Pseudomonasfluorescens
- Khả năng sản sinh siderophore của Bacillus và Pseudomonas fluorescens
Dựa theo phương pháp SD-CASA (A Simple double-layered Chrome Azurol S Agar) của Hu và Xu (2011), dựa trên sự biến đối từ màu xanh của dung dịch Chrome Azurol S sang màu vàng khi có sự hiện hiện của siderophore được sản sinh xung quanh khuẩn lạc vi khuẩn. Đo đường kính vòng halo màu vàng xung quanh khuẩn lạc để so sánh khả năng sản sinh siderophore của vi khuẩn…
Chuẩn bị dung dịch CAS-blue: 60mg CAS trong 50 ml H2O, 10 ml Fe3+ gồm 0,0027g FeCl3.6H20, 8,3µl HCl 37% và 72,9 mg HDTMA trong 40 ml H2O (Đặng Thị Thùy Vân, 2013).
- Xác định khả năng sản sinh các enzyme phân hủy vách tế bào nấm bệnh
cellulose của vi khuẩn Bacillus (Võ Văn Phƣớc Quệ, 2011)
Dựa vào khả năng phân hủy của các enzyme trên cơ chất đặc trưng: cellulase phân hủy CMC (Carboxylmethyl Cellulose). Cách tiến hành: dùng que cấy lấy sinh khối vi khuẩn rồi chấm lên những vị trí khác nhau trên đĩa môi trường khoáng cơ bản có bổ sung 1% CMC. Đo đường kính vòng phân hủy các cơ chất tương ứng của từng enzyme để xác định khả năng sản sinh các enzyme...Công thức tính khả năng thủy phân (Võ Văn Phước Quệ, 2011)
(Đường kính halo – Đường kính khuẩn lạc)/Đường kính halo x 100
- Kiểm tra khả năng sinh tổng hợp enzyme Protease của Bacillus và
Pseudomonas fluorescens
Hoạt tính protease của các dòng vi khuẩn được đánh giá nhờ vào khả năng tạo vòng phân giải trên môi trường sữa (Priest et al., 1993). Đây là phương pháp đơn giản để bước đầu đánh hoạt tính protease của các dòng vi khuẩn. Với mỗi dòng vi khuẩn hút 5µl dịch nuôi nhỏ vào môi trường SMA và ủ ở 37oC trong 24 giờ. Các dòng vi khuẩn có hoạt tính protease sẽ tạo vòng halo trên môi trường sữa. Đo đường kính thủy phân
để đánh giá hoạt tính protease của các dòng vi khuẩn. Đánh giá khả năng sinh enzyme để tuyển chọn những chủng có hoạt tính enzyme cao: dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D). (D - d) càng lớn thì khả năng sinh enzyme càng cao (D là đường kính vòng halo, d đường kính giọt nuôi vi khuẩn).
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Thí nghiệm 1: Phân lập vi khuẩn Bacillus và Pseudomonas fluorescens vùng
đất của rễ lúa.
Từ các mẫu đất vùng rễ lúa được thu thập tại hai tỉnh Đồng Tháp và Cần Thơ, tiến hành phân lập được 77 dòng vi khuẩn, kết quả thu được 19 dòng vi khuẩn Bacillus
và 24 dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescen có khả năng đối kháng với mẫu nấm
Pyricularia oryzae. Nhận diện trên đĩa petri các dòng vi khuẩn đối kháng dựa trên khả
năng ngăn chặn sự phát triển của khuẩn ty nấm xung quanh khuẩn lạc vi khuẩn.
