phân lập vi khuẩn lactobacillus spp. từ cá tra và cá trê có khả năng ức chế vi khuẩn edwardsiella ictaluri

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN Lactobacillus spp. TỪ CÁ TRA VÀ CÁ TRÊ CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS.TS NGUYỄN VĂN THÀNH SINH VIÊN THỰC HIỆN NGUYỄN TRƢƠNG DUY ANH MSSV:3102719 LỚP:CNSH K36 Cần Thơ, Tháng 12/2013 Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN (ký tên) SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) PGS.TS. Nguyễn Văn Thành Nguyễn Trương Duy Anh DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) PGS.TS. Ngô Thị Phương Dung i Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT LỜI CẢM TẠ Đầu tiên xin cảm ơn ba mẹ có ơn sinh thành nuôi nấng ngày nên người. Xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô trường Đại học Cần Thơ tận tình giảng dạy truyền đạt kiến thức quý báu, giúp đỡ suốt thời gian học tập trường. Cảm ơn cô Bùi Thị Minh Diệu dõi theo, tư vấn, dìu dắt cho em. Và đặc biệt em xin chân thành cảm ơn Thầy PGS.TS. Nguyễn Văn Thành tận tình hướng dẫn, ân cần giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em thực đề tài. Và cám ơn giúp đỡ nhiệt tình anh Huỳnh Xuân Phong, anh Nguyễn Ngọc Thạnh, anh Phạm Hồng Quang toàn thể anh chị, bạn học viên cao học em sinh viên thực tập phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh học Thực phẩm tận tình giúp đỡ thời gian thực đề tài. Chân thành cảm ơn với lòng trân trọng nhất! NGUYỄN TRƢƠNG DUY ANH ii Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT TÓM TẮT Đề tài thực với mục đích tìm dòng Lactobacillus spp. có đặc tính tốt nhằm sản xuất probiotic bacteriocin phòng trị bệnh cho cá tra. Từ mẫu cá tra cá trê thu tỉnh Đồng Tháp Vĩnh Long 17 dòng Lactobacillus spp. phân lập. Trong 17 phân lập được, dòng có khả ức chế vi khuẩn Edwardsiella ictaluri kiểm tra phương pháp nhỏ giọt (Agar-spot test). Chỉ dòng CT-TB7 CT2-TB11 có khả ức chế vi khuẩn Edwardsiella ictaluri kiểm tra phương pháp giếng thạch (Well-difusion-agar test). Môi trường MRS bổ sung thêm yeast extract nồng độ 3% w/v môi trường thích hợp cho vi khuẩn Lactobacillus spp. tuyển chọn phát triển tạo bateriocin ức chế vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ cá tra. Từ khóa: bacteriocin, cá tra, Edwardsiella ictaluri, Lactobacillus spp. iii Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT MỤC LỤC Trang XÉT DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG . i LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT . iii MỤC LỤC . iv DANH SÁCH BẢNG . vii DANH SÁCH HÌNH . viii TỪ VIẾT TẮT ix CHƢƠNG I. GIỚI THIỆU . 1.1. Đặt vấn đề 1.2. Mục tiêu đề tài 1.3 Nội dung nghiên cứu CHƢƠNG II. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU . 2.1. Tổng quan cá da trơn 2.2. Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bệnh gan thận mủ Edwarsdsiella ictaluri cá da trơn . 2.3 Giới thiệu vi khuẩn lactic, Lactobacillus spp. tình hình nghiên cứu probiotic bacteriocin CHƢƠNG III. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1. Phƣơng tiện nghiên cứu . 