Nghiên cứu thành phần hóa học và độc tính của dược liệu hoàng kinh (vitex negundo linn )

NGHIÊN CỬU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ Đ ộ c TÍNH CỦA DƯỢC LIỆU HOÀNG KINH iVìtex negundo Linn.. Tóm tắt Định tính các nhóm chất hữu cơ trong 3 phân đoạn dịch chiết n-hexan, methanol và nước b

NGHIÊN CỬU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ Đ ộ c TÍNH CỦA DƯỢC LIỆU

HOÀNG KINH iVìtex negundo Linn.)

Nguyễn Tiến Tiẽp' HDKH: TS Đỗ Quyên^ ThS Phạm Tuấn Anh^ ThS Lê Thanh Bình^ ThS Nguyễn Thị Thanh Tú^

’l ớ p A3K64 - Trường Đại học Dược Hà Nội

^Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội

^Khoa YHCT- Đ ại học Y H à Nội

Từ khóa: Vitex negundo Linn., Hoàng kinh, độc tính.

Tóm tắt

Định tính các nhóm chất hữu cơ trong 3 phân đoạn dịch chiết n-hexan, methanol

và nước bằng phản ứng hóa học đặc trưng đã xác định được trong lá cây Hoàng kinh

có chứa tinh dầu, sterol, Aavonoid, alcaloid, iridoid, đường khử, acid hữu cơ, triterpenoid và gôm (chất nhầy) Đã phân tích thành phần tinh dầu lá Hoàng Kinh bằng GC-MS Tinh dầu lá tại thời điểm mùa đông và mùa hè khác nhau cả về hàm lượng và thành phần cấu tử Cao Hoàng kinh không có độc tính cấp trên chuột ở liều cao nhất chuột có thể dung nạp được (620g/kg) và chưa phát hiện thấy độc tính bán trường diễn trên thỏ ở liều 3,2g/kg và 9,6g/kg

Đặt vấn đề

Cây Hoàng kinh có tên khoa học là Vitex negundo L., còn gọi là cây Mầu kinh,

Ngũ trảo, Chân ch im thuộc họ c ỏ roi ngựa (Verbenaceae) Đây là cây gỗ nhỏ hay

bụi thơm, được trồng và mọc hoang ở nhiều tỉnh thành nước ta [4], Những nghiên cứu ở nước ngoài cho thấy lá Hoàng kinh có nhiều tác dụng dược lý như kháng khuẩn, chống nấm, chống oxy hóa, chổng dị ứng, hạ sốt [6], trong đó nổi bật là tác dụng chống viêm, giảm đau [7] ở vùng Nam trung bộ nước ta, người dân thường dùng lá tươi giã nhỏ đắp vào chỗ sưng đau hoặc sắc nước uống để chữa các bệnh lý

về khớp cho kết quả rất tốt Tuy nhiên đến nay chưa có đề tài nào trong nước nghiên cứu về hóa học cũng như tính an toàn và hoạt tính sinh học của dược liệu này Do vậy chúng tôi thực hiện báo cáo này với hai mục tiêu: (1) Nghiên cứu thành phần

hóa học; (2) đánh giá tính an toàn của lá cây Hoàng kinh Vitex negundo L.

Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

Nguyên liệu

- Nguyên liệu nghiên cứu: Lá cây Hoàng kinh thu hái tại Hà Nội vào tháng 6 và

11 năm 2013 Mau tiêu bản được lưu tại phòng tiêu bản Bộ môn Thực Vật, trường

Đại học Dược Hà Nội (Mã số HNIP/18050 A/13) Mầu dược liệu sau khi được rửa sạch, đem cắt nhỏ, một phần dùng tươi để cất tinh dầu; một phần sấy khô trong tủ sấy (50°C) rồi nghiền thành bột, bảo quản trong túi nilon kín, dùng để định tính các nhóm chất

- Cao lá Hoàng Kinh (CHK) để đánh giá tính an toàn được chuẩn bị như sau:

1000 gam dược liệu (hàm ẩm 10%) được chiết hồi lưu với dung môi EtOH 70° trong 5h, quá trình chiết được lặp lại 3 lần Gộp dịch chiết, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cao lá Hoàng Kinh tỷ lệ 10:1

