
Trong các loài Callisia có một số loài như C elegans, C fragrans, C insignis, C macdougallii, C repens, C soconusensis đã được Maria A và cs khảo
sát sơ bộ bằng sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng cho thấy đều có chứa flavon glycosid, một nhóm chất thường gặp trong các cây thuộc họ Commelinaceae [67]
C-Lá của các loài C elegans, C insignis, C macdougallii được xác định có cyanidin
3,7,3’-triglucosid acyl hóa [46]
Từ năm 2007, các tác giả Nga và Việt Nam bắt đầu nghiên cứu sâu về thành
phần hóa học loài C fragrans và cho thấy loài cây này chứa nhiều các nhóm chất
khác nhau như chất béo, carotenoid, terpenoid, acid hữu cơ, hợp chất phenol, flavonoid, dẫn chất anthocyan, acid amin, đường tự do và polysaccharid [25], [77], [78], [104] Dưới đây là tổng hợp các kết quả nghiên cứu hóa học về loài cây này
Các hợp chất phenol
Bằng phương pháp sắc ký cột kết hợp sắc ký lớp mỏng điều chế, Olennikov D.N và cs đã phân lập được từ dịch ép thân bồ lược vàng 7 hợp chất phenol là aloe-emodin, umbelliferon, scopoletin, quercetin, acid gallic, acid caffeic và acid chicoric [77]
Aloe emodin C15H10O5 Umbelliferon C9H6O3
Trang 10Khi phân tích dịch ép này bằng HPLC, đối chiếu với các chất chuẩn đã biết,
đã xác định ngoài 7 chất nói trên còn có kaempferol, acid ferulic [78]
Kết quả định lượng cho thấy hàm lượng các nhóm hợp chất phenol chính trong dịch ép này (so với cắn khô kiệt) là: coumarin (umbelliferon, scopoletin) 0,14%, anthraquinon (aloe-emodin) 0,008%, acid phenolic (acid gallic, caffeic và chicoric) 0,37%, flavonoid (kaempferol, quercetin) 0,05% [78]
Năm 2009, Châu Văn Minh và cs đã công bố phân lập được 1 hợp chất flavon C-glycosid là isoorientin từ dịch chiết methanol toàn cây lược vàng [14]
Trang 11Các acid hữu cơ
Ngoài các acid phenolic nói trên, trong thân và lá cây lược vàng có acid ascorbic [77][78] Hàm lượng tổng các acid hữu cơ trong dịch ép thân bồ lược vàng là 37,05% so với cắn khô kiệt [78]
- Glycolipid: sulfolipid, digalactosyldiglycerid, sterol glycosid, cerebrosid
và monogalactosyldiglycerid
Trang 12Các acid amin
Phân tích, so sánh thời gian lưu với 24 acid amin chuẩn, Hikolaeva G và
cs đã xác định được 18 acid amin, trong đó 15 acid amin tự do và 14 acid amin liên kết trong dịch ép thân bồ lược vàng tươi: asparagin, acid aspartic, threonin, serin, glutamin, acid glutamic, glycin, alanin, valin, methionin, leucin, isoleucin, tyramin, phenylalanin, lysin, histamin, arginin và acid γ-aminobutyric [74]
Từ cây lược vàng trồng tại Việt Nam, Phan Văn Kiệm và cs đã phân lập được L-tryptophan [13]
Các nguyên tố vô cơ
Trong thân bồ cây lược vàng trồng ở Nga đã xác định được 11 nguyên tố vô
cơ, trong đó Ba, Mn và Cu có hàm lượng cao nhất [74]
Nhìn chung, chi Callisia còn ít loài được nghiên cứu về thành phần hóa học, chỉ có loài C fragrans được chú ý nghiên cứu Mặc dù mới được bắt đầu nghiên
cứu từ 2007, nhưng cho đến nay các tác giả Nga và Việt Nam đã có được khá
nhiều kết quả về thành phần hóa học của cây lược vàng C fragrans này với 10
chất đã được phân lập và xác định cấu trúc và những phân tích sâu về thành phần các nhóm chất như carbohydrat, lipid, acid amin
1.3 Tác dụng sinh học của các cây thuốc chi Callisia Loefling
Sử dụng trong dân gian
Các loài thuộc chi Callisia chủ yếu được trồng làm cảnh Một số loài sau
đây đã được dùng làm thuốc theo kinh nghiệm dân gian của một số nước châu Mỹ:
- C grasilis: làm đẹp tóc, chữa cao huyết áp, thấp khớp, chữa mụn cơm
[19], [93]
Trang 13- C repens: chữa cảm cúm, hoại thư, viêm dạ dày, cao huyết áp, nhiễm
trùng, thấp khớp, làm thuốc thư giãn [93]
Loài C fragrans được dùng như một cây thuốc dân gian ở Nga để chữa
các bệnh dạ dày – ruột, bệnh túi mật, lá lách; các bệnh đường hô hấp như ho, viêm họng, viêm phế quản, hen phế quản; các bệnh đường tiết niệu; các bệnh ngoài da như viêm da, zona, chàm, bỏng, dị ứng, hắc lào, vết thương ngoài da và cả ung thư…[41],[43]
Về kết quả nghiên cứu tác dụng sinh học của các loài Callisia, chúng tôi tìm thấy một số công bố trong 2 năm gần đây của các tác giả Nga về C fragrans và một bài báo nói đến tác dụng chống herpes virus của dịch chiết cồn C grasilis Sau
đây là những kết quả cụ thể
Tác dụng chống oxy hóa
Dịch ép thân bồ của loài C fragrans có tác dụng chống oxy hóa in vitro
trên mô hình thử nghiệm với DPPH với IC50 = 1,07mg/ml Các phân đoạn có tác dụng mạnh nhất lần lượt là phân đoạn chiết ethyl acetat (IC50 0,024mg/ml), phân đoạn nước (IC50 0,032mg/ml), phân đoạn butanol (IC50 0,087mg/ml) và phân đoạn cloroform (IC50 0,21mg/ml) Dich ép thân bồ lược vàng cũng được chứng minh có khả năng liên kết với ion Fe2+ (IC50 0,79mg/ml), với O2 •- (IC50 0,36mg/ml), gây bất hoạt H2O2 (IC50 0,57mg/ml) Thử nghiệm hoạt tính trên NO, dịch ép này có hoạt tính mạnh hơn tanin (IC50 2,96mg/ml so với tanin 3,50mg/ml) nhưng yếu hơn acid ascorbic (IC50 1,28mg/ml) [78]
Tác dụng bảo vệ khả năng hoạt động
Dịch ép thân bồ lược vàng C fragrans khi cho chuột cống trắng uống với
liều 5ml/kg một lần/ngày đã làm tăng thời gian bơi của chuột từ 8,8 phút lên 11,5 phút nhưng chưa có ý nghĩa thống kê Tuy nhiên, khi tăng liều lên 10ml/kg thể trọng/ngày dịch ép này đã làm tăng thời gian bơi của chuột có ý nghĩa gấp hơn 2 lần so với nhóm chứng (23,7 phút so với 11,3 phút) Phân tích sinh hóa cho thấy tác dụng bảo vệ khả năng hoạt động này là do dịch ép thân lược vàng đã hoạt hóa quá trình tổng hợp ATP trong cơ xương và cơ tim, làm tăng hàm lượng glycogen trong gan và giảm nồng độ acid pyruvic và acid lactic trong máu Ngoài ra, dịch ép này đã giúp làm giảm stress oxy hóa của chuột bị cưỡng bức chạy, thể hiện ở việc làm giảm nồng độ MDA trong huyết thanh, trong cơ xương và cơ tim chuột thí nghiệm cũng như làm tăng hoạt độ enzym catalase [105]
Trang 14Tác dụng chống stress
Trên mô hình gây stress ở chuột bằng cách giữ tình trạng không hoạt động
liên tục 24h, dịch ép thân C fragrans uống với liều 5ml/kg/ngày trong 7 ngày
trước khi gây stress không có ảnh hưởng có ý nghĩa lên trọng lượng của tuyến ức, tuyến tụy, nhưng đã gây tăng có ý nghĩa số lượng tế bào có nhân của tuyến ức và tuyến tụy lên tương ứng là 36 và 49% Ở chuột được uống dịch ép thân lược vàng, tình trạng loét dạ dày do stress giảm còn 25% so với 100% ở nhóm chứng, không thấy có chuột nào có u dạng vân ở nhóm uống lược vàng trong khi nhóm đối chứng bị u 100% Tác dụng chống stress này cũng được cho là do tác dụng chống oxy hóa của dịch ép này, biểu hiện ở việc làm giảm 40% nồng độ MDA trong huyết thanh và làm tăng nồng độ glutation 3 lần, tăng hoạt độ các enzym catalase (54%) và superoxid dismutase (20%) [106]
Tác dụng trên hệ miễn dịch