18 3.1.1. Thời gian địa điểm 18 3.1.2. Dụng cụ, thiết bị 18 3.1.2. Nguyên vật liệu . 18 3.1.3. Hóa chất môi trường . 18 3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu . 20 3.2.1. Thu mẫu . 20 iv Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 3.2.2. Thí nghiệm 1. Phân lập nhận diện dòng vi khuẩn phân lập thuộc giống Lactobacillus 20 3.2.3. Thí nghiệm 2. Tuyển chọn dòng Lactobacillus spp. có khả kháng Eddwardsiella ictaluri cao 22 3.2.4. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng thành phần môi trường nuôi cấy lên hình thành bacteriocin vi khuẩn Lactobacillus spp. . 27 CHƢƠNG IV. KẾT QUẢ THẢO LUẬN .29 4.1 Phân lập nhận diện dòng vi khuẩn phân lập đƣợc thuộc giống Lactobacillus . 29 4.1.1 Phân lập vi khuẩn từ dày-ruột cá tra cá trê . 29 4.1.2 Đặc điểm hình thái sinh hóa dòng vi khuẩn phân lập . 30 4.2 Kiểm tra khả ức chế Edwardsiella ictaluri 17 dòng vi khuẩn Lactobacillus spp. phân lập đƣợc . 37 4.2.1 Phương pháp nhỏ giọt 37 4.2.2 Phương pháp khuếch tán giếng thạch . 43 4.3. Khảo sát ảnh hƣởng thành phần môi trƣờng nuôi cấy lên khả kháng khuẩn vi khuẩn Lactobacillus spp. . 43 CHƢƠNG V: KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ 47 1.Kết luận 47 2. Đề nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 48 PHỤ LỤC . 52 Phụ Lục 1. Phƣơng Pháp Nghiên Cứu 52 1.1 Môi trƣờng . 52 1.1.1 Môi trường phân lập nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus spp. . 52 1.1.2 Môi trường nuôi Edwardsiella ictaluri . 52 v Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 1.1.3 Môi trường kiểm tra khả ức chế Edwardsiella ictaluri dòng Lactobacillus spp. phân lập 53 2. Quan sát hình thái, kích thƣớc, đo kích thƣớc dòng vi khuẩn phân lập đƣợc dƣới kính hiển vi 53 2.1. Quan sát hình thái vi khuẩn khảo sát khả chuyển động vi khuẩn . 53 2.2 Nhuộm Gram thực test sinh hóa để xác định dòng vi khuẩn phân lập thuộc vi khuẩn lactic 54 Phụ Lục 2. Kết Quả Thí Nghiệm 55 Phụ Lục 3. Phân Tích Thống Kê 58 vi Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1. Các sản phẩm trao đổi chất có tính kháng khuẩn tạo LAB . Bảng 2. Thuộc tính vài bacteriocin 13 Bảng 3. Khả ức chế số vi khuẩn plantaricin từ Lactobacillus plantarum 14 Bảng 4: Thành phần môi trường MRS broth 18 Bảng 5: Thành phần môi trường Trypticase (tryptic) Soy (TSB) . 19 Bảng 6: Các dòng vi khuẩn phân lập từ cá tra, cá trê tỉnh Đồng Tháp ,Vĩnh Long 29 Bảng 7: Đặc tính khuẩn lạc dòng vi khuẩn phân lập môi trường MRS agar sau 48 nuôi cấy . 31 Bảng 8: Đặc điểm hình thái dòng vi khuẩn phân lập môi trường MRS agar sau 48 nuôi cấy . 33 Bảng 9: Tổng hợp đặc điểm hình thái sinh hóa dòng vi khuẩn phân lập 35 Bảng 10: Khả ức chế vi khuẩn Edwardsiella ictaluri dòng Lactobacillus spp. phân lập kiểm tra phương pháp nhỏ giọt 37 Bảng 11: Khả ức chế Edwardsiella ictaluri dòng vi khuẩn Lactobacillus spp. phân lập phương pháp khuếch tán giếng thạch . 