Sơ bộ nghiên cứu thành phần hóa học và độc tính của cây càng cua ở việt nam

1 p BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO BỘ Y Tế TRƯỜNG Đạ I Họ C Dư ợ c HÀ Nộ I NGUYỄN ĐÌNH TUấ N S BỘ NGHIÊN CỨU THÀNH PHầ N HỐ HỌC VÀ ĐỘC TÍNH CỦA CÂY DÂY CÀNG CUA CRYPTOLEPIS BUCHANANI ROEM ET SCHULT; ASCLEPIADACEAE Ở VIệ T NAM LUẬN VĂN THẠC SỸ Dược HỌC Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc - độc chất Mã số : 03.02.05 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Tử An PGS-TS Hoàng Mạnh Hùng Hà Nội - 2002 ^ = Iffi J lỉ) i c Á m k Luận văn giúp đỡ nhiệt tình của: PGS.TS Trần Tử An, PGS.TS Hồng Mạnh Hùng bảo tận tình trực tiếp giúp đỡ tơi hồn thành mục tiêu đê tài PGS.TS Mai Tất Tố cán bộ,kỹ thuật viên môn Dược lý trường đại học Dược Hà nội giúp đỡ xác định LD50 chất độc DSCKII Lê Đình Bích giúp đỡ việc tìm mẫu nghiên cưú hình thái Ban giám hiệu, Phòng đào tạo sau đại học trường đại học Dược Hà nội; Ban lãnh đạo Viện KHHS, Lãnh đạo Phòng giám định Hố pháp lý thuộc Viện Khoa học hình tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình thực bảo vệ luận văn Nhản dịp xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu đó! DS Nguyễn Đình Tuấn MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ĐẶT VẤN Đề CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Vài nét Dây cua 1.2 Tinh hình nghiên cứu thành phần hố học Cryptonepis buchanani Rome.et.Schult; Asclepiadaceae 12 1.3 Phương pháp chung phân tích độc chất 16 1.4 Kết luận 18 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP THựC NGHIỆM 19 2.1 Lấy m ẫu 19 2.2 Dụng cụ hoá chất 19 2.3 Phương pháp sàng lọc chất độc 19 2.4 Các điều kiện xác định chất độc 21 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24 3.1 Kết sàng lọc chất độc 24 3.2 Xây dựng quy trình chiết xuất 25 3.3 Về thành phần chất đ ộ c 28 3.4 Tác dụng sinh học độc tính .41 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 47 4.1 Kết luận 47 4.2 Đề xuất 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC 54 KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT A1,A2 : Glycosid dịch chiết 1, cho vết lớn có Rf (0,15 0,43) sắc ký lớp mỏng chiều DCAX : Dịch chiết dung môi mơi trường acid DC1 : Dịch chiết Glycosid tồn phần (thu sau tiến hành theo qui trình) DCK : Dịch chiết dung môi môi trường kiềm DDA : Dung dịch pha từ gam DC1 thành 10 gam Đ Ặ T V Â N ĐỂ Nước ta nằm vùng khí hậu nhiệt đới, nên có thảm thực vật đa dạng phong phú Nó góp phẩn giải nhu cầu đời sống ăn mặc, ở, thuốc chữa bệnh.; Từ lâu bên cạnh việc tìm hiểu sử dụng mặt có lợi cỏ, người ta quan tâm đến mặt trái nó, tác hại độc sức khoẻ người gia súc Lĩnh vực