Thử nghiệm trên mô hình gây ức chế miễn dịch ở chuột bằng azathioprin, dịch ép thân bồ lược vàng đã thể hiện tác dụng tăng cường miễn dịch, làm tăng trọng lượng tuyến ức (12%) và lách (27%) bị suy giảm do azathioprin, tăng 25%
số lượng tế bào có nhân của hai cơ quan này Dịch ép này cũng làm tăng chỉ số thực bào 1,5 lần so với nhóm chứng bệnh và đưa các chỉ số này về gần với nhóm chứng sinh lý [106]
Tác dụng chống virus
Dịch chiết ethanol của C gracilis thể hiện hoạt tính chống herpes virus trên
thử nghiệm in vitro với herpes simplex virus type 2 (HSV-2) với trị số EC50 = 10,5 µg/ml [19]
1.4 Tác dụng sinh học của một số chất có trong C fragrans
Các chất đã được biết có trong lược vàng đều là những chất quen biết đã được phân lập từ nhiều cây thuốc khác và đã được nghiên cứu chứng minh có nhiều tác dụng sinh học đáng chú ý Sau đây là một số kết quả nghiên cứu về tác dụng sinh học của các hợp chất này
Quercetin
Quercetin là một flavonoid rất phổ biến trong thực vật Quercetin được biết đến là một chất có nhiều tác dụng sinh học đáng chú ý như tác dụng chống viêm, chống oxy hóa, chống lão hóa, tác dụng bảo vệ gan, điều biến miễn dịch và phòng chống ung thư
Trang 15Hoạt tính chống oxy hóa, chống lão hóa của quercetin được nghiên cứu khá
kỹ trong một số nghiên cứu gần đây Quercetin và dẫn xuất của nó, cụ thể là quercetin caprylat (QU-CAP) là một chất hoạt hóa mạnh proteasom, với tác dụng chống oxy hóa, do đó nó ảnh hưởng đến tuổi thọ của tế bào và khả năng sống sót của nguyên bào sợi HFL-1 ở người; khi bổ sung hợp chất này vào các nguyên bào sợi đã hóa già thì quan sát được hiện tượng trẻ hóa [28] Ngoài ra, người ta thấy có mối tương quan giữa stress oxy hóa gây ra bởi quá trình chuyển hóa diethylnitrosamin (DEN) và sự phát triển ung thư gan Quercetin là một flavonoid
có tác dụng chống oxy hóa và chống ung thư qua cơ chế thúc đẩy hệ thống phòng thủ chống oxy hóa enzym và không-enzym trong giai đoạn khởi đầu của ung thư gan [97]
Cũng liên quan đến việc phòng chống bệnh ung thư nhưng nghiên cứu ở mức độ phân tử, quercetin tương tác với một số thụ thể, cụ thể là thụ thể aryl hydrocarbon, là một thụ thể có liên quan đến sự phát triển của bệnh ung thư do các chất hóa học nhất định gây ra Quercetin điều chỉnh một vài tín hiệu của sự truyền tính trạng trong chuỗi các phản ứng hóa sinh liên quan đến MEK/ERK và NRF2/KEAP1, là những chất gắn liền với quá trình viêm và gây ung thư Những nghiên cứu về loài gặm nhấm đã chỉ ra rằng chế độ ăn uống có nhiều flavonol giúp ngăn ngừa các chất hóa học gây ung thư, đặc biệt là trong ung thư ruột kết Nhiều nghiên cứu dịch tễ học cũng đã cho thấy quercetin có thể có liên quan đến phòng ngừa ung thư phổi [70]
Quercetin còn được biết đến là một chất có tác dụng bảo vệ các tế bào gan Trong những nghiên cứu về tác động của quercetin trên những tế bào HepG2 nhiễm aflatoxin B (1) (AFB (1)) cho kết quả là quercetin ức chế sự sản xuất các loại oxy phản ứng và các chất gây độc tế bào, và ngăn chặn sự giảm glutathion (GSH) trong các tế bào HepG2 nhiễm AFB (1) Tuy nhiên, quercetin làm giảm không đáng kể nồng độ phosphatase kiềm trong huyết thanh; trong khi alanin aminotransferase và aspartat aminotransferase ở chuột nhiễm AFB(1) lại tăng lên
Do đó, tác dụng bảo vệ gan của quercetin là không trực tiếp chống lại AFB(1) mà tăng cường hệ thống phòng vệ chống oxy hóa và ức chế sự peroxy hóa lipid [27] Các tế bào đuôi gai (DCs) cần thiết cho hệ thống điều hòa miễn dịch Kết
quả nghiên cứu in vitro về sự tác động của quercetin trên các tế bào đuôi gai cho
thấy quercetin giảm độ bám dính của DCs (-42%, p<0,05) và sự biểu hiện của CD11a (-21%; p < 0.05) và ức chế một phần sự phân hóa DCs do OxLDL (oxidized low density lipoprotein) gây ra (BDCA-1-29%; BDCA-2-33%, p <0,05)
Trang 16Thử nghiệm in vivo được tiến hành với 8 tình nguyện viên nam khỏe mạnh, được
dùng 500 mg quercetin 2 lần/ngày trong 4 tuần Kết quả cho thấy quercetin làm giảm BDCA-2 + DCs trong máu ngoại vi 42% (p<0,05) cũng như dimethylarginin bất đối xứng ức chế NO-synthase trong cơ thể (-31%, p<0,05) Như vậy, tác dụng điều biến miễn dịch của quercetin cũng góp phần chống xơ vữa động mạch [73]
Một tác dụng khác của quercetin cũng được quan tâm nhiều là tác dụng chống viêm Quercetin ức chế đáng kể mức độ mARN của iNOS, COX-2 và CRP của tế bào gan Chang Flavonoid này cũng có tác dụng ức chế trên NF-kappaB hoạt động và trên protein cô đặc của mẫu phosphoryl hóa của chất ức chế IkappaB alpha và IKK (IkappaB kinase) alpha Các nghiên cứu hiện nay cho thấy rằng tác dụng điều chỉnh iNOS, COX-2 và CRP trong tế bào gan Chang của quercetin có thể góp phần vào tác dụng chống viêm, thông qua các cơ chế có liên quan đến việc phong tỏa NF-kappaB hoạt động và điều hòa tăng của các gen tiền viêm [36] Ngoài ra, quercetin ức chế sự tiết các chất trung gian gây dị ứng trong các tế bào RBL-2H3 và ngăn cản sự biểu hiện mARN CD23 và p38 MAPK hoạt hóa trong IL-4 kích thích các tế bào CaCO-2 Flavonol này cũng ngăn cản IgE-OVA gây thêm tín hiệu hoạt hóa protein kinase (ERK) và giải phóng chemokin Như vậy, quercetin ngăn cản một cách hiệu quả sự phát triển của chứng viêm dị ứng qua trung gian IgE của các mô hình tế bào đường ruột [58]
Kaempferol
Kaempferol là một flavonoid thiên nhiên, nó là một trong những flavonol phổ biến trong nhiều loài thực vật như trà, bưởi, bông cải xanh, táo…Kaempferol (3, 4',5,7-tetrahydroxyflavon) có cấu trúc hóa học tương tự quercetin và cũng có nhiều tác dụng sinh học tương tự như quercetin Nó cũng có tác dụng chống oxy hóa và chống viêm; ngoài ra còn có tác dụng gây chết tế bào theo chương trình (apoptosis) trên nhiều dòng tế bào ung thư
Giống như quercetin, tác dụng chống viêm của kaempferol một phần là do tác dụng điều chỉnh iNOS, COX-2 và CRP trong tế bào gan Chang thông qua các
cơ chế có liên quan đến việc phong tỏa NF-kappaB hoạt động và điều hòa tăng các gen tiền viêm [36] Kaempferol cũng ngăn cản một cách hiệu quả sự phát triển của chứng viêm dị ứng qua trung gian IgE của các mô hình tế bào đường ruột [58]
Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng tác dụng chống oxy hóa của kaempferol
có thể liên quan đến việc cảm ứng apoptosis các tế bào H460 Đây là một kiểu làm chết tế bào theo chương trình điển hình kèm theo sự cô đặc ADN và sự tăng mức ATP nội bào Điều này có liên quan tới khả năng thay đổi mức độ biểu hiện của
Trang 17caspase-3 (caspase-phụ thuộc) và AIF (caspase-độc lập) Sự biểu hiện quá mức của enzym chống oxy hóa Mn-SOD được đẩy mạnh để tạo một loại gen mới ức chế khối u trong một vài tế bào ung thư của người; và có thể nó đóng vai trò quan trọng vào tác dụng apoptosis trên tế bào H460 của hợp chất kaempferol [60]
Kaempferol có tác dụng gây apoptosis trên nhiều dòng tế bào ung thư Các
tế bào MDA-MB-453 được điều trị bằng kaempferol ở các nồng độ khác nhau (từ