39 Bảng 12. Đường kính vòng vô khuẩn dòng CT2-TB7 loại môi trường MRS bổ sung 42 Bảng 13. Đường kính vòng vô khuẩn dòng CT2-TB11 loại môi trường MRS bổ sung 43 Bảng 14. Đường kính vòng vô khuẩn dòng vi khuẩn CT2-TB7 CT2-TB11 loại môi trường MRS bổ sung 44 vii Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1. Nuôi cá tra theo hình thức thâm canh ven sông Hậu Hình 2. Hình thái học cá tra Hình 3.Khuẩn lạc dòng vi khuẩn Lactobacillus spp. phân lập môi trường MRS agar sau 48 nuôi cấy . 30 Hình 4. Hình thái dòng vi khuẩn phân lập độ phóng đại 1000 lần 31 Hình 5. Vi khuẩn phân lập Gram dương sau nhuộm độ phóng đại 1000 lần . 33 Hình 6. Thử nghiệm catalase dòng vi khuẩn phân lập 33 Hình 7. Thử nghiệm oxidase dòng vi khuẩn phân lập 34 Hình 8. Các dòng vi khuẩn phân lập bào tử nhuộm quan sát độ phóng đại 1000 lần . 34 Hình Khả ức chế vi khuẩn Edwardsiella ictaluri dòng CT1-TB1 phân lập kiểm tra phương pháp nhỏ giọt 36 Hình 10. Khả ức chế bacteriocin dòng Lactobacillus spp. sinh lên Edwardsiella ictaluri . 40 Hình 11. Biểu đồ so sánh khả kháng Edwardsiella ictaluri dòng Lactobacillus spp. phân lập phương pháp nhỏ giọt phương pháp khuếch tán giếng thạch . 41 Hình 12. Biểu đồ so sánh đường kính vòng vô khuẩn loại môi trường MRS bổ sung thành phần dòng vi khuẩn CT-TB7 CT2-TB11. . 46 viii Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT TỪ VIẾT TẮT ATP : Adenosin triphosphate BHI: Brain Heart Infusion ĐBSCL: Đồng sông Cửu Long FAO : Food and Agriculture Organization of the United Nations ( Tổ chức lương thực Nông nghiệp Liên Hợp Quốc) LAB: Lactic acid bacteria TSA : Trypicase soy agar WHO : World Health Organization ( Tổ chức Y tế giới) Cách đặt tên dòng vi khuẩn phân lập: Tên loài cá thu mẫu - Địa điểm thu mẫu. Trong đó: CT dòng vi khuẩn phân lập từ cá trê CTR dòng vi khuẩn phân lập từ cá tra LV mẫu thu huyện Lấp Vò tỉnh Đồng Tháp TB mẫu thu huyện Tam Bình tỉnh Vĩnh Long ix Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Sodium Chloride g/L Nước cất 1000 mL (http://www.bd.com/europe/regulatory/Assets/IFU/Difco_BBL/237200.pdf) 1.1.3 Môi trƣờng kiểm tra khả ức chế Edwardsiella ictaluri dòng Lactobacillus spp. phân lập Môi trường TSA (Trypticase soy agar) có thành phần sau: Pancreatic Digest of Casein 15 g/L Soy Peptone g/L Sodium Chloride g/L Agar 15 g/L Nước cất 1000 mL (http:www.mobio.com/images/custom/file/protocol/12115.pdf) 2. Quan sát hình thái, kích thƣớc, đo kích thƣớc dòng vi khuẩn phân lập đƣợc dƣới kính hiển vi 2.1. Quan sát hình thái vi khuẩn khảo sát khả chuyển động vi khuẩn - Sau phân lập tách ròng vi khuẩn, tiến hành quan sát hình dạng vi khuẩn phân lập kính hiển vi quang học. Cách chuẩn bị mẫu vi khuẩn sau: - Nhỏ giọt nước cất vô trùng lên kính mang vật. - Khử trùng kim cấy lửa đèn cồn để nguội. - Dùng kim cấy lấy khuẩn lạc trải giọt nước kính mang vật. - Dùng kính đậy vật, đậy lên giọt nước cách để cạnh kính đậy vật tiếp xúc với kính mang vật góc 450, hạ kính đậy vật xuống từ từ nhẹ nhàng cho mẫu vật bọt khí. 52 Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT - Quan sát mẫu vật kính hiển vi quang học từ vật kính 40X 100X để thấy hình dạng vi khuẩn (Cao Ngọc Điệp Nguyễn Hữu Hiệp, 2008). - Để quan sát khả chuyển động vi khuẩn làm tiêu tương tự tiêu quan sát hình thái xem vật kính 40X 100X, ghi nhận chuyển động vi khuẩn. 2.2 Nhuộm Gram thực test sinh hóa để xác định dòng vi khuẩn phân lập đƣợc thuộc vi khuẩn lactic a. Nhuộm Gram vi khuẩn Sau quan sát đo kích thước tế bào vi khuẩn, tiến hành nhuộm Gram vi khuẩn. Quá trình nhuộm Gram thực sau: - Lấy 10 µm nước cất vô trùng lên kính mang vật. - Dùng que cấy khử trùng đèn cồn lấy vi sinh vật trải mỏng vi sinh vật lên kính mang vật. - Hơ mẫu vật lửa đèn cồn nhằm cố định vi sinh vật kính mang vật. - Nhỏ từ đến hai giọt Crytal Violet lên kính mang vật có chứa mẫu vi sinh vật cố định, trải Crytal Violet que cấy để hai phút. - Rửa lại nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô nước. - Nhỏ từ đến hai dung dịch iod, trải que cấy để phút. - Rửa lại nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô nước. - Rửa lại cồn 70o thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối kính mang vật giọt cồn cuối không màu tím nữa. - Rửa lại nước cất vô trùng vài giây, chậm nhẹ cho khô. - Nhỏ từ đến hai giọt Fushin trải que cấy sau để phút. - Rửa lại nước cất vô trùng giọt cuối không màu Fushin. 53 Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT - Dùng giấy thấm chậm nhẹ cho kính mang vật khô nước. - Quan sát mẫu kính hiển vi quang học độ phóng đại 1000 lần ghi nhận Gram vi khuẩn. Nếu mẫu vi khuẩn có màu tím xanh Crystal Violet mẫu Gram dương, có màu hồng Fushin mẫu Gram âm (Cao Ngọc Điệp Nguyễn Hữu Hiệp, 2008). b. Thực test sinh hóa - Nhuộm bào tử. + Làm vết bôi cố định mẫu vi sinh vật lame kính sạch. + Nhuộm dung dịch lục Malachite 10 phút, rửa nước. + Nhuộm lại dung dịch Safranin 30 giây, rửa nước, thấm khô. + Quan sát bào tử vi khuẩn kính hiển vi độ phóng đại 1000 lần. Bào tử có màu lục, tế bào có màu đỏ. - Thử nghiệm catalase. + Lấy sinh khối khuẩn lạc môi trường thạch MRS sau 24 – 48 ủ. Hòa sinh khối vào giọt nước nhỏ sẳn miếng lame. + Thêm vào một vài giọt H2O2 3%. + Quan sát hình thành bọt khí ghi nhận kết quả: dương tính có hình thành bọt khí oxi, kết âm tính không hình thành bọt khí (Alexander et al., 2004). - Thử nghiệm oxydase: + Đặt miếng giấy lọc vô trùng vào đĩa petri vô trùng, lên lame kính vô trùng. Nhỏ vài giọt thuốc thử Tetramethyl-p-phenylendiamin dihydrochlorid 1% lên miếng giấy lọc. Dùng que cấy Platin que gỗ vô trùng lấy khuẩn lạc (tốt khuẩn lạc không 48 giờ), mài kỹ lên phần giấy lọc nhỏ thuốc thử. 54 Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT + Đọc kết quả: xuất màu tím sẫm sau từ 10 -30 giây oxydase dương tính, không đổi màu oxydase âm tính (Alexander et al., 2004). - Đếm mật số vi khuẩn buồng đếm hồng cầu. + Tiến hành: Lắc ống nghiệm chứa mẫu pha loãng, dùng micropipette hút 10 µL dịch trải lên mặt kính, đậy kính lên lưới đếm. Chú ý không để tạo bọt khí lưới đếm tràn dịch mẫu xuống rãnh. Đặt buồng đếm hồng cầu lên bàn kính hiển vi, sau tiến hành đếm tế bào ô lớn góc. Trong ô lớn, đếm từ ô thứ đến ô thứ 16. Chỉ đếm tế bào nằm bên ô tế bào nằm cạnh liên tiếp chiều. Ghi số lượng tế bào đếm ô lớn. Đếm buồng đếm sau lấy giá trị trung bình. Sau dùng xong, buồng đếm kính phải đem rửa lau khô. + Tính kết quả: Số lượng tế bào 1mL mẫu dịch tính công thức: Số tế bào/mL = (a*4000*103*c)/b Trong đó: a : Số tế bào ô lớn. b : Số ô ô lớn. c : Độ pha loãng (100 lần). 