nghiên cứu độc liên quan lộng rãi đến nhiều ngành khoa học, kinh tế, đặc biệt liên quan chặt chẽ với tư pháp pháp y việc giám định vụ ngộ độc đầu độc cỏ Trong hai mươi năm qua Viện Khoa học Hình - Bộ Cơng an, hàng năm giám định trung bình khoảng vài chục vụ án liên quan đến cỏ độc Qua nghiên cứu vụ ngộ độc chưa rõ nguyên nhân có nhiều khả số vụ án có liên quan đến dây cua mọc hoang phổ biến vùng đồi núi nước ta Trong dân gian thường dùng thân, để chữa mun nhot, mẩn ngứa, tri còi xương, sữa, rễ trị chẩy máu cam [3, 7, 22] Cây có đặc điểm thực vật giống với Hà thủ ô trắng (Streptocaulon javentas Merr, Asclepiadaceae) có độc Nhưng đến Việt nam chưa có cơng trình nghiên cứu thành phần hố học độc tính liên quan đến Dây cua Trong thực tế khoa học hình cho thấy có nhầm lãn với Hà thủ ô trắng Người la dùng rễ, củ sắc uống dãn đến ngộ độc chết người [3, 7j Chính chúng tơi đặt vấn đề nghiên cứu xác định sơ số đặc tính chất độc có Dây cua Việt nam, nhằm phục vụ cho cổng lác Giám định lư pháp Để thực mục tiêu này, luận văn có nội dung chính: - Tìm phương pháp chiết xuất tách chất độc từ Dây cua - Xác định số tính chất chất độc - Sơ đánh giá khả giám định tư pháp thơng qua thực nghiệm, phân tích chất độc C H Ư Ơ N G Ị : TổNG QUAN 1.1 VÀI NÉT VỂ CÂY DÂY CÀNG CUA 1.1.1 Đặc điểm Dây cua Tên khoa học: Cryptolepis buchanani Roem et Schult; Asclepiadaceae Tên khác: Dây sữa, ẩn lân buchanan Hình thái thực vật : Cây thảo, leo thân cuốn, thân non màu xanh lục, nhẵn lơng, thân cành già mầu nâu xám hay nâu đỏ, có nốt sần Vỏ có hình vẩy đường kính thân - mm, đoạn gốc lớn khoảng 15 - 25 mm ĩ 3,6,7 Lá đơn mọc đối phiến hình bầu dục thn dài, có mũi nhọn đỉnh, gốc phiến nhọn tù mặt phiến xanh bóng, mặt màu xanh nhạt bạc Gân phụ gồm 14 - 25 đơi xếp sít sơng song gần vng góc với gân Phiến dài - 20 cm, rộng 2,2 - lcm, mũi nhọn dài - 5mm cuống dài - mm Lá có nhựa mủ Hình 1.1: Anh Dây cua Rễ gồm rễ nhiều rễ phụ, mầu nâu đỏ có nhiều nhựa mủ, rễ dài tới lm phân nhánh tuỳ theo nặng tới vài kg Cụm hoa xim ngắn kẽ lá, mang nhiều hoa nhỏ màu vàng, cuống cụm hoa dài 2- 4cm Hoa dài 8mm, nụ 4- 6mm, có đài nhọn Tràng hoa liền thành ống ngắn, thân hình mũi mác vặn soắn nụ Tràng phụ có cuống ngắn, đầu hình trái xoan Chỉ nhị rộng bao phấn có nhiều lơng, trung đới có mũi nhọn [3,7]* Quả gồm hai đại, dài - 9cm, rộng khoảng - 14mm xếp đối diện tạo thành đường thẳng, vỏ hố gỗ Hạt dẹt, có mào lơng trắng, dài đến 2,5cm Tồn khơng có lơng có nhựa mủ trắng Hình 1.2: Ảnh cành hoa dây cua (Cryptolepis buchanaiỉi Roem et Schult; Asclepiadaceac) 1.1.2 Phân bố Cây trồng, thường mọc hoang phổ biến vùng đồi núi nước ta, rừng ven rừng, từ vùng thấp độ cao lOOOm gặp nhiều Hà Tây, Lạng Sơn, Thái Nguyên, Thanh Hố, Đồng Nai, Tây Ninh, An Giang: Ngồi có Lào, nam Trung Quốc, Thái Lan, Myanma, Ấn Độ, Xrilanca [3,6,7] 1.1.3 Đặc điểm vi phẫu ~ ~ Hìnhl - 3: Anh vỉ phâu rê Dây cua £ ^ //ìn/ỉ / - 4: Anh vi phâu Dây cua Do đó: LD50 = 606,25 ± 49,86 (mg/kg) Vậy LD50 (DDA) = 606, (556- 656) mg/kg Quy đổi ta có : LD50 (DC1) =1 ( 1 - 131)mg/kg (do DDA pha loãng 51ần từ DC1) Tương ứng với 25,5 g dược liệu khô xử lý phơi nắng sấy khô cho lkg cân nặng 3.4.2 Giám định ngộ độc thỏ Lấy gam DC1 hồ cồn 70°, sau pha lỗng dung dịch NaCl 0,9% đến vừa đủ lOg (gọi DDA) Tương tự với chuột nhắt trắng tiến hành gây ngộđộc thỏ đường uống với DDA Sau gây ngộ độc, quan sát triệu chứng ngộ độc thời gian chết ghi bảng 3-2 Bảng 3-2: Bảng thử độc tính DDA thỏ s T T Trọng lượng thỏ (kg) Liều dùng DDA (ml) Thòi gian chết (phút) 2,1 30 1,8 30 2,2 35 Triệu chứng ngộ độc Biểu khó thở, co giật, tím tái chết Mổ quan sát phủ tạng thỏ sau chết nhận thấy: thận, gan khơng có biểu đặc biệt Tim thu nhỏ, phổi ứ máu Sau thỏ chết, tiến hành mổ lấy toàn phủ tạng thỏ : Gan, Tim, Phổi, Thận tiến hành chiết sau: Nghiền kỹ phủ tạng Thỏ sau ngâm với cồn 70°, lọc lấy dịch lọc Chiết hỗn hợp Cloroform - isopropanol (9:1) lần, gộp dịch chiết lại lắc với ether dầu hoả để loại chất béo Đem bốc dịch chiết sau loại chất béo áp suất giảm, cắn dịch chiết phủ tạng Thỏ xác định phương pháp hoá lý:phổ ƯV-VIS, sác ký khí, sắc ký lớp mỏng cho kết sau Trên sắc đồ sắc ký khí dịch chiết phủ tạng Thỏ ta thấy có hai Pick lớn với thời gian lưu giống với thời gian lưu DC1, Pick lại có cường độ nhỏ (Hình - 12) Sắc đồ phù hợp với sắc đồ DC1 Abundance 70000 TIC: 2216.D 14 04 I 65000 60000 55000 50000 45000 40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 I| Time~> I M u P fn 1 ,T ly rT-iT-Ị-rTf , r T r r jrrrrrr-r -tT-T-J-J-TTM Ị-t-T-r-T-Ị r-T^T l 'p v - r q -n T’ rfw-r-y f r I T r j-f f n n 1fii‘fT ^rrT-rỊ-r T r TTrTT T -p T r?TTT7 T r r-Ỵ•T-T-r-r-Ỵ-r-r-r-T I’r1 T tT r n "n'r m T r r n TT' I r1rTT"rfih rr 9.50 10.00 10.50 11.00 11.50 12.00 12.50 13.00 13.50 14.00 14.50 15.00 15.50 16.00 16.50 17.00 17.50 18.00 18.50 Hình -12: Sắc ký đồ dịch chiết phủ tạng thỏ - Trên sắc ký đồ phổ hấp thụ tử ngoại dịch chiết phủ tạng Thỏ thử cho Pick lớn 207nm vai 280nm, Pick lại có cường độ hấp thụ khơng đáng kể (hình 3-13) Các phổ phù hợp với phổ DC1 M e t h o d file Infor ma ti on M5 Data File O v e r l a i d Spectra: 1.75 15 1.25 0.75 05 0.25 ro CM ÌỘ, ip 200 (Í — r— 300 250 P e a k s (nm) Name 207 280 485.0 R e p o r t g e n e r a t e d by : Thao — r — •*— I'— 350 400 Abs(AU) Va l l e y s ( n m ) Ab s(AU) 77 10 3?608 71 E - 497.0 453.0 10 63 E- 462.0 E- E - Signature! Hình -13: Phổ hấp thụ tử ngoại dịch chiết phủ tạng thỏ •— 450 _Wavelength (nr Sắc ký lớp mỏng sắc ký đồ vết mẫu dịch chiết phủ tạng Thỏ có Rf tương ửng với Rf vết mẫu DC1 Tóm lại: Phổ hấp thụ tử ngoại, sác ký khí sắc ký lớp mỏng dịch chiết phủ tạng Thỏ cho kết giống với chất so sánh Như áp dụng qui trình chiết xuất đề xuất ta tìm chất độc phủ tạng Thỏ bị chết ngộ độc rễ Dây cua Dựa vào qui trình chiết xuất số tính chất chất độc: phổ UV-VIS, sắc ký lớp mỏng, sắc ký khí, ta giái vụ án hình có liên quan đến ngộ độc Dây cua CHƯƠNG 4; KẾT luận để XUÂT 4.1 KẾT LUÂN Sau thời gian nghiên cứu tiến hành thực nghiệm phương pháp chiết xuất, xác định số tính chất chất độc khả giám định ngộ độc Dây cua Việt nam, chúng tơi có số kết luận sau: 4.1.1 Chất độc Dây cua Cây Dây cua nhân dân ta dùng làm thuốc chữa bệnh nhiều hình thức mục đích khác Dùng phương pháp sàng lọc theo nhóm chất độc, thu kết Dây cua nước ta sau: * Trong Dây cua khơng có chất (Cyanogens) độc sinh Hydrocyanid * Dùng phương pháp phân lập hai môi trường Cloroform isopropanol thử độc tính chuột nhắt trắng cho kết quả: + Khơng có chất độc mang tính kiềm Dịch chiết mơi trường kiềm khơng gây nhiễm độc cho chuột nhắt trắng + Chất độc Dây cua hỗn hợp Glycosid tim 4.1.2 T hành phần LD 50 chất độc Trên sở kết sàng lọc, đề xuất qui trình chiết xuất chất độc xác định sơ thành phần chất độc.Dịch chiết Cloroform Propanol mơi trường acid dùng phân tích * Nghiên cứu độc tính cấp - Xác định LD50 Dùng phương pháp Behrens - Kărber thử LD50 dịch chiết toàn phần chuột nhắt trắng chủng SWISS, trọng lượng trung bình 20g Kết cho LD50 (DC1) = 121 (111 - 131) mg/kg cân nặng, tương ứng với khoảng 25,5g dược liệu khô xử lý cách phơi nắng sấy cho lkg cân nặng * Dùng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng, quang phổ hấp thụ tử ngoại, cho thấy dịch chiết Cloroform -isopropanol môi trường acid chứa hỗn hợp Glycosid tối thiểu chất Trong hai Glycosid chúng tơi gọi AI A2 Nó có số tính chất sau: - Phổ hấp thụ tử ngoại có cực đại hấp thụ bước sóng 206 - 207nm đỉnh vai 278 - 280nm, đo môi trường trung tính (Ethanol) - Phổ hấp thụ tử ngoại có cực đại hấp thụ bước sóng 218 - 226 nm đỉnh vai 275 - 286nm, đo môi trường kiềm - Sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi Cloroform - n Butanol (9:1) cho hai vết Rf 0,15 0,43 + Phổ hồng ngoại AI A2 có hình dạng phổ đỉnh Glycosid tim Kết hợp phương pháp hoá học phổ hấp thụ tử ngoại cho thấy AI A2 có cấu trúc Glycosid tim 4.1.3 Vê khả giám định chất độc Kết sơ thu Thỏ cho thấy: * Đã đề xuất qui trình thích hợp để