1 đến 200 µM) trong 24 và 48 giờ Kaempferol ức chế một cách đáng kể sự tăng trưởng của tế bào ung thư ở các tế bào tiếp xúc với 50 và 10 µM kaempferol và ủ trong thời gian tương ứng là 24 và 48 giờ Kaempferol ức chế sự phát triển của tế bào bằng cách phá vỡ chu trình tế bào, kết hợp mạnh với việc ngăn cản sự phân chia tế bào ở pha G2/M và có thể gây apoptosis thông quá sự phosphoryl hóa p53
ở các tế bào MDA-MB-453 trong ung thư vú ở người [26] Trong điều kiện hypoxic (1% oxy), kaempferol ức chế một cách hiệu quả hoạt động của HIF-1 theo kiểu phụ thuộc liều (IC50 = 5,16 microM) Cơ chế của sự ức chế này không liên quan đến việc ngăn cản mức độ protein HIF-1alpha mà là do bất hoạt p44/42 MAPK bởi kaempferol (IC50 = 4,75 microM) Khi cho các tế bào Huh7 tiếp xúc với 10 microM kaempferol làm giảm đáng kể khả năng tồn tại của chúng và điều này được thể hiện rõ hơn trong điều kiện hypoxic Như vậy, kaempferol ức chế cả MAPK và HIF-1 hoạt động ở nồng độ sinh lý (5-10 microM) và ngăn chặn sự sống sót của các tế bào ung thư gan hiệu quả hơn trong điều kiện oxy giảm Do đó kaempferol là một tác nhân rất có tiềm năng giúp phòng ngừa hay chữa trị ung thư biểu mô tế bào gan (HCC) [71]
Isoorientin
Hợp chất isoorientin là một flavon có mặt trong một số loài thực vật bậc cao Nhiều nghiên cứu đã cho thấy hợp chất này thể hiện nhiều hoạt tính sinh học
có giá trị trong các thử nghiệm in vitro và in vivo bao gồm hoạt tính chống oxy
hoá, kháng viêm, kháng sinh, bảo vệ gan, chống tiểu đường, giảm đường máu Giống như các chất thuộc nhóm flavonoid, hoạt tính chống oxy hoá của isoorientin thể hiện rõ rệt trong các nghiên cứu trên hệ DPPH và sự peroxy hóa lipid với giá trị IC50 khá thấp (9-10 µM) Khả năng chống oxy hoá này được chứng minh do isoorientin kích thích sự hoạt hoá của yếu tố phiên mã Nrf2, từ đó thúc đẩy quá trình tổng hợp các gen liên quan đến khả năng chống oxy hoá như NAD(P)H: quinon oxidoreductase 1 (NQO-1), hem oxigenase 1 (HO-1), periaxin (PRX) [22], [29], [61]
Trang 18Hoạt tính chống viêm của isoorientin cũng được nghiên cứu khá chi tiết trong thời gian gần đây Năm 2004, Kupeli và cộng sự đã thử nghiệm tác dụng chống viêm của isoorientin trên chuột nhắt gây viêm bằng carrageenan Kết quả cho thấy với liều 30 mg/kg thể trọng, isoorientin làm giảm đến hơn 40% thể tích khối viêm mà hoàn toàn không gây độc cho dạ dày [57] Trong một thí nghiệm khác, isoorientin ở liều 25 mg/kg thể trọng làm giảm đến 57% tế bào bạch cầu và 40% hoạt tính myeloperoxidase trên mô hình chuột nhắt gây viêm bằng carrageenan [103]
Một hoạt tính đáng quan tâm khác của isoorientin là tác dụng chống tăng đường huyết Thí nghiệm trên mô hình chuột gây tiểu đường bằng streptozotocin cho thấy isoorientin với liều 15 mg/kg thể trọng làm giảm đáng kể lượng đường glucose trong máu trong vòng 5-15 ngày [31]
Hợp chất isoorientin thể hiện hoạt tính kháng sinh yếu trên các chủng vi khuẩn và nấm với giá trị MIC trong khoảng 100-200 µg/mL Trong một số nghiên cứu, mặc dù dịch chiết các mẫu thực vật chứa isoorientin ức chế mạnh sự phát triển các chủng vi sinh vật kiểm định nhưng khi được phân lập ra, hoạt tính của isoorientin lại có giá trị thấp hơn dịch chiết ban đầu [32] Ngoài những hoạt tính sinh học kể trên, isoorientin còn thể hiện những nhiều tác dụng khác như bảo vệ gan, thận [35], [79]
Scopoletin
Scopoletin là một coumarin có nhiều tác dụng sinh học Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy rằng scopoletin có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm khớp, chống ung thư, làm hạ huyết áp và có tác dụng chống trầm cảm
Năm 2003, Shaw CY và cộng sự đã tiến hành thử tác dụng chống oxy hóa
của scopoletin phân lập từ Sinomonium acutum Kết quả chỉ ra rằng scopoletin
đóng vai trò dọn sạch các gốc anion superoxid trong hệ thống phản ứng xanthin/xanthin oxidase theo kiểu phụ thuộc nồng độ, nhưng không ức chế xanthin oxidase Nó có thể được sử dụng trong việc ngăn ngừa các gốc anion superoxid gây hại trong cơ thể [90]
Cơ chế làm hạ huyết áp của scopoletin, phân lập từ quả Tetrapleura tetraptera T AUB (Mimosaceae), đã được nghiên cứu in vivo và in vitro Các kết
quả thu được cho thấy, scopoletin gây tác dụng hạ huyết áp trên động vật thí nghiệm thông qua các cơ chế: (a) hoạt động làm giãn các cơ trơn – nghĩa là có thể
Trang 19làm giãn nở các mạch máu; và (b) đóng vai trò như một tác nhân chống co thắt không đặc hiệu (giống papaverin) [75]
Các kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng scopoletin có thể là một hợp chất có tiềm năng chống lại khối u, được sử dụng để điều trị ung thư Scopoletin phân lập
từ T cordata Mill., đã được tiến hành thử tác dụng kháng phân bào và tác dụng
gây độc tế bào trên các u lympho bào Các tác dụng khác nhau ở các nồng độ khác nhau được phân tích liên quan đến việc cảm ứng apoptosis Scopoletin làm tăng nhanh tế bào lympho T bình thường (chỉ số kích thích sự tăng sinh tế bào: 1microg/ml scopoletin: 1,26 +/-0,1; 10microg/ml scopoletin: 3 +/-0,25; 100 microg/ml scopoletin: 1,86 +/-0,08) Tác dụng kích thích này là do sự tương tác của scopoletin với protein kinase C (PKC) [66] Ngoài ra, scopoletin ức chế sự tăng sinh của tế bào PC3 bằng cách cảm ứng quá trình apoptosis của chúng Scopoletin ức chế sự tăng sinh của PC3, PAA và tế bào Hela với IC50 lần lượt là (157 +/- 25), (154 +/- 51), và (294 +/- 100) mg/L Scopoletin làm giảm hàm lượng protein và giảm mức ACP trong các tế bào PC3 theo kiểu phụ thuộc nồng độ Các
tế bào được xử lý với scopoletin cho thấy những sự thay đổi về hình thái điển hình của apoptosis bằng kính hiển vi ánh sáng, kính hiển vi huỳnh quang và kính hiển
vi điện tử truyền qua Tỷ lệ tế bào chết theo chương trình là 0,3%, 2,1%, 9,3% và 35% tương ứng với liều scopoletin là 0, 100, 200, và 400 mg/L và các tế bào ở pha G2 giảm rõ rệt sau khi được xử lý bằng scopoletin [64]
Scopoletin là thành phần chính của coumarin tìm thấy trong thân cây
Erycibe obtusifolia Benth, một loại dược liệu được sử dụng trong y học cổ truyền
của Trung Quốc để điều trị viêm khớp dạng thấp Tiêm scopoletin vào màng bụng với liều 50, 100 mg/kg làm giảm sự sưng tấy chân cũng như các chỉ số về khớp và làm tăng trọng lượng trung bình cơ thể của chuột bị viêm khớp Chuột được điều trị với scopoletin liều cao hơn thì các khớp có cấu trúc mô học gần như bình thường và giảm sự hình thành các mạch máu mới trong các mô hoạt dịch Hơn nữa, scopoletin điều hòa ức chế sự biểu hiện quá mức của yếu tố tăng trưởng nội mạc mạch máu, yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi cơ bản và interleukin - 6 trong các mô hoạt dịch Kết quả là scopoletin có khả năng giảm dần các triệu chứng lâm sàng của chuột bị viêm khớp [80]
Scopoletin phân lập từ Polygala sabulosa (Polygalaceae) có tác dụng giống