Hình 6. Một số hình dạng khuẩn lạc của các dòng Bacillus phân lập đƣợc
với độ phóng đại 10 lần
Bảng 4. Đặc điểm khuẩn lạc và đặc điểm tế bào của 19 dòng vi khuẩn
Bacillus
STT
Tên dòng vi
khuẩn
Đặc điểm khuẩn lạc Đặc điểm tế bào
Màu sắc Hình dạng Bìa Độ nổi Đƣờng kính (mm) Chuyển động Hình dạng Gram
1 B3 Vàng nhạt Không đều Răng cưa Lài 1,3 + Que dài + 2 B9 Trắng đục Không đều Răng cưa Mô 1,0 + Que dài + 3 B11-1 Vàng nhạt Không đều Răng cưa Lài 1,5 + Que dài + 4 B11-2 Trắng đục Không đều Răng cưa Mô 1,3 + Que dài + 5 B13 Vàng nhạt Không đều Răng cưa Lài 2,0 + Que ngắn + 6 B15 Trắng đục Không đều Răng cưa Mô 1,0 + Que dài - 7 B16-1 Trắng đục Không đều Răng cưa Mô 1,5 + Que dài + 8 B16-2 Trắng đục Không đều Nguyên Mô 1,3 + Que dài + 9 B18 Trắng đục Không đều Răng cưa Mô 1,5 + Que rất dài + 10 B19 Trắng đục Không đều Răng cưa Lài 2,5 + Que dài + 11 B25 Vàng đậm Tròn Nguyên Mô 0,8 + Que ngắn +
12 B28 Trắng đục Không đều Răng cưa Lài 2,0 + Que dài + 13 B29 Trắng đục Không đều Răng cưa Lài 2,0 + Que dài + 14 B30 Trắng đục Không đều Răng cưa Mô 2,0 + Que ngắn + 15 B31 Trắng đục Không đều Nguyên Lài 1,5 + Que dài + 16 B33 Vàng đục Không đều Nguyên Mô 1,5 + Que dài + 17 B35 Trắng đục Không đều Răng cưa Lài 1,6 + Que dài + 18 B39 Trắng đục Không đều Răng cưa Mô 1,0 + Que dài + 19 B41 Vàng nhạt Không đều Răng cưa Lài 1,2 + Que dài -
Đặc điểm tế bào và khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn Bacillus trên môi trường NA được trình bày trong Bảng 4, hầu hết các dòng vi khuẩn Bacillus phân lập được có màu trắng đục, một số có màu vàng nhạt, tất cả có dạng không đều hoặc răng cưa. Độ nổi khuẩn lạc có 2 dạng mô và lài, đa số khuẩn lạc có bề mặt nhiều nếp nhăn. Qua quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 400 lần cho thấy tất cả các dòng vi khuẩn có dạng hình que, có khả năng di động. Tiến hành nhuộm Gram đa số là gram dương, cụ thể trong số 19 dòng vi khuẩn Bacillus có 17 dòng Gram dương bắt màu tím xanh của crystal violet chiếm 89,47% và 2 dòng Gram âm do bắt màu hồng của fucshin (10,53%), điều này cho thấy đặc điểm của tế bào và khuẩn lạc giống với đặc điểm của vi khuẩn Bacillus phù hợp với kết quả của Nguyễn Thị Phương Như (2009) và tương tự như mô tả của Nguyễn Lân Dũng (1997). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 7. Một số hình dạng khuẩn lạc của các dòng Pseudomonas fluorescens
Bảng 5. Đặc điểm khuẩn lạc và đặc điểm tế bào của 24 dòng vi khuẩn
Pseudomonas fluorescens
STT Tên dòng vi khuẩn
Đặc điểm khuẩn lạc Đặc điểm tế bào
Màu sắc Hình dạng Bìa Độ nổi Đƣờng kính (mm) Chuyển động Hình dạng Gram