chiết Glycosid tim từ phủ tạng Thỏ bị ngộ độc rễ Dây cua * Các tính chất dịch chiết từ phủ tạng Thỏ như: sắc ký lớp mỏng, sắc ký khí, quang phổ hấp thụ tử ngọai giống DC1 lấy từ rễ Dây cua Điều cho thấy dùng DC1 để làm chuẩn cho việc giám định ngộ độc rễ Dây cua * Cây Dây cua gây ngộ độc cấp tính với triệu chứng đau đầu, chóng mặt, nơn mửa đau bụng mệt lả Ngộ độc nặng bị truỵ tim mạch (không đo huyết áp), chân tay lạnh ngắt, mặt tái nhợt co giật chết ngừng tim Kết gợi ý cho sử dụng việc giám định chất độc 4.2 ĐỂ XUẤT Để áp dụng vào thực hành giám định độc chất ngộ độc Dây cua Việt nam, xin đề xuất vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu 4.2.1 Nghiên cún xác định cấu trúc tính chất Glycosid Liệu hai chất AI A2 kết chiết tách từ Dây cua phải chất tinh khiết hoá học hay gọi hỗn hợp vài chất Mặt khác liệu có phải Cryptosin (Cryptanosid A) Cryptanosid c không ? 4.2 Nghiên cứu dược động học súc vật thí nghiệm Cần nghiên cứu phân bố, chuyển hoá, đào thải hoạt chất rễ Dây cua Kết nghiên cứu giúp xác định chắn điều kiện giám định độc chất ngộ độc Dây cua Đó sở để tìm khác nhau, đóng góp, bổ sung vào lĩnh vực nghiên cứu này, tìm chất có ích ngành dược, khoa học hình TÀI LIÊU THAM KHẢO Bộ mơn phân tích kiểm nghiệm Trường Đại học Dược.(1984) Bài giảng Kiểm nghiệm độc chất - NXB Y học Hà nội Bộ môn Thực vật - Trường Đại học Dược Thực vật dược 1997 Tr 116 Võ Văn Chi (1997) Từ điển thuốc Việt nam - NXB Y học Hà nội (Tr 367 - 368) Vũ Văn Chuyên (1991) Bài giảng thực vật học - NXB Y học Hoàng Mạnh Hùng (1991) Ngộ độc thảo mộc lĩnh vực hình Việt nam Hội thảo quốc gia ngộ độc cấp hồi sức cấp cứu Phạm Hoàng Hộ (2000) Cây cỏ Việt nam tập - - NXB trẻ (Tr 728) ' Trần Công Khánh - Phạm Hải — V \yJMi Cây độc Việt nam - NXB Y học (Tr 103 - 105) Đỗ Tất Lợi (1999) Cây thuốc vị thuốc Việt nam - NXB Y học \ J Phòng Hố - Viện khoa học hình Tổng kết cơng tác giám định từ 1980 - 1999 Đôc chất hoc - NXB Y học 11 Từ Văn Mặc (1995) Phân tích hố lý - NXB khoa học kỹ thuật Hà n ộ i 12 Nguyễn Văn Đàn - Nguyễn Việt Tựu (1985) Phương pháp nghiên cứu hoá học thuốc - NXB Y học 13 Ngô Văn Thu - Đống Viết Thắng (1986) Bài giảng hoá học thuốc - Tập Glycosid tim NXB Y học 14 Ngô Văn Thu (1998) Bài giảng Dược liệu - Tập 15 Phan Quốc Kinh 1984 Các chất Steroid dùng làm thuốc - NXB Y học 16 Đỗ Tất Lợi - Ngô Văn Thu (1970) Dược liệu học vị thuốc Việt nam - - NXB Y học (Tập Glycosid tim) 17 Đỗ Tất Lợi - Ngô Văn Thu (1970) Dược liệu học vị thuốc Việt nam - - NXB Y học (Tập sắc ký lớp mỏng) 18 Trần Trung Nam - Nguyễn Hữu Bảng (1974) Sắc ký lớp mỏng - NXB Y học (Tr 18 - 122 203-204) 19 Phan Quốc Kinh (1973) Giáo