như thuốc chống trầm cảm Scopoletin làm giảm thời gian bất động trong mô hình treo đuôi chuột (10-100mg/kg, p.o.), nhưng không giảm trong thử nghiệm bơi cưỡng bức Các rối loạn bất động làm tăng thời gian bất động trong các thử
Trang 20nghiệm bơi cưỡng bức (hành vi giống như trầm cảm), được làm giảm bởi scopoletin (1-100mg/kg, p.o.) Tác dụng giống như thuốc chống trầm cảm của scopoletin phụ thuộc vào các hệ thống thu thể serotonergic (thụ thể 5-HT (2A)), noradrenergic (alpha (1) - và alpha (2)-adrenoceptors) và dopaminergic (thụ thể dopamine D (1) và D ( 2)) [21]
Umbelliferon
Umbelliferon (7-hydroxycoumarin), một dẫn xuất của coumarin, là benzopyron trong tự nhiên Nó có nhiều tác dụng sinh học như chống oxy hóa, hạ đường huyết và chống béo phì
Ramesh B., Pugalendi K.V đã tiến hành thử nghiệm các tác dụng sinh học của umbelliferon trên chuột bị tiểu đường Umbelliferon tăng cường khả năng chống oxy hóa nên được xem là một chất chống oxy hóa mạnh Chuột tiểu đường được điều trị bằng umbelliferon (30 mg/kg trọng lượng cơ thể) hòa tan trong 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) trong 45 ngày, làm giảm mức peroxy hóa lipid và tăng cường những chất chống oxy hóa enzym và không-enzym lên mức gần như bình thường [87]
Ở chuột tiểu đường, mức đường huyết, hemoglobin glycosyl hóa (HbA (1c)) tăng và hoạt động của các enzym tân tạo glucose như glucose-6-phosphatase
và fructose-1, 6-bisphosphatase cũng tăng; trong khi mức insulin huyết tương, hemoglobin (Hb), glycogen gan giảm và các hoạt động của glucokinase và glucose-6-phosphate dehydrogenase cũng giảm Tiêm umbelliferon vào màng bụng chuột tiểu đường (với liều 10, 20 và 30 mg/kg trọng lượng cơ thể) và glibenclamid (600 micro g/kg trọng lượng cơ thể) trong 10% DMSO hòa tan trong nước, trong 45 ngày, làm giảm đáng kể mức độ glucose máu, HbA (1c) và hoạt động của glucose-6-phosphatase và fructose-1,6-bisphosphatase, trong khi đó làm tăng nồng độ insulin huyết tương, Hb, glycogen gan và hoạt động của glucokinase
và glucose-6-phosphate dehydrogenase lên gần như bình thường Ngoài ra, ở chuột tiểu đường, các thành phần glycoprotein trong huyết tương và trong các mô (gan, thận, tim và não) như acid sialic, hexose toàn phần, fucose, và hexosamin tăng lên Điều trị với umbelliferon hòa tan trong 10% DMSO trong 45 ngày đưa các thành phần glycoprotein về gần bình thường Như vậy, kết quả cho thấy rằng umbelliferon với liều 30 mg/kg trọng lượng cơ thể có tác dụng hạ đường huyết, tác dụng này có thể so sánh được với glibenclamid Umbelliferon đã cải thiện việc
Trang 21kiểm soát mức đường huyết, do đó giảm sự hình thành các thành phần glycoprotein, giúp chống lại nguy cơ biến chứng của bệnh tiểu đường [86], [88]
Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng umbelliferon ngoài tác dụng chống đái tháo đường còn có tác dụng chống tăng lipid máu Trong huyết tương của chuột bị tiểu đường, cholesterol toàn phần (TC), cholesterol lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL-C), cholesterol lipoprotein tỷ trọng rất thấp (VLDL-C), triglycerid (TG), acid béo tự
do (FFA) và phospholipid (PL) tăng cao còn cholesterol lipoprotein tỷ trọng cao (HDL-C) giảm sút Trong mô gan và thận của chuột bị tiểu đường TC, TG, FFA,
và PL có nồng độ cao Ở chuột được điều trị tiểu đường bằng umbelliferon, các chỉ
số TC, TG, PL và FFA trong huyết tương và mô; và LDL-C, VLDL-C, và HDL-C huyết tương gần trở lại như bình thường [85]
có tác dụng chống viêm vì nó ức chế việc sản xuất oxid nitric (NO), yếu tố hoại tử
u TNF- α và interleukin IL-12 từ các đại thực bào đã hoạt hóa bởi lipopolysaccharid (LPS) và interferon-gamma (IFN- γ) Kết quả cho thấy, IC50 của aloe emodin trên NO, TNF-α và IL-12 từ các đại thực bào ở phúc mạc đã hoạt hóa
là 30 µM [69]
Kết quả nghiên cứu của Lin C.W và cộng sự ở Trung Quốc đã cho thấy aloe emodin là tác nhân tạo ra IFN với tác động kháng virus, ức chế virus viêm não Nhật Bản (JEV) và enterovirus 71 (EV71) Aloe emodin có tác dụng gây độc
tế bào thấp đến các tế bào tiền đơn nhân HL-CZ của người và các tế bào medulloblastoma TE-671 (bướu nguyên bào tủy) và hoạt hóa mạnh yếu tố đáp ứng kích thích interferon (ISRE – interferon-stimulated response element) và chuỗi hoạt hóa gamma (GAS- gamma-activated sequence) IC50 của aloe emodin thay đổi từ 0,50microg/mL đến 1,51microg/mL đối với JEV và từ 0,14microg/mL đến 0,52microg/mL đối với EV71 Aloe emodin cho thấy rõ khả năng ức chế mạnh virus và đạt được các chỉ số điều trị cao, đặc biệt với các tế bào HL-CZ [62]
Hợp chất aloe emodin là một loại tác nhân chống ung thư mới với hoạt tính
chọn lọc chống lại khối u thần kinh ngoại bì (neuroectodermal) in vitro và in vivo
Aloe emodin không ức chế sự tăng sinh của nguyên bào sợi bình thường cũng như của các tế bào tiền tạo máu mà cơ chế gây độc tế bào của nó là cảm ứng apoptosis
Trang 22làm chết tế bào theo chương trình Tính chọn lọc chống lại các tế bào khối u thần kinh ngoại bì phụ thuộc hiệu lực cụ thể của việc kết hợp thuốc [81]
Kết quả nghiên cứu tác dụng chống ung thư của aloe emodin trên hai dòng
tế bào ung thư gan ở người là Hep G2 và Hep 3B cho thấy aloe emodin ức chế sự phát triển tế bào và gây apoptosis ở cả hai dòng tế bào được thử nghiệm, nhưng với các cơ chế khác nhau Ở các tế bào Hep G2, aloe emodin cảm ứng sự biểu hiện p53 và kèm theo cảm ứng sự biểu hiện p21 kết hợp với việc ngăn cản chu trình tế bào trong pha G1 Ngoài ra, aloe emodin làm tăng đáng kể lượng thụ thể Fas/APO1 và sự biểu hiện của Bax Ngược lại, với những tế bào Hep 3B thiếu p53, tác dụng ức chế sự tăng sinh tế bào của aloe emodin qua trung gian phụ thuộc p21
mà không ngăn cản chu trình tế bào hoặc làm tăng lượng thụ thể Fas/APO1 Cơ chế chính là aloe emodin gây cảm ứng apoptosis bằng cách tăng cường sự biểu hiện của Bax [56]
Những nghiên cứu tiền lâm sàng cho thấy rằng aloe emodin có thể là một loại thuốc hóa trị liệu mới và phù hợp để điều trị ung thư dạ dày ở người Kết quả điều tra tác dụng chống ung thư của aloe emodin trên hai dòng tế bào ung thư dạ dày riêng biệt ở người là AGS và NCI-N87, cho thấy aloe emodin làm chết tế bào theo cách thức phụ thuộc thời gian và liều lượng Nó giải phóng các yếu tố cảm ứng apoptosis và cytochrom c từ ty thể, tiếp theo là hoạt hóa caspase-3, dẫn đến co rút nhân và gây apoptosis Ngoài ra, aloe emodin ngăn cản sự hoạt động của casein kinase II theo cách phụ thuộc thời gian và kèm theo sự giảm phosphoryl hóa Bid Trong một nghiên cứu khác, các tế bào MGC-803 được điều trị bằng 2,5, 5, 10, 20
và 40 microM aloe emodin trong 1-5 ngày Kết quả cho thấy aloe emodin ức chế
sự tăng trưởng của tế bào ung thư theo cách phụ thuộc liều dẫn đến làm gián đoạn chu trình tế bào Hơn nữa, nó làm giảm hoạt tính của phosphatase kiềm (ALP) và
