phân lập vi khuẩn từ vùng đất rễ lúa có khả năng đối kháng với nấm pyricularya oryzae gây bệnh đạo ôn trên lúa

... phòng trừ bệnh đạo ôn lúa có hiệu cao 1.2 Mục tiêu đề tài Phân lập dòng vi khuẩn Bacillus Pseudomonas flourescens từ vùng đất rễ lúa có khả đối kháng với nấm Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn Chuyên... chủng vi khuẩn đối kháng với mầm bệnh lúa 11 Bảng Ảnh hưởng vi khuẩn đối kháng đến bệnh cháy đạo ôn cổ giống lúa UPLRi-5 Philipin 13 Bảng Khả hạn chế bệnh đạo ôn xử lý vi khuẩn giống lúa. .. vi khuẩn Pseudomonas fluorescens có khả đối kháng mạnh với nấm Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn lúa từ 10 mẫu đất lúa thu từ hai tỉnh Đồng Tháp Cần Thơ Hầu hết dòng vi khuẩn Bacillus phân lập

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

- -

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP VI KHUẨN TỪ VÙNG ĐẤT RỄ LÚA CÓ

KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG VỚI NẤM Pyricularya oryzae

GÂY BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN LÚA

NGUYỄN THỊ LIÊN LÊ THỊ HUYỀN TRANG

MSSV: 3103995 LỚP: VSVH K36

Cần Thơ, 12/2013

Cần Thơ, 12/2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

- -

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP VI KHUẨN TỪ VÙNG ĐẤT RỄ LÚA CÓ

KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG VỚI NẤM Pyricularia oryzae

GÂY BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN LÚA

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

NGUYỄN THỊ LIÊN LÊ THỊ HUYỀN TRANG

MSSV: 3103995

LỚP: VSVH K36

PHẦN KÝ DUYỆT

Nguyễn Thị Liên Lê Thị Huyền Trang

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày 08 tháng 12 năm 2013

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(ký tên)

- - Sau gần bốn năm học tập và nghiên cứu tại Trường Đại học Cần Thơ, tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Vi sinh vật học Trong suốt quá trình nghiên cứu để hoàn thành luận văn tốt nghiệp đại học đã nhận được rất nhiều sự đóng góp quý báu từ phía cán bộ hướng dẫn, Ban lãnh đạo viện, bạn bè và sự quan tâm ủng

hộ từ phía gia đình để có thể vượt qua những khó khăn trong thời gian qua, vững tin thực hiện đề tài

Trước tiên tôi chân thành gửi lời cảm ơn Ban giám đốc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh đã tạo mọi điều kiện về trang thiết bị, máy móc, dụng cụ và

hỗ trợ đắc lực trong quá trình thực hiện luận văn giúp tôi học tập, nghiên cứu nâng cao trình độ để hoàn thành tốt luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất của mình đến cô Nguyễn Thị Liên- người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, dạy dỗ, đồng hành và tạo mọi điều kiện để tôi thực hiện đề tài nghiên cứu một cách tốt nhất

Xin chân thành cảm ơn cô Trần Thị Xuân Mai và cô Nguyễn Thị Pha phòng Công Nghệ Gen Thực Vật, các anh chị cao học cũng như các bạn học viên đã nhiệt tình chỉ bảo, hỗ trợ, đóng góp ý kiến trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại phòng thí nghiệm

Gián tiếp tạo nên thành công trên của tôi là tập thể các bạn lớp Vi sinh vật học khóa 36 và những người bạn thân đã luôn bên cạnh động viên, cổ vũ và giúp tôi suốt quá trình học và nhất là khoảng thời gian làm luận văn

Một lần nữa xin gửi lời tri ân đến tất cả mọi người, những người đã yêu thương, quan tâm và hết lòng giúp đỡ tôi và kính chúc quý Thầy cô cùng các bạn sinh viên sức khỏe và thành công

Chân thành cảm ơn!

Cần Thơ, ngày 25 tháng 11 năm 2013

Lê Thị Huyền Trang

TÓM TẮT

Đề tài phân lập được 43 dòng vi khuẩn, trong đó có 19 dòng vi khuẩn Bacillus và 24 dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens có khả năng đối kháng mạnh với nấm Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn trên lúa từ 10 mẫu đất lúa được thu về từ hai tỉnh Đồng Tháp và Cần Thơ Hầu hết các dòng vi khuẩn Bacillus phân lập được có màu trắng đục, một số có màu vàng nhạt, tất cả có dạng không đều hoặc răng cưa Độ nổi khuẩn lạc có 2 dạng mô và lài, đa số khuẩn lạc có bề mặt nhăn Riêng đối với các dòng Pseudomonas fluorescens thì khuẩn lạc có màu trắng đục hay vàng kem, khuẩn lạc nhỏ, trơn, đa số bìa nguyên, một số khuẩn lạc có dạng nhầy Tất cả các dòng vi khuẩn có dạng hình que và có khả năng di động Các dòng

vi khuẩn Bacillus này được tiến hành khảo sát thêm các thử nghiệm sinh hóa như catalase, amylase, nhuộm gram đều cho thấy là phù hợp với các đặc điểm của vi khuẩn Bacillus và Pseudomonas fluorescens được tiến hành thử nghiệm oxidase, khử nitrite và nhuộm Gram đều cho kết quả giống với vi khuẩn Pseudomonas fluorescens Mười chín dòng vi khuẩn Bacillus tiếp tục được khảo sát các đặc tính kháng nấm như khả năng sinh các enzyme: có 8 dòng vi khuẩn biểu hiện khả năng sinh enzyme cellulase, tất cả 19 dòng vi khuẩn sinh enzyme protease và có 11 dòng sản sinh siderohore Các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens khi khảo sát các đặc tính kháng nấm cho thấy 24 dòng vi khuẩn sinh enzyme protease và 16 dòng sản sinh siderophore.

Từ khóa: Bacillus, bệnh đạo ôn, đối kháng, Pseudomonas fluorescens, Pyricularia

oryzae

MỤC LỤC

Trang

PHẦN KÝ DUYỆT

LỜI CẢM TẠ

TÓM TẮT i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG iv

DANH SÁCH HÌNH vi

TỪ VIẾT TẮT vii

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Bệnh đạo ôn 3

2.1.1 Lịch sử nghiên cứu và phân bố của bệnh 3

2.1.2 Tác hại 3

2.1.3 Triệu chứng 4

2.2 Nguyên nhân gây bệnh và sinh thái bệnh 6

2.2.1 Nguyên nhân gây bệnh 6

2.2.2 Sinh học bệnh 7

2.3 Sinh thái bệnh 8

2.3.1 Điều kiện thời tiết 8

2.3.2 Đất đai, phân bón 9

2.3.3 Giống 9

2.3.4 Biện pháp phòng chống 9

2.4 Vi sinh vật đối kháng 10

2.4.1 Những nghiên cứu trong nước 10

2.4.2 Những nghiên cứu ngoài nước 11

2.5 Vi khuẩn Bacillus 14

2.6 Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 18

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

3.1 Thời gian 22

3.2 Địa điểm 22

3.3 Phương tiện 22

3.3.1 Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm nuôi cấy 22

3.3.2 Vật liệu 22

3.4 Phương pháp 23

3.4.1 Thí nghiệm 1: Phân lập vi khuẩn Bacillus và Pseudomonas fluorescens từ vùng đất của rễ lúa 23

3.4.2 Thí nghiệm 2: Một số thử nghiệm sinh hóa đối với các dòng vi khuẩn Bacillus (Sharmin và Rahman, 2007) 25

3.4.3 Thí nghiệm 3: Thử nghiệm sinh hóa đối với các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens (Nguyễn Trọng Thể, 2005) 26

3.4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng đối kháng 26

3.4.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát đặc tính đối kháng của Bacillus và Pseudomonas fluorescens 27

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

Thí nghiệm 1: Phân lập vi khuẩn Bacillus và Pseudomonas fluorescens vùng đất của rễ lúa 29

Thí nghiệm 2: Một số thử nghiệm sinh hóa đối với các dòng vi khuẩn Bacillus 32

Thí nghiệm 3: Thử nghiệm sinh hóa đối với các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 35

Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn phân lập được 38

Thí nghiệm 5: Khảo sát đặc tính đối kháng của Bacillus và Pseusomonas fluorescens 41