1 P1 Vàng nhạt Không đều Răng cưa Mô 1,5 + Que dài - 2 P3 Vàng nhạt Không đều Răng cưa Mô 2,0 + Que rất dài - 3 P4 Vàng nhạt Không đều Nguyên Lài 1,2 + Que rất dài - 4 P8 Trắng đục Không đều Răng cưa Lài 2,0 + Que ngắn - 5 P11-1 Vàng nhạt Không đều Nguyên Lài 2,0 + Que dài - 6 P11-2 Trắng đục Không đều Răng cưa Mô 1,5 + Que dài - 7 P12 Vàng nhạt Tròn Nguyên Lài 1,2 + Que ngắn - 8 P13-1 Vàng nhạt Tròn Nguyên Lài 1,5 + Que ngắn - 9 P13-2 Trắng đục Tròn Nguyên Mô 1,2 + Que rất dài - 10 P15 Vàng nhạt Không đều Nguyên Lài 1,0 + Que dài - 11 P16 Trắng đục Không đều Răng cưa Lài 2,0 + Que dài - 12 P19 Vàng đục Tròn Nguyên Lài 2,0 + Que dài - 13 P21 Vàng đục Không đều Nguyên Mô 2,0 + Que ngắn - 14 P22 Trắng đục Không đều Răng cưa Lài 2,0 + Que ngắn - 15 P27 Vàng đục Không đều Nguyên Mô 1,6 + Que dài - 16 P28 Trắng đục Không đều Răng cưa Lài 2,0 + Que dài - 17 P29 Vàng đục Không đều Nguyên Mô 1,5 + Que dài - 18 P31 Vàng nhạt Tròn Nguyên Mô 1,2 + Que ngắn - 19 P36 Vàng nhạt Tròn Nguyên Mô 2,0 + Que rất dài - 20 P37 Vàng nhạt Tròn Nguyên Lài 1,2 + Que ngắn - 21 P40 Vàng nhạt Không đều Nguyên Lài 1,5 + Que ngắn - 22 P11-1(Đ1) Vàng nhạt Không đều Răng cưa Lài 2,0 + Que rất dài - 23 P11-2(Đ1) Trắng đục Không đều Nguyên Mô 2,0 + Que dài - 24 P12(Đ1) Trắng đục Không đều Răng cưa Lài 2,0 + Que ngắn -
Qua bảng 5 về đặc điểm của khuẩn lạc và tế bào của vi khuẩn Pseudomonas
fluorescens trên môi trường King‟B cho thấy, màu sắc khuẩn lạc có màu trắng đục hay
vàng kem, khuẩn lạc nhỏ, trơn, đa số bìa nguyên và một số là bìa răng cưa, trong đó có một số khuẩn lạc có dạng nhầy hầu hết tế bào đều có dạng hình que và có khả năng di động, tất cả các dòng vi khuẩn thuộc Gram âm khi bắt màu hồng fucshin qua kết quả nhuộm Gram dưới kính hiển vi quang học, theo nghiên cứu trước đây về vi khuẩn
Hình 8. Hình nhuộm gram tế bào của hai dòng vi khuẩn a. Pseudomonas fluorescens b. Bacillus
Tất cả 19 dòng vi khuẩn Bacillus và 24 dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens
đã phân lập được đều có khả năng chuyển động trong môi trường lỏng khi quan sát bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi, tương tự như mô tả của Nguyễn Lân Dũng (1997), Slepecky và Hemphill (2006).
Thí nghiệm 2: Một số thử nghiệm sinh hóa đối với các dòng vi khuẩn Bacillus
a. Thử nghiệm catalase
Vi khuẩn Bacillus là những vi khuẩn có khả năng tạo enzyme catalase có khả năng thủy phân hydrogen peroxide (H2O2) sinh ra H2O và O2 tạo nên hiện tượng sủi bọt khí theo nghiên cứu trước đây về khả năng tạo catalase của Nguyễn Đức Lượng và Nguyễn Thị Thùy Dương (2003), Slepecky và Hemphill (2006), Sharmin và Rahman (2007), thử nghiệm này dùng để phân biệt các vi sinh vật hiếu khí với vi sinh vật kỵ khí. Cơ chế phản ứng của enzyme catalase:
H2O2 catalase H O
2
+O2
Cho vài giọt H2O2 nhỏ lên kính mang vật, sau đó dùng que cấy lấy 1 ít sinh khối của vi khuẩn Bacillus cho vào giọt H2O2 trên, quan sát thấy có hiện tượng sủi bọt khí ở tất cả các dòng vi khuẩn Bacillus được thử nghiệm , cho thấy tất cả 19 dòng trên đều có khả năng sinh enzyme catalase nhưng khác nhau giữa các dòng, kết quả cụ thể như sau : có 6 dòng sủi bọt khí nhanh và ngay lập tức khi giọt H2O2 tiếp xúc với sinh khối vi khuẩn Bacillus chiếm 31,57 %, 9 dòng sủi bọt khí ở mức trung bình, lượng bọt khí sinh ra ít và sau vài giây mới bắt đầu sinh ra nhiều hơn chiếm 47,37 %, 4 dòng sủi bọt khí
a 6 µm b
khoảng sau 15 giây và rất ít khi sinh khối vi khuẩn tiếp xúc với giọt H2O2 chiếm 21,06%.