gây ra sự khác biệt giữa các tế bào [23], [38]
Trang 23glutathion peroxidase (GPx), glutathion (GSH), và glutathion S-transferase (GST)) trong gan và thận Những nghiên cứu mô học gan và thận cũng cho thấy việc uống acid caffeic làm giảm rõ rệt những thay đổi bệnh lý do rượu gây ra [51]
Ngoài tác dụng chống oxy hóa kể trên, acid caffeic còn được chứng minh là
có tác dụng làm hạ đường huyết ở chuột C57BL/KsJ-db/db Ở nhóm sử dụng acid caffeic: mức đường huyết và hemoglobin glycosyl hóa giảm nhiều hơn so với nhóm đối chứng; mức insulin huyết tương, C-peptid và leptin cao hơn đáng kể so với nhóm đối chứng Tác dụng làm tăng insulin huyết tương của acid caffeic có thể
là do tác dụng chống thoái hóa trên các đảo nhỏ Acid caffeic cũng làm tăng rõ rệt glucokinase hoạt động và sự biểu hiện mARN của nó và tăng hàm lượng glycogen; đồng thời giảm glucose-6-phosphatase và phosphoenolpyruvat carboxykinase hoạt động và sự biểu hiện mARN của chúng, kèm theo việc giảm sự biểu hiện của chất vận chuyển glucose 2 trong gan Ngược lại với chất vận chuyển glucose 2 ở gan,
sự biểu hiện của chất vận chuyển glucose 4 ở tế bào tạo mỡ lại lớn hơn nhóm đối chứng Ngoài ra, acid caffeic còn làm tăng đáng kể hoạt động của các enzym SOD, CAT, GPx và mức độ biểu hiện mARN của chúng; trong khi đó làm giảm mức hydrogen peroxid và các chất phản ứng acid thiobarbituric trong hồng cầu và gan của chuột db/db Các kết quả này cho thấy cơ chế chống đái tháo đường của acid caffeic là ngăn chặn sự tiến triển của đái tháo đường týp 2 do nó làm giảm lượng glucose sản xuất ở gan và tăng cường hấp thu glucose ở các tế bào tạo mỡ, tăng tiết insulin và tăng khả năng chống oxy hóa [49]
Ho Sun Song và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu một tác dụng đặc biệt của acid caffeic là tác dụng làm lành vết thương trên chuột bị rạch da Acid caffeic là một chất có hoạt tính chống oxy hóa mạnh và chống viêm trong hệ thống tế bào nuôi cấy; và có thể có liên quan đến việc chữa lành vết thương trên chuột bị rạch
da Nó kích thích các polymer tổng hợp giống như collagen trong tế bào nguyên bào sợi NIH 3T3; nhưng lại ức chế cả hai thế hệ loài oxy phản ứng do silica gây ra,
ức chế sự giải phóng acid arachidonic do melittin sinh ra, ức chế sự sản xuất PGE
2 trong tế bào Raw 264,7; và ức chế sự giải phóng histamin trong các tế bào RBL 2H3 được kích thích bởi melittin hoặc acid arachidonic [92]
Trang 24Acid gallic là một hợp chất chống oxy hóa tự nhiên Đặc tính chống oxy hóa hỗ trợ cho tác dụng bảo vệ gan của hợp chất này Các tác dụng này được đánh giá trên chuột bị tổn thương gan do nhiễm độc paracetamol và được so sánh với silymarin, một thuốc bảo vệ gan tiêu chuẩn Chuột được nhận một liều paracetamol (900 mg/kg trọng lượng cơ thể); và được cho acid gallic (100 mg/kg trọng lượng cơ thể) và silymarin (25 mg/kg trọng lượng cơ thể) 30 phút sau khi tiêm paracetamol Khi so sánh với nhóm đối chứng, ở nhóm chuột uống paracetamol: hoạt động của các enzym gan (aspartat transaminase, alanin transaminase và phosphatase kiềm) được tăng cường; TNF- α và mức độ peroxy hóa lipid cũng tăng cao (p < 0,05); trong khi mức chống oxy hóa lại suy giảm (p < 0,05) Điều trị bằng acid gallic làm giảm đáng kể những thay đổi trên (p <0,05) do tác dụng chống oxy hóa của acid gallic [89]
Theo kết quả nghiên cứu của Giftson J.S và cộng sự (năm 2010), acid gallic là một tác nhân có khả năng phòng ngừa ung thư ruột kết do 1,2-dimethyl hydrazin (DMH) gây ra Do acid gallic có tác dụng chống oxy hóa; nó làm giảm các sản phẩm của sự peroxy hóa lipid (LPO) như các chất phản ứng acid thiobarbituric (TBARS), các hydroperoxid lipid (LOOH) và các dien liên hợp (CD) và cũng làm tăng mức độ các chất chống oxy hóa như superoxid dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathion (GSH), glutathion reductase (GR) và glutathion peroxidase (GPx) trong các mô của chuột nhiễm DMH nên hạn chế được những tác động do DMH gây ra [37]
Acid gallic có hoạt tính ức chế tyrosinase mạnh với IC50 = 3,59 x 10-6 M trên các tế bào u hắc sắc tố B16 Acid gallic có tác dụng điều hòa ức chế việc sản sinh các loài phản ứng (RS) và tăng cường tỉ lệ glutathion (GSH) / glutathion đã oxy hóa (GSSG) [53]
Acid gallic đã chứng tỏ được khả năng ức chế đáng kể sự tăng sinh tế bào
và gây apoptosis trên một loạt các dòng tế bào ung thư
Nghiên cứu in vitro cho thấy, acid gallic gây ra những thay đổi về hình thái,
giảm tỷ lệ tế bào sống sót và gây apoptosis trên tế bào hắc sắc tố A375-S2 theo cách phụ thuộc thời gian và liều Quan sát cơ chế apoptosis ở mức độ phân tử trong tế bào A375-S2 cho thấy acid gallic điều hòa tăng các protein pro-apoptotic như Bax và gây cảm ứng hoạt động của dòng thác caspase, nhưng lại điều hòa ức chế các protein anti-apoptotic như Bcl-2 Acid gallic kích thích giải phóng nguyên sinh chất của các phân tử apoptotic, cytochrom c, thúc đẩy sự hoạt hóa caspase-9
và caspase-3 và cuối cùng là làm chết tế bào Ngoài ra, acid gallic cũng thúc đẩy
Trang 25việc giải phóng nguyên sinh chất của yếu tố cảm ứng apoptosis (AIF) và endonuclease G (Endo G) Do đó, acid gallic gây cảm ứng apoptosis thông qua cả
2 cơ chế phụ thuộc caspase và không phụ thuộc caspase [65]
Acid gallic còn có tác dụng cảm ứng apoptosis trên các tế bào bạch cầu dạng tiền tuỷ bào promyelocytic HL-60RG Phân tích Flow cytometric (phương pháp đo dòng chảy tế bào) cho thấy rằng apoptosis không được kích hoạt ở một giai đoạn cụ thể của chu kỳ tế bào và các tế bào HL-60RG chỉ cần tiếp xúc với acid gallic 2h là đủ để gây ra apoptosis Các thử nghiệm khác cho thấy tác dụng gây chết tế bào của acid gallic qua trung gian bởi các loài oxy phản ứng như hydrogen peroxid, các anion superoxid , các enzym phụ thuộc calmodulin [44]
Cũng liên quan đến tác dụng gây chết tế bào theo chương trình của acid gallic, các nhà khoa học của Hàn Quốc, You BR và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu những tác động của acid gallic liên quan đến việc ức chế sự tăng trưởng và gây chết tế bào trên các tế bào ung thư cổ tử cung HeLa IC50 của acid gallic khoảng 80 microM trong 24h đối với các tế bào HeLa; trong khi IC50 của acid gallic đối với các tế bào nội mô tĩnh mạch rốn của người (HUVEC) là khoảng 400 microM Acid gallic ức chế sự tăng trưởng của tế bào HeLa và HUVEC qua apoptosis và/hoặc hoại tử Độ nhạy cảm của các tế bào HeLa đối với acid gallic
cao hơn của HUVEC [101]
Acid chicoric
Một tác dụng đáng chú ý và đang được quan tâm nghiên cứu nhiều của acid chicoric là tác dụng chống HIV Acid chicoric là một dẫn xuất của acid caffeic, trong tương lai nó có thể là hợp chất chống HIV đa mục tiêu, hỗ trợ mạnh cho việc điều trị HIV Acid L - chicoric đã được xác định là một chất ức chế mạnh HIV-1