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49

5.1 Kết luận 49

5.2 Đề nghị 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

PHỤ LỤC PL1

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 1 Các chủng vi khuẩn đối kháng với các mầm bệnh chính trên cây lúa 11Bảng 2 Ảnh hưởng của vi khuẩn đối kháng đến bệnh cháy lá và đạo ôn cổ bông trên giống lúa UPLRi-5 tại Philipin 13Bảng 3 Khả năng hạn chế bệnh đạo ôn bởi xử lý vi khuẩn trên giống lúa IR50

và CO39 trong các thí nghiệm ngoài đồng ở Ấn Độ 14

Bảng 4 Đặc điểm khuẩn lạc và đặc điểm tế bào của 19 dòng vi khuẩn Bacillus 29

Bảng 5 Đặc điểm khuẩn lạc và đặc điểm tế bào của 24 dòng vi khuẩn

Pseudomonas fluorescens 31

Bảng 6 Kết quả chung các đặc tính sinh hóa của các dòng vi khuẩn Bacillus 34

Bảng 7 Kết quả chung các đặc tính sinh hóa của các dòng vi khuẩn

Bảng 10 Khả năng sản sinh enzyme protease của các dòng vi khuẩn Bacillus 42

Bảng 11 Khả năng sản sinh enzyme protease của các dòng vi khuẩn

Bảng 16 Kiểm định sự khác biệt trung bình về khả năng khả năng đối kháng

với nấm P.oryzae của các dòng vi khuẩn Bacillus sau 4 ngày PL5

Bảng 17 Phân tích ANOVA về khả năng sản sinh enzyme cellulase của các

dòng vi khuẩn Bacillus sau 3 ngày PL5

Bảng 18 Kiểm định sự khác biệt trung bình về khả năng sản sinh enzyme

cellulase của các dòng vi khuẩn Bacillus sau 3 ngày PL6

Bảng 19 Phân tích ANOVA về khả năng sản sinh enzyme protease của các

dòng vi khuẩn Bacillus PL6

Bảng 20 Kiểm định sự khác biệt trung bình về khả năng sản sinh enzyme

protease của các dòng vi khuẩn Bacillus PL6

Bảng 21 Phân tích ANOVA về khả năng sản sinh siderophore của các dòng vi

khuẩn Bacillus sau 5 ngày PL7

Bảng 22 Kiểm định sự khác biệt trung bình về khả năng sản sinh siderophore

của các dòng vi khuẩn Bacillus sau 5 ngày PL7 Bảng 23 Phân tích ANOVA về khả năng đối kháng với nấm P.oryzae của các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens sau 5 ngày PL7

Bảng 24 Kiểm định sự khác biệt trung bình về khả năng khả năng đối kháng

với nấm P.oryzae của các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens sau 5 ngày PL7

Bảng 25 Phân tích ANOVA về khả năng sản sinh enzyme protease của các

dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens PL8

Bảng 26 Kiểm định sự khác biệt trung bình về khả năng sản sinh enzyme

protease của các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens PL8

Bảng 27 Phân tích ANOVA về khả năng sản sinh siderophore của các dòng vi

khuẩn Pseudomonas fluorescens sau 5 ngày PL8

Bảng 28 Kiểm định sự khác biệt trung bình về khả năng sản sinh siderophore

của các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens sau 5 ngày PL9

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1 Một số triệu chứng bệnh đạo ôn trên lúa 5

Hình 2 Nấm Pyricularia oryzae 6

Hình 3 Sự giới hạn phát triển khuẩn ty trên đĩa petri của nấm M grisea bởi dòng P fluorescens Pf7-14 (phải) và đối chứng không xử lý vi khuẩn (trái) 12

Hình 4 Vi khuẩn Bacillus subtilis 14

Hình 5 Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 19

Hình 6 Một số hình dạng khuẩn lạc của các dòng Bacillus phân lập được với độ phóng đại 10 lần 29

Hình 7 Một số hình dạng khuẩn lạc của các dòng Pseudomonas fluorescens phân lập được với độ phóng đại 10 lần 30

Hình 8 Hình nhuộm gram tế bào của hai dòng vi khuẩn 32

Hình 9 Bọt khí do enzyme Catalase tiếp xúc với H2O2 tạo thành 33

Hình 10 Thử nghiệm amylase đối với các dòng vi khuẩn Bacillus 34

Hình 11.Thử nghiệm oxidase đối với các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 36

Hình 12.Thử nghiệm nitratase đối với các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 37

Hình 13 Các dòng vi khuẩn có khả năng ngăn chặn sự phát triển của khuẩn ty nấm 38

Hình 14 Vòng halo thể hiện khả năng phân hủy protein của vi khuẩn 42

Hình 15 Khả năng sản sinh siderophore 45

Hình 16 Vòng halo sau khi nhuộm Congo Red xung quanh khuẩn lạc bằng phương pháp đục lỗ 48

NN & PTNT Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn

PDA Potato Dextrose Agar

PCA phenazine-1-carboxylic acid

SD-CASA A Simple double-layered Chrome Azurol S Agar

YEG Yeast Extract Glucose

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

Đạo ôn hay còn gọi là bệnh cháy lá lúa do nấm Pyricularia oryzae gây ra đang là

vấn đề lớn cho các quốc gia trồng lúa trên thế giới Chúng thường xuất hiện ở các quốc gia có khí hậu nóng ẩm và có thể tấn công vào tất cả các phần trên cây lúa Ở Việt Nam, bệnh xuất hiện cả 2 vụ lúa đông xuân, hè thu và xuất hiện ở hầu khắp các tỉnh thành Hiện nay biện pháp phòng trừ bệnh đạo ôn đang được sử dụng phổ biến là dùng các loại thuốc hóa học bảo vệ thực vật (BVTV) Việc sử dụng hoá chất BVTV nhằm tăng sản lượng nông nghiệp từ lâu đã phổ biến ở Việt Nam với các chủng loại rất đa dạng Mỗi năm, Việt Nam sử dụng khoảng 25.000 tấn thuốc hóa học diệt sâu bệnh Theo thống kê cho đến năm 2004, ở Việt Nam có tới 436 loại hoá chất với 1231 tên thương phẩm và phải nhập tới 166 triệu USD thuốc BVTV, trong đó các chất chống nấm chiếm tỷ lệ 28,0% Bên cạnh đó việc sử dụng liên tục thuốc BVTV dẫn đến việc kháng thuốc của các mầm bệnh, sinh ra nhiều mầm bệnh mới dưới áp lực của chọn lọc

và khi tồn dư trong đất, nước và nông sản sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe con người, gây ô nhiễm môi trường và làm mất cân bằng sinh thái Do đó, việc hạn chế sử dụng hóa chất này đang là một vấn đề cấp bách và đã được nhiều nhà khoa học quan tâm Mặt khác, cũng có nhiều nghiên cứu cải tiến giống lúa mới có tính kháng bệnh cao

được đưa vào sản xuất, nhưng hầu như tính kháng của các giống lúa này ít khi có hiệu quả kéo dài hơn 3 năm vì nấm dễ phát sinh nòi mới phá vỡ tính kháng Vì vậy hạn chế

sự phát tán và gây bệnh của nấm P.oryzae dựa vào khả năng đối kháng của các vi sinh

vật đang là một lựa chọn của các nhà nghiên cứu, nhằm đưa ra một phương pháp tối ưu

để phòng trừ bệnh đạo ôn hại lúa bằng các chế phẩm vi sinh vật Một trong những nghiên cứu đó là sử dụng vi khuẩn đối kháng nấm bệnh hại lúa đã được phát triển sớm (Cao li-yong et al., 2003 và Lee at al., 2002) Mặt khác để bổ sung thêm và làm giàu nguồn vi sinh vật có khả năng đối kháng với nấm gây bệnh đạo ôn hại lúa, việc tiến

hành phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus và Pseudomonas fluorescens có hoạt tính đối kháng nấm bệnh P.oryzae cao ở quy mô phòng thí nghiệm, để từ đó có thể nghiên

cứu và đưa ra quy trình sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh đạo ôn ở lúa có hiệu quả cao nhất

1.2 Mục tiêu đề tài

Phân lập các dòng vi khuẩn Bacillus và Pseudomonas flourescens từ vùng đất rễ

lúa có khả năng đối kháng với nấm Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Bệnh đạo ôn

2.1.1 Lịch sử nghiên cứu và phân bố của bệnh

Bệnh đạo ôn hay còn gọi là bệnh cháy lá (Rice blast disease) là một dịch hại nguy

hiểm và phổ biến trên cây lúa Bệnh đạo ôn do nấm Pyricularia oryzae là một trong

những bệnh hại nghiêm trọng ở các nước trồng lúa trên thế giới (Ou, 1985) Bệnh chính thức được phát hiện ở Italia vào năm 1560 sau đó bệnh được quan sát thấy ở các nước Châu Á như Trung Quốc năm 1637, Nhật Bản năm 1760, Ấn Độ năm 1913, các nước Trung Á, Tây Á, ở Bắc Mỹ, Nam Mỹ, quần đảo Antin, ở Châu Âu như: Yas, Bungari, Rumani, Bồ Đào Nha, Liên Xô,…

Đến nay, bệnh đạo ôn là một trong những bệnh hại trên cây lúa có lịch sử xuất hiện rất lâu đời Đây là loại bệnh phổ biến, phạm vi phân bố rộng, chúng xuất hiện gây hại trên 80 quốc gia trồng lúa trên thế giới bao gồm Châu Á, Châu Âu, Châu Mỹ, Châu Phi,…Đã có rất nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước về loại bệnh này

Tại Việt Nam bệnh đạo ôn được biết đến từ lâu với tên gọi là bệnh tiêm lụi hay bệnh cháy lá lúa Vincens (1921) đã thấy bệnh xuất hiện trên lúa ở các tỉnh phía Nam Ngoài ra, cũng đã thấy bệnh xuất hiện ở các tỉnh phía Bắc (Roger, 1951) Tại đồng bằng sông Cửu Long hằng năm thường có hai cao điểm của bệnh vào các tháng 11-12

và tháng 5-6 dương lịch Các tỉnh Tiền Giang, An Giang và Cần thơ là những nơi thường có bệnh

2.1.2 Tác hại

Bệnh đạo ôn được coi là một trong những bệnh chính gây hại nghiêm trọng đối với sự sinh trưởng, năng suất và chất lượng lúa Bệnh phân bố ở hầu hết các nước trồng lúa và có thể gây thành dịch trong những điều kiện thuận lợi ở nhiều quốc gia Mức độ thiệt hại năng suất lúa do bệnh đạo ôn gây ra đã được nhiều tác giả nghiên cứu