Hình 9. Bọt khí do enzyme Catalase tiếp xúc với H2O2 tạo thành
a. Đối chứng ; b. Khả năng tạo Catalase yếu
c. Khả năng tạo Catalase trung bình; d. Khả năng tạo Catalase mạnh
b.Kiểm tra khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase
Tinh bột là những phân tử có cấu trúc xoắn ốc hay còn gọi là cấu trúc của amylose do đó khi dung dịch iod tiếp xúc sẽ bị giữ lại bên trong và tạo nên màu xanh thẫm. Enzyme amylase phân hủy tinh bột chủ yếu là dextrin phân tử thấp không cho phản ứng màu với iod (Hình 10) và một ít maltose (Nguyễn Minh Thùy, 2012).
a b
Hình 10. Thử nghiệm amylase đối với các dòng vi khuẩn Bacillus (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
a. Thử nghiệm đối chứng
b. Sau khi thêm iod vào các ống dịch vi khuẩn
Trong bảng 6, thể hiện kết quả khảo sát 19 dòng vi khuẩn Bacillus đều có khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase cụ thể chia làm 3 nhóm: nhóm 1 có 10 dòng vi khuẩn làm mất màu tinh bột và iod ngay lập tức chiếm 52,63%, nhóm 2: 5 dòng vi khuẩn làm mất màu tinh bột và iod sau vài giây chiếm 26,31% cho thấy các dòng này có hoạt tính amylase trung bình và nhóm 3 có 4 dòng vi khuẩn có hoạt tính amylase yếu chiếm 21,06% vì làm mất màu dung dịch tinh bột và iod sau thời gian khoảng 60 giây.
Bảng 6. Kết quả chung các đặc tính sinh hóa của các dòng vi khuẩn Bacillus
STT Tên dòng vi khuẩn Catalase Amylase
1 B3 +++ ++ 2 B9 +++ + 3 B11-1 +++ +++ 4 B11-2 ++ +++ 5 B13 + +++ 6 B15 ++ ++ 7 B16-1 +++ + 8 B16-2 ++ +++ 9 B18 +++ +++ 10 B19 ++ +++ 11 B25 +++ +++ 12 B28 ++ + 13 B29 + ++ 14 B30 ++ + 15 B31 ++ +++ a b ĐC
16 B33 + +++ 17 B35 + +++ 18 B39 ++ ++ 19 B41 +++ ++ Chú thích: Catalase + Khả năng tổng hợp catalase mạnh: +++ + Khả năng tổng hợp catalase trung bình: ++ +Khả năng tổng hợp catalase yếu: +
Amylase
+Khả năng tổng hợp amylase mạnh: +++ +Khả năng tổng hợp amylase trung bình: ++ +Khả năng tổng hợp amylase yếu: +
Thí nghiệm 3: Thử nghiệm sinh hóa đối với các dòng vi khuẩn Pseudomonas
fluorescens
a. Thử nghiệm oxidase
Thử nghiệm này nhằm xác định sự hiện diện của hệ enzyme oxidase hay cytochrome oxidase ở vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy ý, đặc biệt là với dòng vi khuẩn
Pseudomonas fluorescens. Hoạt tính cytochrome oxidase được phát hiện nhờ thuốc thử
p-phenylenediamine. Trong điều kiện có sự hiện diện của cytochrome trong tế bào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens thì thuốc thử này bị oxi hóa thành một hợp chất idolphenol có màu xanh tím hay xanh đen.Thử nghiệm này được thực hiện sau khi cấy chuyển khuẩn lạc vi khuẩn trong 24-48 giờ thì sẽ cho kết quả cao nhất.