IN (Human immunodeficiency virus 1 integrase), là enzym chịu trách nhiệm tích hợp DNA của virus vào bộ gen của vật chủ, và đóng vai trò quan trọng trong việc sao chép, nhân lên của virus [18], [40] Hoạt tính kháng virus HIV-1 của acid L - chicoric là do ức chế sự tích hợp HIV-1.Acid L - và D -chicoric và các dẫn xuất ester tetra-acetyl của chúng ức chế sự sao chép của virus HIV-1 (III (B) và NL4.3)
và HIV-2 (ROD) trên các tế bào MT- 4 với EC50 khác nhau từ 1,7 đến 70,6 microM và IC50 khác nhau từ 40 đến 60 microM [63], [83]
Ngoài tác dụng chống HIV, acid chicoric còn là một hợp chất có tiềm năng chống đái tháo đường Sử dụng các nghiên cứu in vitro để đánh giá tác động của
acid chicoric tinh khiết phân lập từ Cichorium intybus trên sự hấp thu glucose và
Trang 26tiết insulin.Kết quả cho thấy rằng acid chicoric làm tăng sự hấp thu glucose ở các
tế bào cơ L6, một tác dụng chỉ được quan sát khi có mặt insulin ở nồng độ kích thích; và có thể kích thích tiết insulin từ dòng tế bào tiết insulin INS-1E và các đảo nhỏ Langerhans của chuột Như vậy acid chicoric chống đái tháo đường theo cơ chế vừa tăng hấp thu glucose vừa có khả năng làm nhạy cảm insulin và tăng tiết insulin [95]
Ginsenosid Rg1
Ginsenosid Rg1 (GRg1), một trong những thành phần chính có hoạt tính
mạnh của rễ Panax notoginseng, đã được chứng minh là có nhiều tác dụng sinh
học đáng chú ý
GRg1 cho thấy một tác dụng bảo vệ thần kinh mạnh bằng cách giảm đáng
kể nhồi máu não và các chỉ số thần kinh trong mô hình chuột MCAO Tuy khả năng vận chuyển của GRg1 qua hàng rào máu não khá hạn chế; nhưng GRg1 lại thể hiện tác dụng bảo vệ tương đối mạnh, chống lại những tổn thương hàng rào máu não và có thể tác dụng này xuất phát từ tác dụng bảo vệ trực tiếp chống lại thiếu máu cục bộ gây ra bởi thương tổn ở hàng rào máu não Ngoài ra, GRg1 còn
có tác dụng bảo vệ thần kinh chống lại độc tính do 6-OHDA (6-hydroxydopamin) gây ra trên tế bào MES23.5 Cơ chế của nó bao gồm việc tăng điều chỉnh sự biểu hiện gen và protein của Bcl-2, kích hoạt sự phosphoryl hóa Akt cũng như ức chế
sự phosphoryl hóa ERK1/2 gây ra bởi 6-OHDA [52], [99]
Ngoài tác dụng trên hệ thần kinh trung ương, GRg1 còn có khả năng thúc đẩy sự phục hồi dây thần kinh sau những tổn thương thần kinh Liều cao GRg1 giúp tái tạo và phục hồi chức năng của sợi trục thần kinh tốt hơn liều thấp GRg1 và mecobalamin Như vậy, GRg1 có thể được sử dụng như một tác nhân bảo vệ thần kinh có tác dụng phục hồi thần kinh ngoại vi [50]
Với tác dụng bảo vệ thần kinh, GRg1 còn được sử dụng trong điều trị bệnh Parkinson Cơ chế bảo vệ thần kinh của GRg1 là chống lại apoptosis gây ra bởi dopamine ngoại sinh trong các tế bào PC12 GRg1 làm giảm rõ rệt việc sản xuất các loại oxy phản ứng gây ra bởi dopamin và giải phóng cytochrom c từ ti thể vào trong tế bào chất và sau đó ức chế sự hoạt động của caspase-3 Ngoài ra, GRg1 cũng làm giảm mức protein iNOS và giảm sản xuất NO GRg1 có thể làm hạn chế
sự chết tế bào theo chương trình do dopamine gây ra thông qua ức chế stress oxy hóa nội bào, và nhờ đó có thể bảo vệ tế bào thần kinh dopamin trong bệnh Parkinson [24]
Trang 27Ngoài những tác dụng trên hệ thần kinh, Ginsenoside Rg1 còn có tác dụng bảo vệ mạch máu GRg1 có thể hạn chế sự giảm sản xuất NO do TNF-α gây ra theo cách phụ thuộc liều Thêm nữa, GRg1 có thể làm cho mức độ biểu hiện của các protein như MEKK3, phosphoglycerat mutase giảm đi, còn nitric-oxid synthase, mineralocorticoid receptor tăng lên ở HUVECs (tế bào nội mạc tĩnh mạch rốn của con người) được kích thích bởi TNF-α Việc GRg1 làm tăng sản xuất NO đóng một vai trò quan trọng trong tác dụng bảo vệ các HUVECs bị TNF-
α kích thích [102]
Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng GRg1 là một phytoestrogen có hoạt tính như estrogen, mà không cần có sự tương tác trực tiếp với thụ thể estrogen (ERs) trong các tế bào ung thư vú ở người (MCF-7) Tác dụng giống như estrogen của GRg1 thông qua trung gian các ERs nội sinh GRg1có thể kích hoạt ERE-luciferase hoạt động qua trung gian ER-α theo cách phụ thuộc liều (10-14 đến 10-6M); trong khi đó, việc kích hoạt ERE-luciferase hoạt động qua trung gian ER-β của GRg1 chỉ xảy ra ở nồng độ cao (10-6 M) [98]
Kết quả nghiên cứu của Xi-Sheng Xie và cộng sự (năm 2009) cho thấy GRg1 ngăn cản sự biến đổi hình thái trong NRK-52E và ức chế sự biểu hiện của P-ERK1/2 tại NRK-52E gây ra bởi TGF- β1 GRg1 còn ức chế sự biểu hiện của α-SMA và sự thiếu hụt E -cadherin, sau đó giảm mức collagen I và fibronectin theo cách phụ thuộc vào liều GRg1 có thể ức chế EMT qua cơ chế ngăn cản sự biểu
hiện của P-ERK1/2 in vitro và do đó nó cũng có vai trò chống xơ hóa ở thận [100]
Các phân tích mô học cho thấy rằng GRg1 cải thiện đáng kể mức độ xơ hóa gan gây ra bởi thioacetamid ở chuột như ức chế các chỉ số xơ hóa trong huyết thanh và hàm lượng hydroxyprolin gan GRg1 làm giảm mức alanin transaminase, aspartat transaminase và phosphatase kiềm trong huyết thanh và làm suy giảm các chất phản ứng acid thiobarbituric trong gan ở chuột nhiễm thioacetamid Như vậy, GRg1 vừa có hoạt tính chống oxy hóa vừa có khả năng chống xơ hóa gan [47]
Ginsenosid Rg1 có thể là một tác nhân có tiềm năng phòng và điều trị ung thư GRg1 điều trị các tế bào u xương ác tính MG-63, làm giảm sự biểu hiện nucleophosmin, là một phosphoprotein nhân chính có liên quan đến sự tổng hợp rRNA, duy trì sự ổn định của hệ gen và sự phân chia của tế bào bình thường Nucleophosmin cũng có chức năng như một phân tử chaperon có thể tương tác với nhiều oncogen và gen ức chế ung thư GRg1 điều hòa các oncogen c-myc, c-fos và gen ức chế khối u, P53, Rb [84]
Đặc biệt, ginsenosid Rg1 được biết là có nhiều tác dụng điều biến miễn dịch, như tăng hoạt tính miễn dịch của tế bào T helper (Th) Kết quả nghiên cứu
Trang 28cho thấy GRg1 giúp tế bào vật chủ chống lại sự lan rộng của nấm candida do phản ứng miễn dịch qua trung gian tế bào CD4+ T từ một phản ứng cytokine do Th1 chi phối [48]
Bảng 1.1 Tổng hợp tác dụng sinh học của một số chất có trong cây lược vàng
Stt Tên hoạt chất Tác dụng sinh học
1 Quercetin Chống oxy hóa, chống lão hóa [28], [97]
Tác dụng gây chết tế bào theo chương trình trên nhiều dòng
tế bào ung thư, phòng chống ung thư [26], [71]
3 Isoorientin Chống oxy hoá [22], [29], [61]
Chống viêm [57]
Kháng khuẩn [32]
Bảo vệ gan, thận [35], [79]
Hạ đường huyết, chống đái tháo đường và chống béo phì [31]
4 Scopoletin Chống oxy hóa [90]
Hạ huyết áp [75]
Chống ung thư [64], [66]
Chống viêm khớp [80]
Chống trầm cảm [21]
5 Umbelliferon Chống oxy hóa [87]
Hạ đường huyết, chống đái tháo đường, chống tăng lipid máu [85], [86], [88]
6 Aloe emodin Chống ung thư [23], [38], [56], [81]
8 Acid gallic Chống oxy hóa, bảo vệ gan [37], [44], [53], [89]