Khi lúa bị đạo ôn cổ bông 1% thì năng suất có thể giảm từ 0,7 - 17,4 % tùy thuộc vào nhiều nhân tố có liên quan khác (Padmandha, 1965) Ở Liên Xô, trong các thí nghiệm xác định tác hại của bệnh đạo ôn (Potkin, 1983) cũng thấy, ở các mức độ bị bệnh với chỉ số cấp bệnh 10%, 25%, 33%, 42%, 63%, 75%,100%, đã làm giảm năng suất ở mức độ 0 - 22% đối với dạng đạo ôn lá, từ 0 - 64% đối với đạo ôn đốt thân, từ 0-

78 % đối với đạo ôn cổ bông Ở Nhật Bản từ năm 1953 - 1960, hàng năm thiệt hại bình quân 2,89% tổng sản lượng lúa, mặc dù đã có sự nỗ lực sử dụng thuốc hóa học trong

việc phun để phòng trị bệnh Năm 1988, dịch bệnh đạo ôn gây thiệt hại nặng ở vùng duyên hải phía Bắc Nhật Bản, tổng sản lượng lúa bị thiệt hại của quận Fukushima là 24%, có những nơi thiệt hại lên tới 90% Ở Philippin năm 1962-1963, năng suất lúa bị giảm do bệnh đạo ôn gây ra ước tính là 90% ở một số nơi, từ 50% -60% ở tỉnh Bicol và tỉnh Leyte Ở Nam Triều Tiên năm 1989 cũng có báo thiệt hại về sản lượng lúa do bệnh đạo gây ra là 4,2% năm 1978 và 3,9% năm 1980 (Vũ Triệu Mân, 2007)

Tại Việt Nam năm 1956, người ta phát hiện ở một trong các khu vực lúa của nông trường Đồng Giao bệnh đạo ôn bột phát làm chết lụi 200 ha lúa và sau đó bệnh gây hại nhiều ở các khu vực khác Có thể nói những năm 1956 -1962 là thời kỳ bệnh đạo ôn phát sinh thành dịch ở miền Bắc nước ta, từ năm 1976 đến nay bệnh đạo ôn đã gây thành dịch hại ở nhiều vùng trọng điểm thâm canh lúa thuộc Đồng bằng Sông Hồng, Đồng bằng Sông Cửu Long, các tỉnh duyên hải miền Trung và cả Tây Nguyên, một số vùng trung du miền núi phía bắc trên các giống lúa mẫn cảm.Vụ đông xuân năm 1979,

có trên 15.000 ha lúa bị nhiễm đạo ôn Vụ xuân năm 1982 có trên 80.000 ha lúa bị nhiễm đạo ôn, vụ chiêm xuân năm 1985 có trên 160.000 ha lúa bị nhiễm bệnh đạo ôn,

vụ xuân năm 1997 có trên 150.000 ha lúa bị nhiễm đạo ôn Năm 2001 bệnh đạo ôn lá là 336.370 ha chiếm khoảng 4,56% diện tích gieo cấy, trong đó diện tích nhiễm nặng 1à 5.790 ha, diện tích bị lụi là 62,4 ha Năm 2007, cả nước có 188.711 ha lúa bị nhiễm đạo

ôn lá trong đó có 10.312 ha bị nhiễm nặng Diện tích bị nhiễm đạo ôn cổ bông là 39.552 ha trong đó diện tích nhiễm nặng là 1.350 ha và diện tích bị giảm năng suất trên 70% là 33 ha Như vậy, ta thấy các đợt dịch đạo ôn có xu hướng gây hại ngày càng tăng mạnh trên quy mô diện tích ngày càng lớn (Nguyễn Văn Hoan et al., 2007)

2.1.3 Triệu chứng

Bệnh đạo ôn có thể gây hại trên tất cả các giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cây lúa Theo Peresipkin (1974), triệu chứng bệnh được chia làm ba dạng là đạo ôn lá, đạo ôn đốt thân và đạo ôn cổ bông Theo Reissig et al., (1985) căn cứ vào tính chất và

vị trí bộ phận bị nhiễm chia bệnh làm 4 dạng là đạo ôn lá, đạo ôn cổ lá, đạo ôn đốt thân

và đạo ôn cổ bông

Hình 1 Một số triệu chứng bệnh đạo ôn trên lúa

a Đạo ôn lá, b Đạo ôn cổ lá, c Đạo ôn cổ bông, d Đạo ôn đốt thân, e Đạo ôn hạt

(* Nguồn: http://thuocdietcontrung.net.vn/vi/Thong-tin-san-pham.aspx?id=37&idn=2015, ngày 20/7/2013)

 Đạo ôn lá và cổ lá

Trên lá, đặc điểm của vết bệnh có thể thay đổi theo tuổi cây, điều kiện thời tiết và tính nhiễm của giống

- Trên các giống nhiễm, vết bệnh ban đầu chỉ là đốm úng nước, nhỏ, màu

xám xanh Vết bệnh sau đó lan ra, tạo vết bệnh to, hình thoi, màu nâu nhạt, có khi có quầng màu vàng nhạt, phần giữa vết bệnh có màu tro xám Kích thước vết bệnh (1-1,5

cm x 0,3-0,5 cm) Trong điều kiện ẩm ướt, dinh dưỡng đạm quá nhiều, các giống nhiễm xuất hiện vết bệnh cấp tính hình tròn hay hình bầu dục, nâu xanh tái do đài và bào tử nấm xuất hiện trên đó, dạng thấm nước về sau trở thành dạng mãn tính điển hình (Vũ Triệu Mân, 2007)

- Trên các giống kháng, vết bệnh là những chấm nhỏ hình dạng không đặc

trưng Tùy thuộc vào mức độ kháng của giống lúa mà vết bệnh có kích thước khác nhau: trên giống kháng mạnh, vết bệnh là những đốm nâu nhỏ có kích thước từ bằng đầu kim đến 1-2 mm; ở các giống kháng vừa, vết bệnh có hình tròn hay trứng, tâm sáng trắng, viền nâu, kích thước 2-3mm Nhiễm nặng và sớm lúa có thể bị lùn, nhiều vết bệnh trên lá liên kết với nhau làm cháy lá (Nguyễn Văn Hòa, 2007)

 Đạo ôn đốt thân

Lúc đầu là một đốm nhỏ màu nâu sau lớn rộng ra thành một vành tròn bao quanh đốt thân làm cho thân lõm tóp lại, màu đen Khi trời mưa ẩm thân mềm nhũn dễ bị gãy gập khi gặp mưa giông gió (Nguyễn Văn Hòa et al., 2007)

 Đạo ôn cổ bông và gié lúa

Trên cổ bông, gié lúa vết bệnh ban đầu là những đốm nhỏ, sau lan ra theo chiều dài làm cả đoạn cổ bông có màu nâu xám, khô tóp Nếu nhiễm bệnh sớm (ngay sau trổ) làm cho toàn bộ bông lúa bị lép trắng, nhiễm bệnh muộn (vào thời kì làm hạt chín) gây

ra hiện tượng bông lúa nhỏ, có nhiều hạt lép lửng, dễ gãy, gié lúa dễ rụng dẫn đến làm giảm năng suất lúa (Lê Lương Tề, 2007)

2.2 Nguyên nhân gây bệnh và sinh thái bệnh

2.2.1 Nguyên nhân gây bệnh

 Phân loại

- Giai đoạn vô tính: Pyricularia oryzae Cav et Bri (còn gọi là Pyricularia

grisea) thuộc họ Moniliacea, bộ Miniiales - lớp nấm bất toàn

- Giai đoạn hữu tính: Magnaportha grisea thuộc lớp nấm túi (thường không

có ngoài tự nhiên)

 Hình thái

Cành bào tử thường mọc thành chùm ở khí khổng, có 2- 4 vách ngăn ngang, phần chân hơi phồng to và nhỏ dần về phía ngọn, có màu xanh hơi vàng hay màu xám nâu, nhạt màu dần về phía ngọn, mang một hay nhiều bào tử (1-20) Trên mỗi cành hình thành 3- 10 bào tử phân sinh Bào tử phân sinh có hình quả lê, 2 vách ngăn ngang có khi 1-3 vách ngăn, không có màu hay có màu xanh nhạt 19-23 µm Bào tử thường nảy mầm ở tế bào đầu hay gốc và tạo đĩa bám Trong mỗi tế bào của khuẩn ty hay bào tử có thể có một hay nhiều nhân, đa số là đơn nhân và chứa 2-6 nhiễm sắc thể

Hình 2 Nấm Pyricularia oryzae

(*Nguồn:http://www.apsnet.org/edcenter/intropp/LabExercises/Pages/Cytology.aspx ,ngày 20/07/2013)

Nấm có giai đoạn sinh sản hữu tính và được gọi tên là Magnaporthe grisea

(Heber, 1980) Quả nang bầu có thể tạo đơn hay thành cụm, mọc chìm trong mô cây, có màu nâu sậm đến đen, đường kính phần chân của quả nang là 30-600µm (trung bình

180 µm), có các gai đệm dài bên trong Nang hình trụ vách dày, 8,5-70µm Nang bào tử trong suốt, hình liềm và có 3 vách ngăn

Trên mặt vết bệnh, bào tử chỉ được tạo ra khi ẩm độ không khí từ 93% trở lên, ẩm

độ càng cao thì tốc độ sinh sản càng nhanh Bào tử nẩy mầm khi có lớp nước tự do hay