103 : chuyển mm3 mL (1000 mm3 = mL). Phụ Lục . KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Bảng 15. Khả ức chế vi khuẩn Edwardsiella ictaluri dòng Lactobacillus spp. phân lập đƣợc kiểm tra phƣơng pháp nhỏ giọt Stt Đƣờng kính vòng vô khuẩn (mm) Dòng vi khuẩn CT1-TB1 Lần Lần 22 19 Lần 27 Trung bình 22,67 55 Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT CT1-TB2 6,67 CT1-TB3 CT1-TB6 10 20 18 16 CT1-TB9 4,67 CT2-TB4 12 12 9,67 CT2-TB7 15 20 14 16,33 CT2-TB11 22 20 17 19,67 CT2-TB14 10 CT2-TB18 12 12 17 13,67 11 CT3-TB8 12 CTR1-LV1 13 CTR1-LV3 14 CTR1-LV4 15 CTR1-LV6 16 CTR1-LV8 17 CTR1-LV9 Bảng 16. Khả ức chế Edwardsiella ictaluri dòng vi khuẩn Lactobacillus spp. phân lập phƣơng pháp khuếch tán giếng thạch Stt Đƣờng kính vòng vô khuẩn (mm) Dòng vi khuẩn Lần Lần Lần Trung bình CT1-TB1 CT1-TB2 CT1-TB3 CT1-TB6 CT1-TB9 CT2-TB4 CT2-TB7 17 13 15 15 CT2-TB11 10 13 12 11,67 CT2-TB14 10 CT2-TB18 11 CT3-TB8 56 Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 12 CTR1-LV1 13 CTR1-LV3 14 CTR1-LV4 15 CTR1-LV6 16 CTR1-LV8 17 CTR1-LV9 Bảng 17. Đƣờng kính vòng vô khuẩn dòng CT2-TB7 loại môi trƣờng MRS bổ sung Đƣờng kính vòng vô khuẩn (mm) Stt Môi Dòng vi khuẩn Lần Trƣờng Lần Lần Trung bình Y1 6,33 Y2 7,67 Y3 10 12 10 10,67 T1 7,0 T2 6,67 T3 5,33 P1 6,0 P2 5,67 P3 5,33 10 G1 6,0C 11 G2 5,33 12 G3 5,0 13 DC 5,67 CT2-TB7 Bảng 18. Đƣờng kính vòng vô khuẩn dòng CT2-TB11 loại môi trƣờng MRS bổ sung Đƣờng kính vòng vô khuẩn (mm) Stt Dòng vi khuẩn Môi Lần Trƣờng Y1 Lần Lần Trung bình 5,67 57 Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Y2 6,0 Y3 11 9,67 T1 6,0 T2 6,0 T3 5,0 P1 6,33 P2 4,0 P3 4,33 10 G1 4,33 11 G2 5,0 12 G3 4,67 13 DC 5,0 CT2-TB11 Phụ Lục 3. PHÂN TÍCH THỐNG KÊ a) Phân tích phương sai kiểm định LSD 95% đường kính vòng vô khuẩn tạo kiểm tra khả ức chế Edwardsiella ictaluri 17 dòng Lactobacillus spp. phân lập phương pháp nhỏ giọt. One-way ANOVA: Đường kính vòng vô khuẩn versus Dòng vi khuẩn phân lập Source DF SS MS F P Dòng 16 3199.84 199.99 38.49 0.000 Error 34 176.67 5.20 ETotal 50 S = 2.279 3376.51 R-Sq = 94.77% R-Sq(adj) = 92.31% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev 22.667 4.041 6.667 1.528 0.000 0.000 16.000 5.292 4.667 0.577 9.667 4.041 16.333 3.215 ---+---------+---------+---------+-----(--*---) (--*---) (--*--) (--*--) (---*--) (--*--) (--*---) 58 Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 19.667 2.517 0.000 0.000 10 13.667 2.887 11 0.000 0.000 (--*--) 12 0.000 0.000 (--*--) 13 0.000 0.000 (--*--) 14 0.000 0.000 (--*--) 15 0.000 0.000 (--*--) 16 0.000 0.000 (--*--) 17 0.000 0.000 (--*--) Trường ĐHCT (---*--) (--*--) (--*--) ---+---------+---------+---------+-----0.0 8.0 16.0 24.0 Pooled StDev = 2.279 Grouping Information Using Fisher Method Dòng N Mean Grouping 22.667 A 19.667 A B 16.333 B C 16.000 B C 10 13.667 C 9.667 D 6.667 D E 4.667 E 17 0.000 F 16 0.000 F 15 0.000 F 14 