Tác dụng gây chết tế bào theo chương trình trên nhiều dòng
tế bào ung thư, phòng chống ung thư [37], [44], [53], [65], [101]
9 Acid chicoric Chống đái tháo đường [95]
Trang 29Chống ung thư [84]
Điều biến miễn dịch, chống nấm Candidas [48]
1.5 Một số chế phẩm chứa lược vàng
Kem bôi Callisia fragrans với nọc ong [42]
Dạng bào chế: tuýp kem 75ml
Nơi sản xuất: Nga – Ucraina
Thành phần: nước với ion bạc, sáp ong, nọc ong, dịch chiết lược vàng, dầu bách
xù, mật gấu…
Chỉ định: có tác dụng giảm đau, chống viêm, làm ấm nóng, hồi phục; phòng tránh
tích lũy muối, làm đĩa đệm cột sống đàn hồi và mềm dẻo hơn Hỗ trợ điều trị viêm đầu dây thần kinh, đau thần kinh tọa, gout
Trà túi lọc Tâm Lan [12]
Dạng bào chế: trà túi lọc 120g/ hộp (30 túi x 4g)
Nơi sản xuất: Cơ sở Võ Thị Lấn, Tây Ninh
Thành phần: Cây hoàn ngọc (rễ, thân, lá) 40%, Cúc hoa 20%, Kim ngân hoa 20%,
Cây lược vàng 20%
Chức năng: Hỗ trợ điều trị rối loạn tiêu hóa, thanh nhiệt giải độc cho cơ thể
Cách sử dụng: Mỗi lần cho túi lọc vào cốc nước sôi, sau 3-5 phút là uống được, có
thể uống nhiều lần, dùng thay nước uống hằng ngày
Trang 302 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là lá và thân
bồ lược vàng tươi thu tại Thanh Hóa, Hà
Nội, Bắc Giang từ tháng 6/2009 đến
tháng 3/2010 Mẫu cây được các chuyên
gia thực vật, Khoa Tài nguyên cây thuốc
Viện Dược liệu xác định tên khoa học là
Callisia fragrans (Lindl.) Woods., họ
Commelinaceae (Thài lài)
Tiêu bản mẫu cây được lưu giữ tại
2 nơi:
+ Khoa Tài nguyên cây thuốc,
Viện Dược liệu: số hiệu mẫu: LV01, 02,
03 05 và 06 (HNPM)
+ Phòng tiêu bản Quốc gia Việt
Nam, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh
vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt
Nam: số hiệu mẫu: Nga - 04 (HN)
Mẫu thử độc tính và tác dụng dược lý của lá (ký hiệu LVL):
Lấy lá tươi, rửa sạch đất cát, tránh lá gẫy, giập Vảy hết nước để không còn giọt nước trên lá Cân khối lượng lá tươi Xay lá cho nhuyễn, ép lấy dịch, bỏ bã Lọc, lấy dịch lọc Sấy đông khô dịch lọc được bột đông khô lá lược vàng Bảo quản bột đông khô lá lược vàng trong tủ lạnh ở nhiệt độ 50C Hiệu suất thu được cao đông khô LVL so với khối lượng dược liệu tươi là 1,72%, so với khối lượng dược liệu khô tuyệt đối là 34,06%
Mẫu thử độc tính và tác dụng dược lý của thân bồ (ký hiệu LVT):
Dùng thân bồ rửa sạch, vảy hết nước Cân khối lượng tươi Xay nhuyễn với
Trang 31ethanol 50% theo tỷ lệ 1:5 (kl:tt), rồi ép bỏ bã, lấy dịch ethanol Lọc lấy dịch lọc
Cô dịch lọc ethanol dưới áp suất giảm ở nhiệt độ < 600C Sấy khô trong tủ sấy chân không được bột cao thân bồ lược vàng Bảo quản bột cao thân bồ lược vàng trong tủ lạnh ở nhiệt độ 50C Hiệu suất thu được cao chiết bằng cồn 50% thân bồ lược vàng LVT so với khối lượng dược liệu tươi là 1,91%, so với khối lượng dược liệu khô tuyệt đối là 38,05%
Mẫu thử tác dụng độc tế bào của lá:
Lá tươi được sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 600C Chiết dược liệu bằng methanol ở 600C/ 1h x 3 lần chiết Dịch chiết được lọc qua giấy lọc thường, cô loại dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ < 500C đến cắn
Hòa cắn trong nước cất, thêm một lượng n-hexan theo tỷ lệ 1:1 (tt:tt) Lắc
kỹ, để lắng, rồi gạn lấy dịch chiết hexan Pha nước còn lại được lắc tiếp với hexan vài lần đến khi dịch chiết n-hexan không còn màu Gộp các dịch chiết n-
n-hexan, cô loại dung môi dưới áp suất giảm đến cắn thu được mẫu ký hiệu LH với
hiệu suất 0,51% so với dược liệu khô
Pha nước tiếp tục được lắc với đồng thể tích ethyl acetat đến khi dịch chiết ethyl acetat không màu Gộp các dịch chiết ethyl acetat, cô loại dung môi dưới áp
suất giảm đến cắn thu được mẫu ký hiệu LE với hiệu suất 0,65% so với dược liệu
khô
Lớp nước còn lại được cô loại dung môi dưới áp suất giảm đến cắn thu
được mẫu ký hiệu LN với hiệu suất 0,76% so với dược liệu khô
Mẫu thử độc tế bào của thân bồ:
Thân bồ tươi cũng được sấy và chiết phân đoạn tương tự như với mẫu lá Các cặn chiết tương ứng được ký hiệu:
TH: phân đoạn n- hexan
TE: phân đoạn ethyl acetat
TN: phân đoạn nước
Liều thử tác dụng dược lý:
- Trên chuột nhắt:
LVL: các liều tương đương 6g, 12g và 24g lá tươi/kg thể trọng/ngày
LVT: các liều tương đương 1,2g, 2,4g và 4,8g thân bồ tươi/kg thể trọng/ngày
Trang 32- Trên chuột cống:
LVL: các liều tương đương 3,5g, 7,0g và 14g lá tươi/kg thể trọng/ngày
LVT: các liều tương đương 0,7g, 1,4g và 2,8g thân bồ tươi/kg thể trọng/ngày
- Trên mèo:
LVL: các liều tương đương 3g, 6g và 30g lá tươi/kg thể trọng/ngày
LVT: các liều tương đương 0,6g, 1,2g và 12g thân bồ tươi/kg thể trọng/ngày
Liều thử độc tính bán trường diễn
LVL: các liều tương đương 6g, 18g và 60g lá tươi/kg thể trọng thỏ/ngày
LVT: các liều tương đương 1,2g, 3,6g và 12g thân bồ tươi/kg thể trọng thỏ/ngày
Thuốc đối chiếu:
- Gentamycin sulfat :Chuẩn Quốc gia SKS 0506011
- Codein, dạng bột dược dụng, liều uống 30mg/kg thể trọng chuột nhắt trắng
- Aspirin, dạng biệt dược Asperic gói 500mg, liều uống 100mg/kg chuột nhắt trắng
- Prednisolon, liều uống 5mg/kg chuột cống trắng /ngày
- Nifedipin, liều uống 1,2 mg/kg thể trọng mèo
- Vitamin E, liều uống 8UI/kg thể trọng chuột nhắt trắng
- Levamisol dạng bột trắng, hàm lượng 98,6% do phòng Hoá lý I, Viện Kiểm nghiệm trung ương cung cấp, liều uống 100mg/kg thể trọng chuột nhắt trắng
2.2.2 Động vật nghiên cứu
- Chuột nhắt trắng đực và cái (chủng Swiss albino, 5-6 tuần tuổi, trọng
lượng trung bình 22 g ± 2 g) được Viện Vệ sinh dịch tễ Hà Nội cung cấp
- Chuột cống trắng chủng Wistar, cả hai giống, trọng lượng 90-130g, khoẻ mạnh, do Trại chăn nuôi Học viện Quân y cung cấp
- Thỏ trưởng thành, cả hai giống, trọng lượng từ 1,8 – 2,2 kg, là những thỏ khoẻ mạnh, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm
- Mèo trưởng thành, cả hai giống, khoẻ mạnh đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, trọng lượng từ 2,0 – 2,5 kg
Trang 332.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp lấy mẫu nguyên liệu và xác định về thực vật:
- Thu thập mẫu nguyên liệu: thu thập cả cây tươi Đối với lá: chọn lá đã phát triển đầy đủ, không non, không héo úa Đối với thân bồ: chọn thân bồ đã mọc dài hơn 7 đốt
- Xác định tên khoa học: dựa trên phương pháp phân tích và mô tả hình thái
thực vật, đối chiếu với khoá phân loại thực vật của Thực vật chí [33], [34]
Trang 342.3.2 Phương pháp thử độc tính cấp [4], [6], [96]
Mô tả phương pháp:
Chuột nhắt trắng có trọng lượng 18-22g, khoẻ mạnh, không phân biệt giống, được chia ngẫu nhiên thành các lô Để chuột nhịn đói 16 giờ trước khi thí nghiệm Dùng kim đầu tù cho chuột uống thuốc theo mức liều quy định cho từng