- Động vật thỉ nghiệm: Chuột nhắt trắng chủng Swiss, thỏ đều đạt tiêu chuẩn

được cung cấp bởi Viện Vệ sinh dịch tễ

Phương pháp nghiên cứu

- Định tính một số nhóm chất hữu cơ: Chiết xuất lá Hoàng Kinh thành 3 phân đoạn dịch chiết có độ phân cực tăng dần theo phương pháp của trưÒTig Đại học Dược Rumani: bột lá (50g) lần lượt được chiết hồi lưu với các dung môi n- hexan, methanol, nước Mỗi dung môi tiến hành 3 lần, mỗi lần 30 phút Bã dược liệu sau khi chiết được làm khô dung môi trước, rồi chiết bằng dung môi tiếp theo Gộp, lọc

và cất thu hồi dung dưới áp suất giảm riêng dịch chiết từng phân đoạn đến khi còn lại khoảng lOOml dịch chiết mỗi loại Xác định các nhóm hợp chất trong từng dịch chiết bằng các phản ứng hóa học đặc trưng [1], [2],

+ Phân đoạn dịch chiết n-hexan: xác định chất béo, tinh dầu, carotenoid, sterol, alcaloid, coumarin, anthraquinon và flavonoid

+ Phân đoạn dịch chiết MeOH: xác định alcaloid, coumarin, glycosid tim, anthranoid, flavonoid, iridoid, triterpenoid, tanin, saponin, đưÒTig khử, acid hữu cơ + Phân đoạn dịch chiết nước: xác định alcaloid, anthraglycosid, ílavonoid, glycosid tim, tanin, saponosid, iridoid, đường khử, acid hữu cơ, gôm (chất nhầy)

- Nghiên cứu tinh dầu trong lá bằng phương pháp cất kéo hơi nước, sử dụng bộ dụng cụ cất cải tiến Thực hiện 3 lần, mỗi lần 180g lá tươi (độ ẩm 63%) Thời gian cất: 2,5 giờ/lần Sau khi cất kéo, đọc thể tích tinh dầu thu được rồi loại nước bằng

Na2S0 4 khan, sau đó pha loãng với dung môi CHCI3 đến nồng độ thích hợp (10'^) Phân tích thành phần các chất bay hơi trong tinh dầu bằng GC-MS (tiến hành trên hệ

thống GC Agilent 7890A Cột sắc kí Agilent 19091 s - 433 có kích thước 30 m X

250 |im, độ dày phim 0.25 Ịim Nhiệt độ bắt đầu là 45°c giữ trong 2 phút, sau đó

tăng dần 5°c/phút đến 200°c, rồi tăng 10°c/phút đến 250°c, giữ trong vòng 2 phút

Khí mang Heli, tốc độ dòng Iml/phút Detector MS Agilent 5975C)

- Nghiên cứu về độc tính cấp và xác định LD50 của cao Hoàng Kinh: Tiến hành trên chuột nhắt trắng bằng đường uống theo phương pháp Litchfield - Wilcoxon và hướng dẫn của WHO [9, 10], Chuột nhắt được chia thành 5 lô, mỗi lô 10 con, được uống mẫu thuốc nghiên cứu 3 lần /24h theo liều tăng dần từ 124 g/kg đến 620 g/kg (liều tối đa chuột có thể dung nạp được) Theo dõi tình trạng chung và số lượng chuột chết ở mỗi lô trong 72 giờ Tiếp tục theo dõi tình trạng của chuột đến hết ngày thứ 7 sau khi uống thuốc thử lần đầu

- Nghiên cứu độc tính bán trường diễn: Thỏ được chia làm 3 lô, mỗi lô 10 con

Lô chứng: uống nước cất 2ml/kg/ngày Lô trị 1: uống Cao Hoàng kinh liều 3,2 g dược liệu/kg (liều có tác dụng tương đương liều dùng trên người, tính theo hệ số 4)

Lô trị 2; uống Cao Hoàng kinh liều 9,6 g dược liệu/kg (gấp 3 lần lô trị 1) Thỏ được uống nước cất hoặc thuốc ngày một lần vào buổi sáng liên tục trong 8 tuần Đánh giá tại các thời điểm trước uống thuốc (To), sau 4 tuần (T4), sau 8 tuần (Tg) về tình trạng chung, thể trọng, chức năng tạo máu, chức năng gan, chức năng thận [9, 10]

K ết quả và B àn luận

Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hỏa học

Phân đoạn dịch chiết n-hexan cho kết quả dương tính với nhóm tinh dầu, sterol Phân đoạn dịch chiết MeOH cho kết quả dương tính với alcaloid, ílavonoid, iridoid, triterpenoid, đường khử, acid hữu cơ

Phân đoạn dịch chiết nước cho kết quả dương tính với flavonoid, iridoid, đường khử, acid hữu cơ và gôm (chất nhầy)