0.000 F 13 0.000 F 12 0.000 F 11 0.000 F 0.000 F 0.000 F Means that not share a letter are significantly different. Fisher 95% Individual Confidence Intervals All Pairwise Comparisons among Levels of Dòng 59 Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Simultaneous confidence level = 18.60% Ghi chú: thứ tự dòng vi khuẩn tương tự bảng b) Phân tích phương sai kiểm định LSD 95% đường kính vòng vô khuẩn tạo kiểm tra khả ức chế Edwardsiella ictaluri 17 dòng Lactobacillus spp. phân lập phương pháp khuếch tán giếng thạch One-way ANOVA: Đường kính vòng vô khuẩn versus Dòng vi khuẩn phân lập Source DF SS MS F P Dòng 16 957.843 59.865 160.69 0.000 Error 34 12.667 0.373 Total 50 970.510 S = 0.6104 R-Sq = 98.69% R-Sq(adj) = 98.08% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -+---------+---------+---------+-------- 0.000 0.000 (*) 0.000 0.000 (*) 0.000 0.000 (*) 0.000 0.000 (*) 0.000 0.000 (*) 0.000 0.000 (*) 15.000 2.000 11.667 1.528 0.000 0.000 (*) 10 0.000 0.000 (*) 11 0.000 0.000 (*) 12 0.000 0.000 (*) 13 0.000 0.000 (*) 14 0.000 0.000 (*) 15 0.000 0.000 (*) 16 0.000 0.000 (*) 17 0.000 0.000 (*) (*) (*-) -+---------+---------+---------+-------0.0 5.0 10.0 15.0 60 Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Pooled StDev = 0.610 Grouping Information Using Fisher Method Dòng N Mean Grouping 15.000 11.667 17 0.000 C 16 0.000 C 15 0.000 C 14 0.000 C 13 0.000 C 12 0.000 C 11 0.000 C 10 0.000 C 0.000 C 0.000 C 0.000 C 0.000 C 0.000 C 0.000 C 0.000 C A B Means that not share a letter are significantly different. Fisher 95% Individual Confidence Intervals All Pairwise Comparisons among Levels of Dòng Simultaneous confidence level = 18.60% Ghi chú: thứ tự dòng vi khuẩn tương tự bảng c) Phân tích phương sai kiểm định LSD 95% đường kính vòng vô khuẩn tạo kiểm tra khả ức chế Edwardsiella ictaluri dòng Lactobacillus spp. phân lập CT2-TB7 13 loại môi trường. One-way ANOVA: Đường kính vòng vô khuẩn versus Môi trường Source DF SS MS F P 61 Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT moi truong 12 80.974 6.748 Error 26 22.000 0.846 Total 38 102.974 S = 0.9199 R-Sq = 78.64% 7.97 0.000 R-Sq(adj) = 68.77% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev 6.333 0.577 7.667 0.577 10.667 1.155 7.000 1.000 6.667 0.577 5.333 1.155 6.000 1.000 5.667 1.528 5.333 0.577 10 6.000 1.000 11 5.333 0.577 12 5.000 1.000 13 5.667 0.577 +---------+---------+---------+--------(-----*----) (----*-----) (----*-----) (----*----) (----*-----) (-----*----) (----*----) (----*-----) (-----*----) (----*----) (-----*----) (----*----) (----*-----) +---------+---------+---------+--------4.0 6.0 8.0 10.0 Pooled StDev = 0.920 Grouping Information Using Fisher Method moi truong N Mean Grouping 10.6667 7.6667 B 7.0000 B C 6.6667 B C D 6.3333 B C D E 10 6.0000 C D E 6.0000 C D E 13 5.6667 C D E 5.6667 C D E 11 5.3333 D E A 62 Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 5.3333 D E 5.3333 D E 12 5.0000 E Means that not share a letter are significantly different. Fisher 95% Individual Confidence Intervals All Pairwise