lô, mỗi lần 0,2 – 0,4 ml /10g thể trọng, với các mức liều tăng dần Theo dõi tình trạng chung, hoạt động tự nhiên, hô hấp và tiêu hoá của chuột liên tục trong 7 ngày sau dùng thuốc Đếm số chuột chết ở từng lô để xác định liều thấp nhất gây chết 100% và liều cao nhất gây chết 0% Chuột chết được mổ để đánh giá tổn thương đại thể
Tính LD50 theo phương pháp của Karber-Behrens
Công thức tính: LD 50 = LD 100 - [∑ (d × z)] × 1/n
Trong đó: d là hiệu số liều của 2 liều kế tiếp
z là số chuột chết trung bình giữa 2 liều kế tiếp
n là số chuột trong 1 lô thí nghiệm
2.3.3 Phương pháp thử độc tính bán trường diễn [17]
+ Nguyên vật liệu:
- Động vật thí nghiệm: Thỏ trưởng thành, cả thỏ đực và thỏ cái, trọng lượng
từ 1,8 – 2,2 kg, là những thỏ khoẻ mạnh, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm
- Mẫu thử: Cao đông khô lá lược vàng LVL và cao chiết bằng cồn 50% thân
- Máy định lượng sinh hoá bán tự động Scout – Italia
- Máy phân tích máu tự động Sysmex KX 21 – Mỹ
- Cân phân tích điện tử
- Các hoá chất, dụng cụ thông thường khác: cối chày sứ, ống xông, bơm tiêm, bông, găng tay, acid picric, cồn, toluen, NaCl 0,9%
Trang 35+ Phương pháp nghiên cứu:
Sử dụng các lô thỏ thí nghiệm:
- 1 lô đối chứng sinh lý
- Các lô thử, uống cao chiết từ lược vàng với các liều khác nhau
Mỗi ngày cho thỏ các lô thử thuốc uống thuốc và thỏ lô chứng uống nước
đã đun sôi để nguội 1 lần, kéo dài 60 ngày liên tiếp Lấy máu thỏ vào các thời điểm trước khi dùng thuốc, sau khi dùng thuốc 15 ngày, 30 ngày, 60 ngày và sau khi ngừng dùng thuốc 15 ngày
Các chỉ số theo dõi:
Theo dõi chức năng gan:
+ Định lượng AST và ALT trong máu theo phương pháp Reitman – Frankel dùng cơ chất L- Aspartat và L – Alanine
+ Định lượng protein toàn phần trong máu bằng phương pháp Biuret
+ Định lượng bilirubin trong máu bằng phương pháp so màu
Theo dõi chức năng thận:
+ Định lượng creatinin trong máu bằng phương pháp Jaffe
+ Định lượng ure trong máu bằng phương pháp Rappoport dùng men urease
Theo dõi chức năng tạo máu:
+ Đếm số lượng hồng cầu, bạch cầu và xác định huyết sắc tố trên máy phân tích máu tự động
Xét nghiệm mô học:
+ Cắt và đọc tiêu bản gan, thận sau khi dùng thuốc 60 ngày và sau khi ngừng dùng thuốc 15 ngày
+ Đơn vị thực hiện: Bộ môn giải phẫu bệnh - Trường Đại học Y Hà Nội
Đánh giá kết quả thí nghiệm:
So sánh sự thay đổi của các chỉ số sinh hoá và huyết học cũng như mô bệnh học của thỏ trước khi dùng thuốc với sau khi dùng thuốc 15 ngày, 30 ngày, 60 ngày và sau khi ngừng dùng thuốc 15 ngày Đồng thời so sánh các chỉ số trên của
lô thử thuốc với lô đối chứng cùng thời điểm xét nghiệm
Trang 36+ Mô tả thí nghiệm:
Thỏ mới nhập về được nuôi tại nhà chăn nuôi 1 tuần trước khi thí nghiệm
để thỏ thích nghi với điều kiện sống mới, đồng thời để loại bỏ những thỏ yếu không đạt tiêu chuẩn thí nghiệm
Chia thỏ ngẫu nhiên thành các lô: 1 lô đối chứng và các lô thử thuốc (mỗi lô
10 con)
Lô 1: Lô uống LVL liều 0,1g cao khô /kg thể trọng chuột
Lô 2: Lô uống LVL liều 0,3g cao khô /kg thể trọng chuột
Lô 3: Lô uống LVL liều 1,0g cao khô /kg thể trọng chuột
Lô 4: Lô uống LVT liều 0,02 g cao khô/kg thể trọng chuột
Lô 5: Lô uống LVT liều 0,06 g cao khô/kg thể trọng chuột
Lô 6: Lô uống LVT liều 0,2 g cao khô/kg thể trọng chuột
Lô 7: Lô đối chứng sinh lý
Các lô thỏ trên được uống với cùng thể tích là 5 ml/kg thể trọng Lấy máu thỏ theo đường tĩnh mạch tai và phân tích máu để có các chỉ số sinh hoá và huyết học vào các thời điểm sau:
- Lần 1: trước khi thí nghiệm
- Lần 2: sau khi uống thuốc 15 ngày
- Lần 3: sau khi uống thuốc 30 ngày
- Lần 4: sau khi uống thuốc 60 ngày
- Lần 5: sau khi ngừng uống thuốc 15 ngày
Sau 60 ngày uống thuốc: Lấy ngẫu nhiên mỗi lô 2-3 con thỏ để làm xét nghiệm
mô học của gan và thận
Trước khi huỷ thỏ kết thúc thí nghiệm, lấy ngẫu nhiên mỗi lô 2-3 con để làm xét nghiệm mô học của gan và thận
2.3.4 Phương pháp thử tác dụng kháng khuẩn [17]
Tác dụng kháng khuẩn được thử bằng phương pháp khuếch tán, đo vòng vô khuẩn trên đĩa thạch
Nguyên tắc: Mẫu thử (có chứa chất thử) được nhỏ vào giếng đục lỗ trên đĩa thạch
dinh dưỡng đã cấy vi sinh vật kiểm định, hoạt chất từ mẫu thử khuếch tán vào môi
Trang 37trường thạch sẽ ức chế sự phát triển của vi sinh vật kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn
1 Môi trường, dung dịch pha loãng
- Môi trường định lượng và môi trường tăng sinh chủng BA (g/l):
Beef heart, infusion 500,00 g
Natri clorid 15,00 g
pH sau khi tiệt khuẩn 7,3± 0,2
Sau khi hấp tiệt trùng, để nguội tới 50oC, thêm 5% (v/v) máu thỏ vô trùng, trộn đều
- Môi trường định lượng Mueller Hinton Agar (g/l):
Beef, infusion from 300,00 g
Casein acid hydrolysate 17,50 g Starch 1,50 g
pH sau khi tiệt khuẩn 7,3± 0,2
- Môi trường tăng sinh vi khuẩn Plate Count Agar (g/l)
Dung dịch kali dihydrophosphat 1M 50,0ml
Dung dịch natri hydroxyd 1M 46,8ml
Nước cất vừa đủ 1000ml
2 Chủng chỉ thị:
- Staphylococcus aureus
Trang 38Từ dung dịch gốc này pha loãng với dung dịch đệm pH 8,0 để được các dung dịch
có nồng độ là 0,1715g/ml (T2); 0,0858g/ml (T3); 0,0686g/ml (T4)
+ Mẫu cao LVL từ lá lược vàng: Cân 3,9511g nghiền mịn, thêm 12,0ml dung dịch đệm pH 8,0 được dung dịch gốc (P1)có nồng độ 0,3293g/ml Từ dung dịch gốc này pha loãng với dung dịch đệm pH 8,0 để được các dung dịch có độ pha loãng là 0,1647g/ml (P2); 0,0823g/ml (P3); 0,0659g/ml (P4)
Chuẩn bị hỗn dịch vi sinh vật:
Tăng sinh chủng Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenza, Klebsiella pneumoniae trên ống thạch nghiêng chứa môi trường BA, ủ 37±1oC/24h
ở điều kiện kị khí, riêng đối với S.aureus thì ủ ở điều kiện hiếu khí
Tăng sinh chủng Pseudomonas aeruginosa trên ống thạch nghiêng chứa
môi trường Plate count agar, ủ 37±1oC/24h
Gặt chủng bằng nước muối sinh lí, so sánh với độ đục Mcfarland số 2 để được hỗn dịch vi khuẩn có khoảng 6x 108 CFU/ml
Chuẩn bị dung dịch chuẩn:
- Chuẩn Quốc gia: gentamycin sulfat
Trang 39Thử nghiệm:
Chuẩn bị các đĩa petri vô trùng Đổ vào mỗi đĩa petri 22ml môi trường BA
(môi trường Mueller Hinton agar đối với Pseudomonas aeruginosa) đã được cấy
chủng vi sinh vật với tỉ lệ 2% Đối với mỗi chủng chuẩn bị 6 đĩa Mỗi nồng độ thử làm trên 3 đĩa Để môi trường đông ở nhiệt độ phòng Đục 6 giếng trên một đĩa môi trường
Lần lượt nhỏ 5 nồng độ chuẩn và một nồng độ thử vào các giếng thạch, mỗi giếng nhỏ 100µl Để khuếch tán 30 phút Ủ các đĩa ở 37±1oC/18-24h trong điều
kiện kị khí, riêng đối với S.aureus thì ủ ở điều kiện hiếu khí
Trang 40Sau khi thăm dò các nồng độ khác nhau của mẫu nghiên cứu, chúng tôi chọn được ra những nồng độ thích hợp để tiến hành nghiên cứu như sau:
Chia chuột ngẫu nhiên thành các lô thí nghiệm:
Lô 1: Lô uống LVL liều 0,06g cao khô /kg thể trọng chuột
Lô 2: Lô uống LVL liều 0,12g cao khô /kg thể trọng chuột
Lô 3: Lô uống LVL liều 0,24g cao khô /kg thể trọng chuột
Lô 4: Lô uống LVT liều 0,013 g cao khô/kg thể trọng chuột
Lô 5: Lô uống LVT liều 0,026 g cao khô/kg thể trọng chuột