ẩm độ không khí bão hòa Trên bề mặt nước, 80% lượng bào tử có thể nẩy mầm được

và sau 24 giờ có khả năng sinh sản được Khuẩn ty phát triển tốt khi ẩm độ không khí đạt 93 %, cao hơn hay thấp hơn thì khuẩn ty sẽ phát triển kém Để sinh bào tử, nấm cần

có sự chiếu sáng và tối xen kẽ Bào tử được sinh chủ yếu là vào ban đêm ngay khi trời vừa tối và đạt cao điểm trong 1-2 giờ, rồi sau đó giảm dần và ngừng hẳn khi trời sáng Ánh sáng cũng ảnh hưởng đến sự mọc mầm và phát triển ống mầm của bào tử (Đỗ Tấn Dũng, 2005)

Nấm sẽ phát triển tốt trên môi trường tổng hợp nếu có thêm nước trích rơm lúa,

có lẽ nhờ sự hiện diện của các chất như biotin, thiamine, các malic acid, citric acid, glutamic acid, aspartic acid cùng các nguyên tố vi lượng như manganese, zinc, molybdenum Khả năng sử dụng carbon trong các hợp chất thay đổi tùy theo chủng nấm; nói chung acid hữu cơ thì không thích hợp, thích hợp nhất là maltose, sucrose, glucose, insulin và mannitol Nấm sử dụng thích hợp nhất là đạm ở dạng KNO3 và NaNO3, dinh dưỡng có ảnh hưởng đến việc sinh sản bào tử của nấm

Trong cây bệnh hay trong môi trường nuôi cấy, người ta trích được hai loại độc tố: alpha-picolinic acid (C6H5NO2) và một chất khác được gọi tên là piricularin (C18H14N2O3) Nếu bôi piricularin lên một vết thương cơ học trên lá lúa, sẽ tạo một đốm cháy giống như vết bệnh cháy lá Piricularin còn làm cây bệnh, tập trung coumarin

và làm cây lúa bị lùn Piricularin bị chlorogenic acid và ferulic acid làm mất độc tính

Ngoài ra, nấm còn tạo ra hai loại độc tố khác là pyricucol và tenuazonic acid Ngoài độc tố, nấm còn tạo ra riboflvin, panthothenic acid, vitamin B6 và folic acid Nấm ít tiết phân hóa tố phân giải amylose (amylase) nên khả năng phân giải pectin kém nhưng nấm có tiết các phân hóa tố phân giải cellulose (cellulase) như beta-glucosidase (Lê Lương Tề, 2007)

Nấm gây bệnh đạo ôn là nấm rất dễ biến dị, có khả năng tạo ra rất nhiều nòi gây bệnh Giữa các địa phương khác nhau hay giữa các mùa vụ trong cùng một địa phương,

do có sự khác nhau về giống canh tác, điều kiện môi trường nòi gây bệnh cũng sẽ khác nhau Hơn nữa, từ một vết bệnh hay thậm chí từ một bào tử phân sinh, khi nuôi cấy thì ở các thế hệ sau người ta thấy nấm lại là hỗn hợp nhiều nòi gây bệnh khác nhau

Có nhiều nguyên nhân làm nấm thay đổi độc tính gây bệnh (nòi gây bệnh) (Lê Lương

Tề, 2007)

2.3 Sinh thái bệnh

2.3.1 Điều kiện thời tiết

Bệnh đạo ôn có thể phát sinh gây hại với các mức độ khác nhau, trên các mùa vụ khác nhau Riêng ở các tỉnh miền Bắc bệnh phát sinh gây hại ở các vụ lúa chiêm xuân thường lớn hơn trong vụ mùa Trên vụ lúa chiêm xuân, bệnh thường xuất hiện trên tháng 1, tháng 2 trên mạ chiêm, đầu tháng 3 bệnh xuất hiện cục bộ trên lúa xuân đẻ nhánh Từ giữa tháng 3 đến tháng 5, bệnh thường phát sinh gây hại mạnh trên diện rộng Trên các trà lúa mùa, bệnh phát sinh vào thời kì lúa trổ trở đi từ tháng 10 đến tháng 11 Điều đó chứng tỏ bệnh đạo ôn phát sinh theo qui luật chung trong những tháng có nhiều ngày liên tiếp bảo đảm nhiệt độ 18- 25oC, ẩm độ cao trên 90% mưa lai rai, số giờ nắng ít (nhỏ hơn 2h/ngày)

Theo kết quả nghiên cứu ở Viện lúa Đồng bằng sông Cửu Long, mật độ bào tử bắt

được trong bẫy tỷ lệ với ẩm độ không khí Sự phát tán của các bào tử nấm Pyricularia

oryzae mạnh nhất trong các tháng 8, 9, 11 Lượng mưa trong các tháng ở mùa mưa tỷ lệ

thuận với sự nhiễm bệnh của các cây kí chủ Gió làm tăng tính nhiễm của cây Trời mát thích hợp cho sự phát triển vết bệnh ở giai đoạn đầu, nhưng giai đoạn sau thì sự phát triển của vết bệnh sẽ được kích thích nếu có một ít nắng Khi không có đủ sáng do mây

mù, lá lúa sẽ tập trung nhiều asparagine, glutamine và nhiều amino acid khác nên sẽ tăng tính nhiễm của cây

2.3.2 Đất đai, phân bón

Những chân ruộng nhiều mùn, trũng, khó thoát nước, những vùng đất mới vỡ hoang, đất có kết cấu nhẹ, giữ nước kém, khô hạn và những chân ruộng có lớp đất sét nông là điều kiện rất thuận lợi cho nấm bệnh đạo ôn phát triển

Phân bón cũng ảnh hưởng rất lớn đến sự phát sinh, phát triển của bệnh Nếu bón phân không hợp lý, bệnh vẫn phát sinh gây hại trong những điều kiện thời tiết không thuận lợi cho nấm bệnh phát triển Bón quá thừa như phân ammonium sulfate, sẽ có ảnh hưởng nghiêm trọng hơn là bón nhiều lần Bón quá trễ hay bón khi nhiệt độ quá thấp trong giai đoạn phát triển đầu của lúa cũng có ảnh hưởng nhiều Đất có khả năng giữ phân kém (đất cát) cũng bị ảnh hưởng nhiều hơn đất có khả năng giữ phân tốt (đất sét) Bón phân lên lá cũng làm bệnh phát triển mạnh hơn

2.3.3 Giống

Ngoài các yếu tố khí hậu thời tiết ở đất đai, phân bón, đặc tính của giống có ảnh hưởng rất lớn tới mức độ phát triển của bệnh trên đồng ruộng Những giống nhiễm bệnh nặng (mẫn cảm) không những là điểm bệnh phát sinh ban đầu mà còn là điều kiện cho bệnh dễ dàng lây lan hàng loạt hình thành nên dịch bệnh trên đồng ruộng

Tính chống bệnh của cây lúa tăng khi tỷ lệ SiO2/N tăng (Sakomoto, 1993) Giống lúa chống bệnh chứa nhiều polyphenol hơn ở giống nhiễm bệnh (Wakimoto và Yoshii, 1958) Trong giống lúa chống bệnh sẽ sản sinh ra lượng lớn hợp chất Fytoaclexin có tác dụng ngăn cản sự phát triển của nấm trong cây Tính chống bệnh của cây lúa do 23 gen kháng đạo ôn đã được phát hiện và đồng thời còn phụ thuộc vào đặc điểm cấu tạo của giống, nhìn chung các giống lúa đẻ nhánh tập trung, cứng cây, chịu phân, tỷ số khối lượng thân trên khối lượng 20 cm gốc nhỏ, ống rơm dày, lá cứng, có tầng cutin dày là những giống thể hiện khả năng chống chịu bệnh tốt

Nhiều giống lúa đã được khảo nghiệm và đánh giá là những giống có năng suất cao và chống chịu bệnh đạo ôn như IR1820, IR17494, C71, RSP13, Xuân số 2, Xuân

số 5, và đã được gieo cấy rộng rãi ở miền Trung và vùng Đồng bằng Sông Hồng trước đây Đến nay một số giống đã mất khả năng chống bệnh với một số chủng nòi đạo ôn mới xuất hiện Một số giống lúa nếp hoặc NN8, CR203, một số giống lúa thuần,…là giống mẫn cảm bệnh đạo ôn (Vũ Triệu Mân, 2007)

2.3.4 Biện pháp phòng chống

 Dự tính dự báo

Muốn phòng trị bệnh có hiệu quả cao, cần phải có biện pháp dự báo tốt Nghiên cứu của Refaci (1977), trong điều kiện của Philippines, cho thấy số giờ mưa, ẩm độ không khí trung bình vào ban ngày, nhiệt độ trung bình của ngày và đêm không có tương quan với số vết bệnh trên cây, chỉ có nhiệt độ trung bình vào ban đêm, mật số bào tử trong không khí, số giờ có sương mù là có ảnh hưởng đến mức độ bệnh trên cây Cũng có thể dự báo bệnh bằng ruộng dự báo Các giống trồng chủ lực của một địa phương được gieo trong các lô 1 m2 ở trung tâm khu vực muốn dự báo Trên các lô này bón phân đạm hơi cao hơn trong thực tế sản xuất tại địa phương và có thể gieo sớm hơn ruộng sản xuất 7-10 ngày Theo dõi bệnh xuất hiện trên các lô này, từ đó có thể dự báo cho các khu vực có trồng cùng giống đã bị nhiễm trong khu dự báo (Phạm Văn Kim, 2003)