Comparisons among Levels of moi truong Simultaneous confidence level = 30.96% d) Phân tích phương sai kiểm định LSD 95% đường kính vòng vô khuẩn tạo kiểm tra khả ức chế Edwardsiella ictaluri dòng Lactobacillus spp. phân lập CT2-TB11 13 loại môi trường. One-way ANOVA: Đường kính vòng vô khuẩn versus Môi trường Source DF SS moi truong 12 Error 26 Total 38 95.744 S = 0.8006 MS F P 79.077 6.590 10.28 0.000 16.667 0.641 R-Sq = 82.59% R-Sq(adj) = 74.56% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -----+---------+---------+---------+---- 5.667 0.577 6.000 1.000 9.667 1.155 6.000 1.000 (----*----) 6.000 1.000 (----*----) 5.000 1.000 6.333 1.155 4.000 0.000 4.333 0.577 (----*---) 10 4.333 0.577 (----*---) 11 5.000 0.000 12 4.667 0.577 (---*----) (----*----) (---*----) (----*----) (----*---) (----*----) (----*----) (---*----) 63 Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 13 4.333 0.577 Trường ĐHCT (----*---) -----+---------+---------+---------+---4.0 6.0 8.0 10.0 Pooled StDev = 0.801 Grouping Information Using Fisher Method moi truong N Mean 9.6667 Grouping 6.3333 B 6.0000 B C 6.0000 B C 6.0000 B C A 5.6667 B C D 11 5.0000 B C D E 5.0000 B C D E 12 4.6667 C D E 13 4.3333 D E 10 4.3333 D E 4.3333 D E 4.0000 E Means that not share a letter are significantly different. Fisher 95% Individual Confidence Intervals All Pairwise Comparisons among Levels of moi truong Simultaneous confidence level = 30.96% e) Phân tích phương sai kiểm định LSD 95% đường kính vòng vô khuẩn tạo kiểm tra khả ức chế Edwardsiella ictaluri dòng Lactobacillus spp. phân lập CT2-TB7 CT2-TB11 13 loại môi trường. One-way ANOVA: Đường kính versus Môi trường Source DF SS MS F P Môi trường 25 169.795 6.792 9.29 0.000 64 Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Error 52 38.000 Total 77 207.795 S = 0.8549 Trường ĐHCT 0.731 R-Sq = 81.71% R-Sq(adj) = 72.92% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev DC-11 5.000 0.000 DC-7 5.667 0.577 G1-11 4.333 0.577 G1-7 6.000 1.000 G2-11 5.000 0.000 G2-7 5.333 0.577 G3-11 4.667 0.577 G3-7 5.000 1.000 P1-11 6.333 1.155 P1-7 6.000 1.000 P2-11 4.000 0.000 P2-7 5.667 1.528 P3-11 4.333 0.577 P3-7 5.333 0.577 T1-11 6.000 1.000 T1-7 7.000 1.000 T2-11 6.000 1.000 T2-7 6.667 0.577 T3-11 5.000 1.000 T3-7 5.333 1.155 Y1-11 5.667 0.577 Y1-7 6.333 0.577 Y2-11 6.000 1.000 Y2-7 7.667 0.577 Y3-11 9.667 1.155 Y3-7 10.667 1.155 --------+---------+---------+---------+(---*---) (---*---) (---*---) (---*---) (---*---) (---*---) (---*---) (---*---) (---*---) (---*---) (---*---) (---*---) (---*---) (---*---) (---*---) (---*---) (---*---) (---*---) (---*---) (---*---) (---*---) (---*---) (---*---) (---*---) (---*---) (---*---) --------+---------+---------+---------+5.0 7.5 10.0 12.5 Pooled StDev = 0.855 Grouping Information Using Fisher Method 65 Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Môi trường N Mean Grouping Y3-7 10.6667 A Y3-11 9.6667 A Y2-7 7.6667 B T1-7 7.0000 B C T2-7 6.6667 B C D Y1-7 6.3333 B C D E P1-11 6.3333 B C D E Y2-11 6.0000 C D E F T2-11 6.0000 C D E F T1-11 6.0000 C D