Nhận xét: Bằng phản ứng hóa học đã xác định được trong lá Hoàng kinh có tinh dầu, sterol, flavonoid, alcaloid, iridoid, đưòng khử, acid hữu cơ, triterpenoid, và gôm (chất nhày) Các nhóm flavonoid, iridoid, đường khử, acid hữu cơ cho kết quả dương tính ở cả hai phân đoạn dịch chiết MeOH và nước Trong đó đáng chú ý là flavonoid, một nhóm chất quan trọng trong thực vật, sở hữu nhiều tác dụng như chống oxy hóa, chống viêm, chống gốc tự d o

Hàm lượng tinh dầu lả Hoàng Kinh và phân tích thành phần

Bảng 2 Kết quả phân tích tinh dầu lá Hoàng kinh thu hái mùa hè và mùa đông

(% )

M ùa đông (% )

1 Hàm lượng tinh dầu (theo dược liệu khô) 0,81 0,21

Thành phần

chính của

tinh dầu

ß - Pinene

7 - Terpinene

a - Terpinene

ß - Caryophyllene

a - humulene

Germacrene - D Valencene Caryophyllene oxide

0! - Cadinol Dehydroabietan

0

¥

3,34 0,25 0 21,95 23,36 2,17 4,14

0,94 40,60 3,04 2,88

0 3,18

0

0 Kết quả nghiên cứu cho thấy lượng tinh dầu trong mẫu lá thu hái vào mùa hè (0,81%) cao hơn nhiều so với mùa đông (0,21%) Tiến hành phân tích tinh dầu từ hai mẫu nghiên cứu bằng GC - MS thu được kết quả; mẫu lá mùa đông phát hiện được 47 chất nhưng chỉ có 21 chất xác định được cấu trúc, trong số đó, tỷ lệ sesquiterpen là 61.84%; mẫu lá mùa hè tương ứng là 48 chất - 15 chất - 51.07% Trong mẫu lá thu hái mùa hè còn xác định được Dehydroabietan - là một diterpen

Tỷ lệ các thành phần tinh dầu giữa hai mẫu cũng khác nhau đáng kể ở mẫu lá mùa

đông, ß - Caryophyllen là thành phần chính chiếm 40.60% (mùa hè là 3.34%, rất

thấp) Trong khi đó, ở mẫu mùa hè, Caryophyllene oxide chiếm tỉ lệ cao nhất với 23.36% (mùa đông là 3.18%) /3-Caryophyllen, Caryophyllene oxide và valencene

là những thành phần chính trong tinh dầu lá đã được chứng minh là có tác dụng chống viêm giảm đau hiệu quả

Ket quả thử độc tỉnh cấp

Sau khi uống cao Hoàng kinh, tất cả các lô không có chuột nào chết trong vòng 72 giờ ở các lô từ lô 1- lô 3 (tương ứng liều Hoàng kinh là 124g dược liệu khô/kg đến liều 372g dược liệu khô/kg), chuột ăn uống, vận động bình thường, không bị khó thở, đi ngoài phân khô ở lô 4 và lô 5 (tương ứng với liều 496g dược liệu khô đến 620g dược liệu khô) một số chuột có hiện tưọng ỉa chảy trong vòng 24 giờ sau khi uống, những ngày sau về bình thường Hoàng kinh là một dược liệu mới và ít được

đề cập tới trong các y văn trước đây Xác định độc tính cấp và liều chết 50% để đánh giá mức độ độc và có cơ sở chọn liều thử tác dụng cho các bước nghiên cứu tiếp

theo Chuột nhắt đã được uống cao lỏng Hoàng kinh ở nồng độ đậm đặc nhất, thể tích tối đa 0,25 ml/lOg và số lần tối đa 3 lần trong 24 giờ, tương đương 620 g dược liệu/kg thể trọng chuột Tính theo kinh nghiệm dân gian thì chuột nhắt đã uống gấp 64,61 lần liều trên người (tính hệ số ngoại suy trên chuột nhắt 10) Theo hướng dẫn

của WHO và hưóng dẫn nghiên cứu thuốc mới Hoàng kinh là dược liệu an toàn [7 Kết quả thử độc tỉnh bán trường diễn

Tinh trạng chung và sự thay đổi thể trọng của thỏ: Tình írạng chung; Trong thời

gian thí nghiệm, thỏ ở cả 3 lô hoạt động bình thường, nhanh nhẹn, mắt sáng, lông mượt, ăn uống tốt, phân khô Sự thay đổi thể trọng thỏ: biểu đồ la

Đánh giả chức năng tạo máu: Theo WHO, tinh trạng chung, trọng lượng cơ thể và

các chỉ số huyết học là những xét nghiệm bắt buộc khi đánh giá độc tính của thuốc thử Vì vậy, các xét nghiệm công thức máu của thỏ thí nghiệm được xác định Sau

