từ vùng đất của rễ lúa
a) Thu mẫu đất trên ruộng lúa tại hai tỉnh Đồng Tháp và Cần Thơ
Các mẫu đất được thu từ các ruộng lúa không bị bệnh đạo ôn khi cây lúa được 40- 45 ngày. Mỗi mẫu đất được thu tại 5 vị trí trên hai đường chéo của ruộng; 4 vị trí ở 4 góc ruộng, 1 vị trí tại giao điểm hai đường chéo. Đất được cho vào túi nilon có gòn thấm nước để giữ ẩm, ghi thông tin về mẫu như mã số, địa chỉ thu mẫu,... Mẫu được giữ ở nhiệt độ 4-8oC và được phân lập trong 24 giờ. Theo sơ đồ sau:
b) Phân lập và tách ròng vi khuẩn vùng rễ lúa từ các mẫu đất thu được
Phân lập
Trộn đều mẫu đất, mỗi mẫu cân 10g đất và cho vào bình tam giác chứa 90ml nước cất đã được khử trùng. Bình tam giác và các dụng cụ chứa dung dịch đất khác phải có nắp đậy để hạn chế mẫu bị nhiễm vi khuẩn từ không khí. Khuấy đều mẫu 30 phút bằng máy khuấy từ. Sau đó tiếp tục:
- Rút 1ml dung dịch đất và cho vào 9ml nước cất trong ống đã được khử trùng, trộn đều.
- Rút 1 ml dung dịch trong ống và cho vào 9ml nước cất trong ống mới đã được khử trùng, trộn đều.
- Rút 1ml dung dịch đất trong ống mới và cho vào 9ml nước cất trong ống mới khác đã được khử trùng, trộn đều.
- Rút 50 µl dung dịch đất trong ống pha loãng cuối cùng cho vào đĩa môi trường NA để phân lập các dòng Bacillus và môi trường đặc hiệu King‟ B đối với
Pseudomonas fluorescens. Dùng que trải thủy tinh để trải đều mẫu. Mỗi mẫu trải 2 đĩa
để hạn chế sai số. Các đĩa được ủ ở nhiệt độ 300C cho đến khi các khuẩn lạc xuất hiện.
Tách ròng
Khi khuẩn lạc xuất hiện, chọn những khuẩn lạc vi khuẩn có hình dạng và màu sắc tương sự như đặc điểm khuẩn lạc của Bacillus và Pseudomonas fluorescens để tiến hành cấy chuyển sang đĩa petri khác chứa môi trường tương ứng. Việc cấy chuyển được tiến hành nhiều lần cho đến khi thu được khuẩn lạc ròng, quan sát dưới kính hiển vi, vi khuẩn được gọi là ròng (thuần chủng) khi có sự đồng nhất về hình dạng, kích thước và màu sắc.
c) Quan sát hình thái khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn
- Quan sát và mô tả đặc điểm các khuẩn lạc
Khi cấy chuyển phân lập vi khuẩn trên đĩa môi trường đặc hiệu, ta tiến hành quan sát và mô tả đặc điểm của các khuẩn lạc bao gồm các chỉ tiêu sau: hình dạng, màu sắc, độ nổi và hình dạng bìa bằng mắt thường (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2008). Tuy nhiên đối với khuẩn lạc có kích thước quá nhỏ ta có thể dùng kính lúp để quan sát.
- Quan sát khả năng chuyển động của vi khuẩn
Sau khi phân lập và tách ròng vi khuẩn, tiến hành quan sát hình dạng tế bào và sự chuyển động của vi khuẩn bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2008)
- Cách làm tiêu bản giọt ép:
Nhỏ khoảng 20 µl nước cất vô trùng lên miếng lam sạch.
Khử trùng que cấy vòng bằng cách đốt cho nóng đỏ trên ngọn lửa đèn cồn. Dùng que cấy đã khử trùng lấy một ít sinh khối vi khuẩn từ một khuẩn lạc rời rồi trải vào trong giọt nước trên lame.
Đậy lamelle lên giọt huyền phù vi khuẩn.
Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi để thấy được hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn.
Dùng que cấy đã khử trùng lấy một ít sinh khối vi sinh vật trải đều lên kính Hơ mẫu vật trên ngọn đèn cồn, cố định vi sinh vật
Nhỏ 1-2 giọt Crystal violet lên kính, trải đều khoảng 2 phút Rửa lại bằng nước cất vô trùng, để mẫu khô
Rửa mẫu bằng cồn 70% đến khi mất hết màu tím Rửa lại bằng nước cất vô trùng, để khô vài giây Nhỏ 1-2 giọt Fucshin, trải đều, để yên 1 phút
Rửa lại nước cất vô trùng đến khi mất hết màu Fucshin Dùng giấy thấm chấm nhẹ khô nước.
Quan sát dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần.
Nếu tế bào vi khuẩn có màu tím xanh: vi khuẩn Gram dương vì vách tế bào ăn màu Crystal violet nên có màu tím xanh.
Nếu tế bào vi khuẩn có màu hồng đỏ: vi khuẩn Gram âm do không còn màu của Crystal violet nên có màu hồng của Fucshin.