 Biện pháp phòng trừ khác

- Đối với những vùng thường xảy ra dịch bệnh đạo ôn cần phải quan tâm tiêu

huỷ những tàn dư thực vật sau khi thu hoạch lúa: Cày lật gốc rạ, bón vôi, xử lí đất, dọn sạch bờ mương trước khi xuống vụ

loại thuốc hoá học như Sulfat đồng (CuSO4), Carbenzim,…

- Khi lúa đã bị bệnh cần ngừng ngay việc bón phân đạm, phân kali; phun

thuốc kịp thời bằng các loại thuốc hoá học như Fujione, Baem, Cần lưu ý là phải phun đúng nồng độ ghi trên nhãn thuốc, phun đủ liều lượng mỗi sào 500m2

thì phun 16-20 lít nước pha thuốc; phun lần 2 cách nhau 5-10 ngày tuỳ theo tình hình

- Đối với những ruộng đã bị bệnh đạo ôn trên lá cần phải phun thuốc phòng

bệnh đạo ôn cổ bông trước và sau khi trổ, nên phun vào lúc chiều tối để khỏi ảnh hưởng đến việc trổ bông

2.4 Vi sinh vật đối kháng

2.4.1 Những nghiên cứu trong nước

Hiện nay, tại Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu phòng trừ bệnh hại cây trồng bằng

sử dụng vi sinh vật đối kháng như:

Một số chủng vi khuẩn đối kháng như Burkholderia, Pseudomonas, Bacillus đã

và đang được quan tâm nghiên cứu tại phòng Công nghệ sinh học Enzyme – Viện Công nghệ sinh học, vì chúng tổng hợp một số chất ngoại bào với khả năng ức chế sự nẩy

mầm và phát triển của nấm bệnh F.oxysporum và R.solani gây ra các triệu chứng thối

đen rễ, lở cổ rễ, thối gốc thân, thối thân, khô vằn, thối lá trên cây cà chua

Vi khuẩn đối kháng Bacillus, Burkholderia và Pseudomonas được phân lập từ đất, rễ cây, có khả năng kiểm soát hiệu quả đối với nấm Pythium, R solani và F

oxysporum… gây bệnh thối rễ, thối thân ở cây đậu tương, cây đỗ, rau diếp, cây trạng

nguyên, cây khoai tây Ngoài ra, nhiều nhóm chuyên gia trong nước đã và đang nghiên

cứu về khả năng phòng trừ bệnh trên cây như Nguyễn Thị Thu Nga và Phạm Văn Kim

(2003) đã có khảo sát khả năng đối kháng của vi khuẩn Burkholderia cepacia TG17 đối với nấm Rhizoctonia solani gây bệnh đốm vằn trên lúa, khoa Nông nghiệp và sinh học

ứng dụng trường Đại học Cần Thơ đã đưa ra chế phẩm sinh học Biobac có khả năng

phòng trừ bệnh trên lúa là đốm vằn, hay nghiên cứu khả năng gây hại của các chủng

Erwinia carotovora trên cải bắp và bước đầu sử dụng vi khuẩn vùng rễ để phòng trị

bệnh (Phạm Thị Thắm, 2012) Ngoài ra, theo Phạm Văn Dư (2004), hiện nay phòng trừ sinh học đối với một số bệnh có nguồn gốc từ đất bằng cách sử dụng vi khuẩn đối kháng đã gặt hái được nhiều thành công đáng kể trong nhà lưới và ngoài đồng ruộng

2.4.2 Những nghiên cứu ngoài nước

Ngày nay, nhiều dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng với các mầm bệnh trên cây

lúa được tìm thấy và ứng dụng hiệu quả, chủ yếu là các dòng vi khuẩn Pseudomonas và

Bacillus

Bảng 1 Các chủng vi khuẩn đối kháng với các mầm bệnh chính trên cây lúa

Bệnh lúa Mầm bệnh Chủng vi khuẩn đối kháng

Đốm vằn

(Sheath blight)

Rhizoctonia solani P fluorescens

P putida Bacillus megaterium

B polymyxa

B pumulus Enterobacter agglomerans

Thối bẹ (Sheath-rot) Sarocladium oryzae P fluorescens

Các nghiên cứu cho thấy cơ chế cơ bản và quan trọng nhất của sự đối kháng bởi

vi khuẩn đối với mầm bệnh là do sản sinh ra các kháng sinh

Gnanamanickam (1989) và Mew (1992) đã phân lập hơn 400 dòng vi khuẩn từ các đồng lúa tại Viện nghiên cứu lúa quốc tế Các dòng này có khả năng đối kháng với

nấm M.grisea trong phòng thí nghiệm Khả năng ngăn chặn sự phát triển của nấm M

grisea bởi dòng vi khuẩn P fluorescens Pf7-14 được thể hiện trong hình 3 Sau đó tiến

hành thí nghiệm ngoài đồng với các dòng đã tuyển chọn: 2 dòng Pseudomonas 4-15R

và 7-14RN, 2 dòng Bacillus 4-03R và 33R Thí nghiệm trên giống lúa UPLRi-5, hạt

giống được áo dung dịch huyền phù vi khuẩn hoặc hóa chất kháng nấm pyroquilon (8g/kg hạt giống) trước khi sạ Các dòng vi khuẩn hay pyroquilon được phun thêm vào

3 thời điểm 20, 30 và 40 ngày sau khi sạ Kết quả được thể hiện trong bảng 2, cho thấy

dòng Pseudomonas 4-15R và 7-14RN lần lượt làm giảm 59% và 47% bệnh cháy lá Hai dòng Bacillus 4-03R và 33R làm giảm tỉ lệ mắc bệnh cháy lá 46% và 44% Đối với bệnh đao ôn cổ bông, dòng Pseudomonas 7-14RN cho hiệu quả cao nhất Sự ngăn chặn bệnh đạo ôn bởi dòng Pseudomonas 7-14 là do sản sinh ra kháng sinh kháng nấm

phenazine-1-carboxylic acid (PCA) (Valasubramanian, 2004)

Hình 3 Sự giới hạn phát triển khuẩn ty trên đĩa petri của nấm M grisea bởi dòng P fluorescens Pf7-14 (phải) và đối chứng không xử lý vi khuẩn (trái)

(* Nguồn: Gnanamanickam và Mew, 1992)

Bảng 2 Ảnh hưởng của vi khuẩn đối kháng đến bệnh cháy lá và đạo ôn cổ bông trên giống lúa UPLRi-5 tại Philipin

Nghiệm thức Bệnh cháy lá a Bệnh đạo ôn cổ bông b

Năm 2003, Yoshihiriro et al.,của Nhật Bản tiến hành nghiên cứu đặc tính đối

kháng của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis IK1080 Trong các thí nghiệm ở phòng thí nghiệm, chủng vi khuẩn có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Pyricularia oryzae

Nghiên cứu trong nhà kính cho thấy khi áp dụng vi khuẩn này trên cây lúa 14 ngày tuổi

đã làm giảm chiều dài vết thương trên lá do bệnh đạo ôn do chủng nấm bệnh

Pyricularia oryzae

Một nghiên cứu khác, Kavitha et al., (2005) sử dụng chủng B.polymyxa VLB16

trong nghiên cứu sản xuất protein kháng nấm có khả năng ức chế sự tăng trưởng của

nấm Pyricularia oryzae Ở thí nghiệm ngoài đồng, VLB16 ngăn chặn 50% bệnh đạo ôn lúa Các chủng Bacillus khác như B.pumilus, B polymyxa, B coagulans và

Enterobacter cũng làm giảm tỉ lệ bệnh đạo ôn lúa trong các thí nghiệm ngoài đồng

(Bảng 3)

Bảng 3 Khả năng hạn chế bệnh đạo ôn bởi xử lý vi khuẩn trên giống lúa IR50 và CO39 trong các thí nghiệm ngoài đồng ở Ấn Độ

Chủng vi khuẩn Kích thước vòng giới hạn phát

triển nấm Pyricularia grisea (cm)

Phần trăm ngăn chặn bệnh đạo ôn

(* Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus , ngày 11/06/2013)

Hình 4 Vi khuẩn Bacillus subtilis

(*Nguồn: http://www.astrobio.net/exclusive/3866/mutant-microbes-test-radiation-resistance ,ngày

hoặc kỵ khí không bắt buộc Tế bào Bacillus có thể đơn hoặc chuỗi và chuyển động bằng tiêm mao Nhờ khả năng sinh bào tử nên vi khuẩn Bacillus có thể tồn tại trong

thời gian rất dài dưới các điều kiện khác nhau và rất phổ biến trong tự nhiên nên có thể phân lập từ rất nhiều nguồn khác nhau như đất, nước, trầm tích biển, thức ăn, sữa, nhưng chủ yếu là từ đất nơi mà đóng vai trò quan trọng trong chu kỳ C và N

Tất cả các loài thuộc chi Bacillus đều có khả năng dị dưỡng và hoại sinh nhờ sử

dụng các hợp chất hữu cơ đa dạng như đường, acid amin, acid hữu cơ, Một vài loài có

thể lên men carbohydrate tạo thành glycerol và butanediol, một vài loài như Bacillus

megaterium thì không cần chất hữu cơ để sinh trưởng, một vài loài khác thì cần acid

amin, vitamin B Hầu hết đều là loài ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ưu là 30-45oC, nhưng cũng có nhiều loài ưa nhiệt với nhiệt độ tối ưu là 65o