Trong tổng số 24 dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens được tiến hành thử nghiệm thì có 16 dòng cho kết quả dương tính tức làm giấy thử chuyển sang màu xanh tím hay xanh đen khi chấm sinh khối khuẩn lạc lên giấy thử, chiếm 66,67% và có 8 dòng vi khuẩn không có xuất hiện màu giấy thử tức vẫn giữ màu khuẩn lạc trên giấy thử cho kết quả âm tính và chiếm 33,33%. Màu sắc xanh đậm nhạt trên giấy thử khi cho sinh khối khuẩn lạc tiếp xúc với phần thuốc thử cũng là một phần chứng tỏ khả năng sinh enzyme oxidase của các dòng vi khuẩn là khác nhau. Kết quả được thể hiện quasố liệu của bảng 7.
Hình 11. Thử nghiệm oxidase đối với các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens
a. Phản ứng dƣơng tính khi giấy thử chuyển sang màu xanh đen
b. Phản ứng âm tính khi giấy thử giữ nguyên màu sắc khuẩn lạc
c. Thử nghiệm đối chứng
b. Thử nghiệm nitratase (Khử nitrate)
Các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens có khả năng khử nitrate tổng hợp hệ enzyme nitratase xúc tác sự khử nitrate thành nitrite và nitơ phân tử diễn ra trong điều kiện không có oxi phân tử. Hoạt tính nitratase được định tính dựa trên sự tạo hành nitrite và sự cạn kiệt nitrate. Nitrite được tạo ra từ nitrate sẽ phản ứng với sulphanilamide và N-napthylethylenediamine hydrochloride ở pH acid cho hợp chất có màu hồng.Tuy nhiên, một số dòng vi khuẩn tiếp tục chuyển hóa nitrite thành các hợp chất khác nên mặc dù có sự hiện diện của nitratase nhưng môi trường cũng không xuất hiện màu hồng. Trường hợp này kiểm chứng sự cạn kiện của nitrate bằng bột kẽm, nếu xuất hiện màu hồng thì là âm tính. Thí nghiệm này được tiến hành với 24 dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens cho kết quả như bảng 7
Qua bảng 7 cho thấy có 16 dòng vi khuẩn cho màu hồng ngay lập tức (chiếm 66,67%) ngay sau khi cho sulphanilamide và N-napthylethylenediamine hydrochloride vào các ống nghiệm chứa dịch vi khuẩn, màu hồng trên các ống nghiệm là khác nhau từ nhạt đến đậm cho thấy khả năng khử nitrate của các dòng vi khuẩn là khác nhau và 8 ống nghiệm không đổi màu vẫn giữ màu của dịch tăng sinh, tiếp tục cho một ít bột kẽm vào 8 ống nghiệm trên, sau 60 giây vẫn không đổi màu điều này chứng tỏ 8 dòng vi khuẩn trên điều có khả năng khử nitrase và dương tính.
ĐC
b c
Hình 12. Thử nghiệm nitratase đối với các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens
a. Thử nghiệm đối chứng vào môi trƣờng không nuôi tăng sinh vi khuẩn
b.Phản ứng dƣơng tính sau khi thêm thuốc thử vào môi trƣờng chuyển sang
hồng
c. Phản ứng dƣơng tính khi thêm bột kẽm vào vẫn không đổi màu môi (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
trƣờng
Bảng 7. Kết quả chung các đặc tính sinh hóa của các dòng vi khuẩn
Pseudomonas fluorescens
STT Tên dòng vi khuẩn Oxidase Khử nitrate
1 P1 + + 2 P3 + + 3 P4 + + 4 P8 + + 5 P11-1 + + 6 P11-2 + + 7 P12 - + 8 P13-1 + + 9 P13-2 + + 10 P15 - + 11 P16 - + 12 P19 - + 13 P21 - + 14 P22 + + 15 P27 - + a b c
16 P28 - + 17 P29 + + 18 P31 + + 19 P36 + + 20 P37 + + 21 P40 - + 22 P11-1 (Đ1) + + 23 P11-2 (Đ1) + + 24 P12 (Đ1) + + Ghi chú: Oxidase + Oxidase dương tính:+ + Oxidase âm tính:-