trình lý thuyết hố dược - Tập Trường Đại học Dược Tiếng nước 20 Rao VR, Banning JW Department of pharmacology, College of pharmacy and Allied Health Professions, Wayne state University, Detroit, MI 48022 (1990) "Interactions o f Cryptosin with mammalian cardilac beta - a drenoceptors" Drug Chem Toxicol; 13 (2 - 3): 173-94 J 21 Vasanth ; Sarada ; Gopral ; R.Hamsaveni [ Captain Srinivesa Murti Drug Research insitute of Ayurveda, madras 600 106 - India ] 1998 “ Anti bacterial activy of Cryptolepis buchanani “American Chemical Society 22 R.Venkatesnara ; K Sankara ; CÓ Vaidyanathan (Dep Biochem , Indian inst Sci., Bangalore, 560012 India) 1987 “ Cryptosin - a new cardenolide in tissue culture and intact plants of Cryptolepis buchanani Roem & Schult “Plant Cell Reports , (4), - (Eng) 23 Prusho thaman ; Kozhiparambil K ; Vasanth ; Sadara (Captain Srrinivasa murti Drug Res inst Ayurveda, Madras 600106, India) 1988 “ New sarverogenin and iso samerogenin glycosides from Cryptolepis buchanani (asclepiadaceae) Rev Latinoam Quim , 19 (1), 28 - 31 (Eng) 24 Narendra N ; Viswmitra M.A ; Venkateswara (Dep Phys., Indian inst Sci., Bangalore, 560012 Indian) 1987 “ Structure of Cryptosin Monohydrate - a New cardioactive Glycoside “ Acta Crystallogr C43, 1562 - 1564 (Eng) ■ 25 Venkateswara ; Dipak D ; Baming J.w (Dep Biochem., Indian inst Sci., Bangalore, India) “ Cryptosin induces backbone structural changes in cadiac Na= and K + depended adenosinetriphossphatase “.Biochem I n t ; 22 (2) : 287 - 94 26 Rao VR, Banning JW.1990 “ interactions of cryptosin with mammalian cardiac dihydropyridine specific calcium channels “.Life sci ; 47 (18): 1667 - 76 27 Brock bank WJ, Lynn KR (1979) Biochem Biophys Acta 578 : 13 - 16 28 Enson JM, Seiber JW (1978) J chromatogr 148 : 521 - 523 ^ 29 Stahl E (1969) In :Stahl E (ed) Thin - Layer Cromatography A laboratory hand book Ed.Ill: Springer - Verlag Berlin.p.p 341 - 46 30 H.T.A cheung, T.R Watson, J.N.Seiber, J.c.s Perkin I, 2169 (1980) 31 The Weath of India, Raw Materials Vol.I, 163, CSTR New Dehli (1959) 32 Shopee C.W.1964 “ chemistry of the steroids London 33 Macek.K 1972.“ pharmaceutical applications of ther layer and paper chromatography Amsterdam 34 Guignard L (1916), Investigation and Determination of Hydrocyanic acid in String Beans (Haricot), Ann Falsif, 9, p:74:95 PHỤ LỤC ~ Phụ lục 1: Anh rê Dây cua (1) DC1 (2) Dịch chiết phủ tạng thỏ Phụ lục 2: Kết sắc ký lớp mỏng dịch chiết phủ tạng thỏ DC1 c: CO c: o • a> e dX oG 2: 4-^ CD 'XI -4-> o d c: a> * ■ ỄSc XJ C O u CD CD c n a ) Cl d o CO Ự) Ơ) r : CD CL c 4~> Ể5 CD 4~> > CD 13 Li_ c ZJ CTJ h- CO O) *— IS