C

Đa số Bacillus sinh trưởng ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9 -10 như Bacillus

alcalophillus, hay có loại phù hợp với pH = 2-6 như Bacillus acidocaldrius

Bacillus có khả năng sản sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase, ),

do đó chúng được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp, trong bảo vệ môi trường,…

Sau đây là một số loài Bacillus thường gặp trong tự nhiên:

Bacillus subtilis

Bacillus subtilis còn được gọi là trực khuẩn cỏ khô vì nó phân bố nhiều trong đất

và đặc biệt là ở cỏ khô Chúng phân hủy pectin và polysacharide ở mô thực vật và góp phần gây nên các nốt trên củ khoai tây Chúng sinh trưởng trên môi trường nguyên thủy xác định mà không cần bổ sung thêm yếu tố kích thích sinh trưởng Sự sinh trưởng phát triển của chúng góp phần làm hỏng các nguyên liệu có nguồn gốc động thực vật Chúng không sinh trưởng trên thực phẩm có tính acid ở điều kiện tối ưu Chúng là nguyên nhân gây hư hỏng bánh mì

Phần lớn thông tin chúng ta có về đặc điểm sinh học, hóa sinh, di truyền của các

vi khuẩn Gram dương khác đều nhận được từ việc nghiên cứu Bacillus subtilis

Chúng là những vi khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, kích thước (3 –5) x 0,6 µm Chúng phát triển riêng rẽ như những sợi đơn bào ít khi kết chuỗi sợi Khuẩn lạc khô, không màu hay xám nhạt, có thể màu trắng hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan trên bề mặt thạch, mép nhăn hoặc lồi lõm nhiều hay ít, bám chặt vào môi trường thạch

Bacillus subtilis sinh trưởng tốt nhất ở 36–50oC, tối đa khoảng 60oC Là loại ưa

nhiệt cao Bào tử của Bacillus subtilis cũng chịu được nhiệt khá cao Bào tử hình bầu

dục, kích thước 0,6–0,9µm, phân bố không theo nguyên tắc chặt chẽ nào, lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm Chúng phát tán rộng rãi Chúng là một thể nghỉ sinh ra vào cuối thời kỳ sinh trưởng phát triển của vi khuẩn Chúng không có khả năng trao đổi chất nên có thể sống được vài năm đến vài chục năm, thậm chí đến 200-300 năm

Vi khuẩn Bacillus subtilis được xem là vi sinh vật điển hình vì có những đặc tính

tiêu biểu không gây hại nên đây là một trong những vi khuẩn được sử dụng để sản xuất enzyme và các hóa chất đặc biệt như: amylase, protease, inosine, ribosides, acid amin,

subtilisin Ngoài ra nhờ khả năng bám dính proton lên bề mặt mà B.subtilis có thể loại

bỏ được chất thải phóng xạ như Thorium (IV) và Plutonium (IV) (Ngô Tự Thành và Bùi Thị Việt Hà, 2007)

Bacillus megaterium

Megaterium có nghĩa là “con thú lớn” Tế bào của nó khá lớn khoảng gấp hơn 2

lần tế bào của Bacillus subtilis, chiều ngang (1,2–1,5) µm có thể đến 2 µm, dài từ 3–12

µm, ở các ống nuôi già thì tế bào ngắn hơn, tròn hơn, đôi khi hình thoi với đầu hẹp lại

Tế bào chứa nhiều hạt nhỏ và chất dinh dưỡng dự trữ (hạt mỡ, glycogen) Bào tử lớn hình ovan hay bầu dục, kích thước 1,5 x (0,7-1) µm, bào tử lớn nhất có đường kính từ 1,2 đến 1,5 µm Chúng nằm lệch tâm thường theo chiều ngang hoặc xiên của tế bào Khuẩn lạc tròn đều không thùy, không nếp, mép tròn đều hoặc hơi lượn sóng, trông giống giọt bạch lạp, lồi nhẵn, nhưng thường có vòng viền quanh đồng tâm trên bề mặt, màu trắng sữa hay đục Sinh trưởng trên môi trường dinh dưỡng đơn giản không

cần thêm bất kỳ một yếu tố sinh trưởng nào Bacillus megaterium cũng sản sinh ra các enzyme tương tự B.subtilis, do đó nó cũng được ứng dụng nhiều trong công nghiệp

Bacillus cereus

Đây là loại có mối quan hệ gần gũi với Bacillus anthracis, Bacillus mycoides,

Bacillus thuringiensis Bào tử của chúng phát tán khắp nơi, trong đất, không

khí,…Chúng thường sinh sôi nảy nở trên thực phẩm như cơm và có thể sinh ra độc tố làm cho thực phẩm hư hỏng Chúng được áp dụng để sản xuất kháng sinh, giống

Bacillus này có độc tính và gây ngộ độc thực phẩm

Tế bào Bacillus cereus dày, kích thước (1–1,5) x (3 –5) µm, có khi dài hơn, chúng

đứng riêng rẽ hay xếp chuỗi Bào tử hình bầu dục kích thước 0,9 x (1,2 –1,5) µm nằm lệch tâm, tế bào chất của nó chứa các hạt và không bào Khuẩn lạc của chúng phẳng, khá khuyếch tán, hơi lõm, trắng đục, mép lồi lõm

Bacillus polymyxa

Bacillus polymyxa có khuẩn lạc không màu, phẳng hoặc lồi, trơn, nhày, lan dần ra

xung quanh, mép đôi khi có thùy Tế bào của Bacillus polymyxa có kích thước (0,6 –1)

x (2 –7) µm, đứng riêng rẽ hay xếp thành đôi, chuỗi ngắn Khi hình thành bào tử tế bào

đó sẽ phồng lên hình quả chanh Bào tử hình bầu dục kéo dài, trên bề mặt cắt ngang như hình sao

Chúng phát tán rộng, kích thước dài khoảng (1,7–2,6) µm, nằm giữa tế bào Loại

vi khuẩn này làm giảm pectin và polysacharide trong cây Ngoài ra, chúng còn có khả năng cố định đạm Chúng thường sinh trưởng phát triển trên thực vật đang bị hỏng Vì vậy người ta thường phân lập chúng từ thực phẩm Môi trường kem và những môi trường có tính acid yếu phù hợp với loại vi khuẩn này Chúng là nguồn để sản xuất kháng sinh polymyxin Đây là một loại vi khuẩn rất phổ biến và có ích, chủ yếu là cho công nghiệp dược

Bacillus brevis

Người ta thường tìm thấy và phân lập chúng từ đất và thực phẩm Khuẩn lạc của chúng màu trắng, đôi khi có sắc vàng, lồi hoặc phẳng lấp lánh, mép răng cưa giống

dạng mỡ đặc Bacillus brevis là trực khuẩn kích thước (0,7–1) x (3–5) µm Chúng

thường đứng riêng rẽ Bào tử hình bầu dục, có kích cỡ (0,8–1) µm, nằm cuối tế bào làm cho đầu tế bào hơi phồng to lên

Về nhu cầu dinh dưỡng, Bacillus brevis yêu cầu một hỗn hợp acid amin cho sinh

trưởng và phát triển, không cần bổ sung vitamin

Bacillus simplex

Khuẩn lạc giống khuẩn lạc B.cereus, phẳng, khá khuyếch tán, với bề mặt hơi xù xì

(dạng bột hoặc hạt nhỏ), hơi lõm, màu đục, mép lồi lõm Đặc biệt khuẩn lạc của

Bacillus simplex có khả năng sinh sắc tố lục nhạt, vàng và tiết vào môi trường

Tế bào của nó nhỏ bé, có kích thước (2–5) x 0,6 µm, thường đứng riêng rẽ không kết thành chuỗi Bào tử hình bầu dục, có kích thước 0,6 x 0,9 µm, nằm lệch tâm

Bacillus lincheniformis

Chúng được áp dụng trong việc sản xuất loại vỏ bao poly D–glutamate và phẩm

đỏ cùng với nhiều chủng khác Bào tử của chúng phát tán chủ yếu trong đất Chúng sinh trưởng phát triển trên các loại thực phẩm Đặc biệt chúng có khả năng sản xuất ra

bacitracin, một kháng sinh có ích trong y học, nên chúng được ứng dụng phổ biến trong công nghiệp dược

2.6 Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens

Loài: Pseudomonas fluorescens

(*Nguồn: http://vi.wikipedia.org/wiki/Pseudomonas , ngày 11/06/2013)

Trong số các loài Pseudomonas spp., P.fluorescens là được chú ý nghiên cứu

hơn hết, vì ngoài khả năng đối kháng với 10 loại mầm bệnh phát sinh từ đất, nó còn có khả năng kích thích sự phát triển của cây trồng (Nguyễn Trọng Thể et al., 2005)

Pseudomonas fluorescens là loài trực khuẩn, Gram âm, có đơn hoặc nhiều chiên

mao, sống hiếu khí bắt buộc nhưng một số dòng có khả năng sử dụng nitrate thay thế oxy làm chất nhận electron cuối cùng trong quá trình hô hấp tế bào Chúng có cơ chế trao đổi chất cực kì linh hoạt giúp chúng sống được cả trong đất và trong nước Nhiệt