4 tuần và 8 tuần uống cao Hoàng kinh, các chỉ số máu của thỏ (cả hàm lượng huyết sắc tố, hematocrit, thể tích trung bình hồng cầu, công thức bạch cầu) ở cả hai lô trị đều thay đổi không có ý nghĩa thống kê so với trước khi dùng (p >0,05) và so với lô chứng cùng thời điểm Như vậy Hoàng kinh không có độc tính với cơ quan tạo máu

Đánh giá chức năng gan: Trong cơ thể gan là cơ quan đảm nhận nhiều chức năng

rất quan trọng Khi đưa thuốc vào cơ thể có thể gây độc với gan, làm ảnh hưởng đến chức năng gan Vì vậy, khi đánh giá độc tính của thuốc thì nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc đối với chức năng gan là rất cần thiết [5] Để đánh giá mức độ tổn thương

tế bào gan, người ta thường định lượng nồng độ các enzym có nguồn gốc tại gan có trong huyết thanh Trong nghiên cứu này, sau 4 tuần và 8 tuần uống thuốc hoạt độ ALT, AST và các chỉ số đánh giá chức năng gan (bilirubin toàn phần, albumin và cholesterol trong máu) ở cả 2 lô nghiên cứu đều nằm trong giới hạn bình thường (p>0.05)

Đánh giá chức năng thận: Thận là cơ quan bài tiết Khi vào cơ thể thuốc có thể gây độc, làm tổn thương thận Đánh giá chức năng thận thường dùng xét nghiệm định lượng creatinin máu Creatinin là thành phần đạm trong máu ổn định nhất, chỉ phụ thuộc vào khả năng đào thải của thận Khi cầu thận bị tổn thương, nồng độ creatinin máu tăng Nồng độ creatinin trong máu thỏ sau uống cao Hoàng kinh không có sự thay đổi khác biệt với lô chứng và so sánh giữa hai thời điểm trước và sau khi uống thuốc thử (p>0,05)

Thay đổi về mô bệnh học sau 8 tuần dùng thuốc:

- Đại thể: Trên tất cả các thỏ thực nghiệm không quan sát thấy thay đổi bệnh lý

nào về mặt đại thể các cơ quan tim, phổi, gan, lách, tụy, thận và hệ thống tiêu hóa

- Vi thể:

+ Hình thái vi thể gan: Lô chứng: hình ảnh gan bình thường, có một số vị trí bị

thoái hóa nhẹ Lô trị 1; hình ảnh gan bình thường, một vài vị trí bị thoái hóa nhẹ Lô trị 2: hình ảnh gan gần như bình thường

+ Hình thái vi thể thận: Tất cả các lô đều có hình ảnh thận bình thường.

Giải phẫu đại thể và vi thể gan thận là chỉ số bắt buộc idii đánh giá độc tính bán trường diễn theo hướng dẫn của WHO [9] Hơn nữa xét nghiệm vi thể là tiêu chuẩn vàng để đánh giá tổn thương 2 cơ quan chính chịu trách nhiệm chuyển hóa và thải trừ thuốc Theo kểt quả trên, giải phẫu mô bệnh học các cơ quan của thỏ đều bình thường so với thời điểm trước khi dùng thuốc

Kết luận

Lá cây có chứa các nhóm chất: tinh dầu, sterol, flavonoid, alcaloid, iridoid, đường khử, acid hữu cơ, triterpenoid, gôm (chất nhầy) Có sự khác nhau về hàm lượng và

tỷ lệ các chất trong tinh dầu hai mẫu lá thu hái vào hai thời gian khác nhau Hàm lượng tinh dầu mùa hè cao hơn so với mùa đông Cao Hoàng kinh là dược liệu an toàn, không có độc tính cấp theo đường uống trên chuột nhắt trắng Cao Hoàng kinh liều 3,2g dược liệu/kg/ và liều 9,6g dược liệu/kg uống trong 8 tuần liên tục không gây độc tính bán trường diễn trên thỏ

T ài liệu tham khảo

1 Trần Hùng, Nguyễn Viết Kình, Bùi Mỹ Linh (2012), Phương pháp nghiên cứu dược liệu, Bộ môn Dược liệu, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh.

2 Võ Văn Chi (1997), Hoàng kinh, ’T ử điển cây thuốc Việt Nam ”, Nhà xuất bản Y

học, tr 564

3 PL.Ladda và CS.Magdum “Vitex negundo Linn.: Ethnobotany, Phytochemistry and Pharmacology- A R eview ”.

4 World Health Organization (2000), “Working group on the safety and efficacy o f herbal medicine Report o f regional office for the western pacific o f the World Health Organization

5 Litchfield J T& Wilcoxon F A (1949^, “A simplified method o f evaluating dose- effect experiments" J Pharmacol Exp Ther 96:99-113.