độ tối ưu cho sự phát triển của Pseudomonas fluorescens là 25-30oC

Chúng có trắc nghiệm dương tính với oxidase Một số dòng Pseudomonas

fluorescens (chẳng hạn như CHAO hay Pf-5) có những đặc tính kiểm soát sinh học,

giúp bảo vệ vùng rễ một số loài thực vật chống lại nấm kí sinh như Fusarium,

Pyricularia hay Pythium

Đến nay, người ta vẫn chưa biết được chính xác cơ chế kiểm soát sinh học của

Pseudomonas fluorescens, một số giả thuyết được đưa ra như sau: thứ nhất người ta

cho rằng chúng kích thích tính kháng tập thể của cây, giúp cây kháng lại tốt hơn sự tấn công của mầm bệnh thực sự Thứ hai là chúng cạnh tranh dinh dưỡng với các vi sinh vật gây bệnh, ví dụ như tiết ra các hợp chất siderophore tạo điều kiện thuận lợi cho việc cạnh tranh Fe Và cuối cùng chúng có thể tạo ra các hợp chất đối kháng với các vi sinh vật khác, chẳng hạn như các loại kháng sinh thuộc họ phenazine hoặc hydrogen cyanide

Hình 5 Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens

(*Nguồn:http://www.quorumtech.com/image-gallery/low-angle-rotary-shadowing-images,ngày

20/07/2013)

Các nghiên cứu về vi khuẩn Pseudomonas fluorescens

Ở Việt Nam hiện nay cũng có những báo cáo về sử dụng biên pháp sinh học để phòng trừ bệnh đạo ôn Năm 2005, Nguyễn Trọng Thể et al., đã phân lập được những

dòng Pseudomonas fluorescens có khả năng đối kháng với một vài nấm bệnh và xác

định kháng sinh được sinh ra bởi chủng vi khuẩn này là 2,4-diacetylphlorocinol Nguyễn Tuyết Nhung (2006), đã nghiên cứu tính đối kháng của 7 dòng vi khuẩn

Pseudomonas, kết quả các dòng vi khuẩn này có khả năng sản sinh siderophore,

cyanide và protease nội bào giúp đối kháng với một số loại nấm bệnh

Những chủng vi khuẩn ở vùng rễ trong đó có loài Pseudomonas fluorescens đối kháng mạnh với Fusarium oxysporum f sp Vasinfectium, Fusarium oxysporum f sp.cubense, Rhizoctonia solani, Sclerotium (corticium) rolfsii, Sarocladium oryzae và

Aspergilus flavus và vi khuẩn Xanthomonas campestris pv Citri và Xanthomonas campestris pv oryzae Các thí nghiệm tiếp theo cũng sử dụng nguồn vi khuẩn này

trong phòng trừ sinh học hiệu quả đối với bệnh thối bẹ lá, bệnh thối thân đậu phộng, nâng cao sự phát triển cây trồng và tăng năng suất (Sakthivel, 1986) Còn vi khuẩn

Pseudomonas fluorescens dòng HV37a được chứng minh rằng sinh ra ít nhất ba loại

kháng sinh ức chế phát triển của nấm Pythium ulimun, được dùng phòng trừ bệnh héo cây con trên cây bông vải do nấm Pythium ulimun gây ra (Gutter Son, 1986)

Sivamani et al, (1987) cho rằng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens có thể được dùng như biện pháp sinh học, là tác nhân chống lại Pseudomonas solanserum gây bệnh héo moko và vi khuẩn Xanthomonas campestris pv oryzae gây bệnh cháy lá lúa Lamber et al., (1987) đã phân lập Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas cepacia,

Seratia liquefacien và Bacillus sp có hoạt tính chống nấm phổ rộng từ cây bắp, lúa

mạch và xà lách xoong Nghiên cứu sự đối kháng giữa vi khuẩn và nấm đối với mầm bệnh héo rũ dưa leo (Jee et al., 1988) Những chủng chính đã được chọn lọc là

Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida và Seratia sp và Giocladium sp., Trichoderma harzianum và Trichoderma viride Trong môi trường bán đặc, vi khuẩn

đối kháng đã ức chế sự nảy mầm của bào tử Fusarium oxysporum f sp cucumerium từ 26-45%, Pseudomonas fluorescens là vi khuẩn có tính kìm hãm mạnh nhất

Theo Alstrom và Burn (1989) chỉ ra rằng cyanide sản xuất bởi vi khuẩn

Pseudomonas fluorescens có thể kìm hãm sự phát triển cây trồng, ngăn cản sự phát

triển rễ rau diếp (Latuca sativa) Cùng năm đó, Devi et al., nghiên cứu về vi khuẩn đối kháng Pseudomonas flurescens có huỳnh quang và không có huỳnh quang được phân lập ở vùng rễ lúa ở miền nam Ấn Độ đối kháng tốt với nấm Rhizoctonia solani được

đánh giá là biện pháp sinh học dùng để đối phó với bệnh đốm vằn Còn Gnanamanickcam et al., (1992) cho rằng những nhóm vi khuẩn đối kháng huỳnh quang

và không huỳnh quang được quan sát ở Ấn Độ trong ống nghiệm đã kìm hãm nấm

Rhizoctonia solani vì chúng mang gen chitinase đã mã hóa làm chitin hóa vách tế bào

sợi nấm Nhiều dòng của vi khuẩn có hiệu quả kìm hãm sự phát triển của khuẩn ty, làm ảnh hưởng đến sự sống sót của hạch nấm bảo vệ cây trồng tránh sự xâm nhiễm của nấm

bệnh Trong số các loài Pseudomonas spp, Pseudomonas flurescens là được nghiên cứu

hơn hết, vì ngoài khả năng đối kháng với 10 loài nấm bệnh phát sinh từ đất, nó còn có khả năng kích thích sự phát triển của cây trồng Tác động đối kháng của vi khuẩn được xác nhận do chất kháng khuẩn pyrrolnitrin

Những nghiệm thức xử lý vi khuẩn có khả năng giảm ảnh hưởng bệnh nhưng không có ý nghĩa là gia tăng năng suất Còn Rindran và Vidhyaekaran (1995) cho rằng

những nòi vi khuẩn Pseudomonas fluorescens, được phân lập từ vùng rễ, có sắc tố phát huỳnh quang vàng- xanh lục cũng kìm hãm sự phát triển của Rhizoctonia solani Một

trong những dòng có hiệu quả nhất là PfAIR2, phân lập trên than bùn được dùng để xử

lý hạt, xử lý rễ, rải vào đất và phun lên lá Từng nghiệm thức riêng lẻ đã kiểm soát bệnh

có hiệu quả Tuy nhiên, sự kết hợp của 4 cách dẫn đến hiệu quả phòng trừ tốt nhất trong nhà lưới Trên đồng ruộng, sử dụng PfAIR2 phòng trừ bệnh có hiệu quả, gia tăng năng suất và có thể so sánh với cá loại thuốc trừ nấm thông dụng như Carbendazim

Abdelzaher và Elnaghy (1998) cho biết bệnh thối rễ cây bông vải do nấm Pythium

carolinianum ở Ai Cập đã được kiểm soát bởi sử dụng vi khuẩn đối kháng

Pseudomonas fluorescens Vi khuẩn đối kháng với nấm cao trong thí nghiệm trên đĩa

petri và hạn chế được bệnh khi áp dụng trong đất Hiệu quả kiểm soát cao khi trộn vi khuẩn vào đất hơn là chủng vi khuẩn vào vùng rễ cây con trước khi trồng Tác động đối kháng do sự cạnh tranh về dinh dưỡng, siderophores, những chất có đặc tính kháng

khuẩn– HCN, Mavrodi et al., (2000) nói rằng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens tạo ra

DAPG chống lại bệnh chết cây con do nấm nhiễm trong đất gây ra và đóng vai trò quan

trọng trong việc hạn chế bệnh chết cây do nấm Gaeumannomyces graminis var tritici

Hợp chất này được kiểm soát bởi gen PhlD, một gen rất biến đổi về hóa cấu trúc Các hình thức xử lý vi khuẩn đối kháng bằng cách khử hạt giống, ngâm rễ cây con bằng dịch vi khuẩn hoặc tưới dịch vi khuẩn vào đất cần được chú ý Kết hợp nhiều dòng vi khuẩn với nhau kết quả sẽ tốt hơn là sử dụng một dòng vi khuẩn, đề nghị này được quan tâm và có hiệu quả trong phòng trừ sinh học (Mew et al., 1998) Trong những năm gần đây khi bệnh đạo ôn trên lúa phát triển mạnh thì một số nghiên cứu về

vi khuẩn đối kháng khác đã được thực hiện và nhận thấy một số dòng Pseudomonas

fluorescen có khả năng đối kháng với nấm Pyricularia oryzae Cho thấy khi vi khuẩn

hình thành khuẩn lạc đã đẩy lùi sự phát triển của nấm, thể hiện tính kháng nấm của vi khuẩn

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.3.2 Vật liệu

Mẫu nấm Pyricularia oryzae của Viện lúa Đồng bằng sông Cửu Long được bảo

quản trong tủ lạnh, 10 mẫu đất lấy từ vùng đất rễ cây lúa tại hai tỉnh Đồng Tháp và Cần Thơ

3.3.3 Hóa chất

- Môi trường Potato Dextrose Agar (PDA) để cấy chuyển nấm (Phụ lục 1)

- Môi trường Nutrient Agar (NA) để phân lập vi khuẩn Bacillus (Phụ lục 1)

- Môi trường King „B để phân lập vi khuẩn Pseudomonas fluorescens (Phụ lục 1)

- Môi trường Nutrate Broth (NB) để thử nghiệm nitratase (Phụ lục 1)

3%, tinh bột, nước muối,

- Hóa chất dùng để khảo sát các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Pseudomonas

fluorescens: Acid sulfanilic, acid acetic, N- naphthylethylenediamine,

- Hoá chất dùng để quan sát sự chuyển động và nhuộm Gram vi khuẩn: Nước

cất khử trùng, amonium oxalate, iodide, fucshin, Crystal violet, cồn 70%, cồn 96% và các hóa chất cần thiết khác

3.4 Phương pháp

3.4.1 Thí nghiệm 1: Phân lập vi khuẩn Bacillus và Pseudomonas fluorescens

từ vùng đất của rễ lúa

a) Thu mẫu đất trên ruộng lúa tại hai tỉnh Đồng Tháp và Cần Thơ

Các mẫu đất được thu từ các ruộng lúa không bị bệnh đạo ôn khi cây lúa được

40-45 ngày Mỗi mẫu đất được thu tại 5 vị trí trên hai đường chéo của ruộng; 4 vị trí ở 4 góc ruộng, 1 vị trí tại giao điểm hai đường chéo Đất được cho vào túi nilon có gòn thấm nước để giữ ẩm, ghi thông tin về mẫu như mã số, địa chỉ thu mẫu, Mẫu được giữ ở nhiệt độ 4-8oC và được phân lập trong 24 giờ Theo sơ đồ sau:

b) Phân lập và tách ròng vi khuẩn vùng rễ lúa từ các mẫu đất thu được

 Phân lập

Trộn đều mẫu đất, mỗi mẫu cân 10g đất và cho vào bình tam giác chứa 90ml nước cất đã được khử trùng Bình tam giác và các dụng cụ chứa dung dịch đất khác phải có nắp đậy để hạn chế mẫu bị nhiễm vi khuẩn từ không khí Khuấy đều mẫu 30 phút bằng máy khuấy từ Sau đó tiếp tục:

- Rút 1ml dung dịch đất và cho vào 9ml nước cất trong ống đã được khử trùng,

- Rút 50 µl dung dịch đất trong ống pha loãng cuối cùng cho vào đĩa môi

trường NA để phân lập các dòng Bacillus và môi trường đặc hiệu King‟ B đối với

Pseudomonas fluorescens Dùng que trải thủy tinh để trải đều mẫu Mỗi mẫu trải 2 đĩa

để hạn chế sai số Các đĩa được ủ ở nhiệt độ 300C cho đến khi các khuẩn lạc xuất hiện

 Tách ròng

Khi khuẩn lạc xuất hiện, chọn những khuẩn lạc vi khuẩn có hình dạng và màu sắc

tương sự như đặc điểm khuẩn lạc của Bacillus và Pseudomonas fluorescens để tiến

hành cấy chuyển sang đĩa petri khác chứa môi trường tương ứng Việc cấy chuyển được tiến hành nhiều lần cho đến khi thu được khuẩn lạc ròng, quan sát dưới kính hiển

vi, vi khuẩn được gọi là ròng (thuần chủng) khi có sự đồng nhất về hình dạng, kích thước và màu sắc

c) Quan sát hình thái khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn

- Quan sát và mô tả đặc điểm các khuẩn lạc

Khi cấy chuyển phân lập vi khuẩn trên đĩa môi trường đặc hiệu, ta tiến hành quan sát và mô tả đặc điểm của các khuẩn lạc bao gồm các chỉ tiêu sau: hình dạng, màu sắc,

độ nổi và hình dạng bìa bằng mắt thường (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2008) Tuy nhiên đối với khuẩn lạc có kích thước quá nhỏ ta có thể dùng kính lúp để quan sát

- Quan sát khả năng chuyển động của vi khuẩn

Sau khi phân lập và tách ròng vi khuẩn, tiến hành quan sát hình dạng tế bào và sự chuyển động của vi khuẩn bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2008)

- Cách làm tiêu bản giọt ép:

 Nhỏ khoảng 20 µl nước cất vô trùng lên miếng lam sạch

 Khử trùng que cấy vòng bằng cách đốt cho nóng đỏ trên ngọn lửa đèn cồn

 Dùng que cấy đã khử trùng lấy một ít sinh khối vi khuẩn từ một khuẩn lạc rời rồi trải vào trong giọt nước trên lame

 Đậy lamelle lên giọt huyền phù vi khuẩn

Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi để thấy được hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn

- Nhuộm Gram vi khuẩn

 Dùng que cấy đã khử trùng lấy một ít sinh khối vi sinh vật trải đều lên kính

 Hơ mẫu vật trên ngọn đèn cồn, cố định vi sinh vật

 Nhỏ 1-2 giọt Crystal violet lên kính, trải đều khoảng 2 phút

 Rửa lại bằng nước cất vô trùng, để mẫu khô

 Rửa mẫu bằng cồn 70% đến khi mất hết màu tím

 Rửa lại bằng nước cất vô trùng, để khô vài giây

 Nhỏ 1-2 giọt Fucshin, trải đều, để yên 1 phút

 Rửa lại nước cất vô trùng đến khi mất hết màu Fucshin

 Dùng giấy thấm chấm nhẹ khô nước

Quan sát dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần

 Nếu tế bào vi khuẩn có màu tím xanh: vi khuẩn Gram dương vì vách tế bào

ăn màu Crystal violet nên có màu tím xanh

 Nếu tế bào vi khuẩn có màu hồng đỏ: vi khuẩn Gram âm do không còn màu của Crystal violet nên có màu hồng của Fucshin

3.4.2 Thí nghiệm 2: Một số thử nghiệm sinh hóa đối với các dòng vi khuẩn Bacillus (Sharmin và Rahman, 2007)

a Thử nghiệm catalase

Hóa chất được sử dụng là dung dịch H2O2 3% được giữ lạnh trong chai màu nâu, tránh ánh sáng, dung dịch đệm phosphate pH 7.0

Thử trên phiến kính (lame): dùng kim cấy lấy một ít sinh khối từ Bacillus đã

tách ròng đặt lên một phiến kính sạch Nhỏ một giọt H2O2 3% lên sinh khối trên phiến kính Ghi nhận sự sủi bọt nếu có Thử nghiệm là (+) nếu có khi có hiện tượng sủi bọt khí do O2 tạo ra, ngược lại là (-) khi không có sủi bọt khí

b Kiểm tra khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase

Chủng 1ml nuôi trong môi trường LB vi khuẩn vào mỗi ống nghiệm chứa 1ml nước muối 0,1% Cho 1ml tinh bột vào, lắc đều, đun cách thủy ở 30°C/30 phút, lấy ra nhỏ 1 giọt iod vào Đọc kết quả:

+ Nếu có hoạt tính amylase: mất màu hỗn hợp tinh bột và iod

+ Nếu không có hoạt tính amylase: có màu xanh

3.4.3 Thí nghiệm 3: Thử nghiệm sinh hóa đối với các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens (Nguyễn Trọng Thể, 2005)

- Thử nghiệm oxidase

Thử nghiệm được thực hiện bằng giấy thử oxidase Dùng kim cấy lấy một ít sinh khối của khuẩn lạc đã thuần chấm lên vùng giấy thấm có thuốc thử Tránh để giấy thử

tẩm thuốc thử trực tiếp ngoài sáng lâu vì ánh sáng sẽ phân hủy hóa chất

Đọc kết quả sau 20-60 giây, không được để vượt quá thời gian này Phản ứng oxidase là (+) khi có sự xuất hiện màu tím xanh hay xanh dương đậm và (-) khi giấy thử không đổi màu

- Thử nghiệm nitratase (Khử nitrate)

Môi trường sử dụng là ống môi trường lỏng Nitrate Broth (NB) Cấy sinh khối chủng thuần và ủ ở 37oC trong 3 ngày Sau thời gian ủ acid hóa môi trường bằng cách

bổ sung vài giọt HCl 1N, sau đó bổ sung 0,5 ml dung dịch sulphanilamide 0,2% và 0,5

ml N-napthylethyenediamine hydrochloride

Đọc kết quả: Thử nghiệm nitratase là (+) khi xuất hiện màu hồng Trường hợp không có màu hồng xuất hiện, tiếp tục định tính nitrate bằng bột kẽm Nếu phản ứng nitrate có màu hồng do sự hiện diện của nitrate thì thử nghiệm là (-), ngược lại nếu không chuyển màu thì thử nghiệm nitrate là (+)

3.4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng đối kháng

Việc thử đối kháng nhằm tìm được các dòng đối kháng với nấm Pyricularia

oryzae Tiến hành bằng phương pháp cấy kép: nấm được cấy vào đĩa petri chứa môi

trường PDA và ủ ở nhiệt độ 30oC trong 5 ngày ở tủ ủ Sau 5 ngày, tiến hành cấy vi khuẩn ở 4 bên bề mặt đĩa nấm đã ủ Các đĩa môi trường này sau đó tiếp tục được ủ trong 5 ngày ở nhiệt độ phòng Sau 5 ngày quan sát sự hình thành vùng kháng nấm và tính tỷ lệ ức chế sự phát triển của nấm bởi vi khuẩn được tính theo công thức:

Trong đó: I: tỷ lệ ức chế sự phát triển của nấm bởi vi khuẩn

R: bán kính của hệ sợi nấm trên môi trường trên đĩa đối chứng (cm) r: bán kính của hệ sợi trong đĩa có chủng vi khuẩn (cm)