E F P1-7 6.0000 C D E F G1-7 6.0000 C D E F Y1-11 5.6667 C D E F G P2-7 5.6667 C D E F G DC-7 5.6667 C D E F G T3-7 5.3333 D E F G H P3-7 5.3333 D E F G H G2-7 5.3333 D E F G H T3-11 5.0000 E F G H G3-7 5.0000 E F G H G2-11 5.0000 E F G H DC-11 5.0000 E F G H G3-11 4.6667 F G H P3-11 4.3333 G H G1-11 4.3333 G H P2-11 4.0000 H Means that not share a letter are significantly different. Fisher 95% Individual Confidence Intervals All Pairwise Comparisons among Levels of Môi trường Simultaneous confidence level = 5.53% Ghi chú: thứ tự môi trường MRS bổ sung thêm thành phần sau: 1.Yeast extract 1% w/v; 2.Yeast extract 2% w/v; 3. Yeast extract 3% w/v; 4. Tween 80 1% w/v; 5.Tween 80 2% w/v; 6.Tween 80 3% w/v; 7. Pepton 66 Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 1% w/v; 8. Pepton 2% w/v; 9. Pepton 3% w/v; 10. Glucose 1% w/v; 11. Glucose 2% w/v; 12. Glucose 3% w/v; 13. Đối chứng. Các số 11 phía sau đại diện cho dòng vi khuẩn CT2-TB7 CT2-TB11. 67 Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học [...]... NĂNG ỨC CHẾ VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri đã được tiến hành 1.2 Mục tiêu đề tài Nghiên cứu này nhằm mục tiêu phân lập tuyển chọn dòng Lactobacillus spp có khả năng ức chế vi khuẩn Edwarsiella ictaluri gây bệnh ở cá tra 1.3 Nội dung nghiên cứu Phân lập vi khuẩn Lactobacillus spp từ dạ dày của ruột cá tra và cá trê ở hai tỉnh Vĩnh Long và Đồng Tháp Kiểm tra khả năng ức chế vi khuẩn Edwarsiella ictaluri. .. 3.2.1 Thu mẫu Ở các ao nuôi theo mô hình quản canh và bán thâm canh cá tra, cá trê được thu bằng cách chài Ở các ao nuôi theo mô hình thâm canh cá được vớt bằng vợt Chọn ngẫu nhiên từ 3-4 con/ao và cá được mua ở các chợ sẽ được trữ trong thùng đá để mang về phòng thí nghiệm tiến hành giải phẩu và phân lập vi khuẩn 3.2.2 Phân lập và nhận diện các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc thuộc giống Lactobacillus 19... 6 Vi khuẩn Gram (+) Theo nghiên cứu của Galindo (2004) cho thấy các loài vi khuẩn thuộc giống Lactobacillus được phân lập từ dạ dày - ruột của một số loài cá nước ngọt có khả năng ức chế mạnh một số loài vi khuẩn gây bệnh trên tôm cá nước ngọt Khi kiểm tra khả năng ức 14 Chuyên ngành Công nghệ sinh học Vi n NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT chế của các... Lactobacillus phân lâp có khả năng kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cao * Phương pháp: Có hai phương pháp phổ biến để kiểm tra khả năng ức chế lại vi sinh vật khác của vi khuẩn lactic đã được nhiều tác giả trong và ngoài nước thực hiện là nhỏ giọt (agar spot test) và khuếch tán giếng thạch (well diffusion agar) Sau đó dựa vào đường kính vòng vô khuẩn để tuyển chọn những dòng Lactobacillus spp có khả năng ức. .. bằng 2 phương pháp trên, xác định mức độ kháng vi khuẩn E ictaluri từ đó chọn dòng Lactobacillus CT2-TB7 có khả năng kháng vi khuẩn E ictaluri cao nhờ vào đường kính vòng tròn kháng khuẩn lớn nhất (Galindo, 2004) 3.2.4 Khảo sát ảnh hƣởng của thành phần môi trƣờng nuôi cấy đến khả năng ức chế Edwardsiella ictaluri của vi khuẩn Lactobacillus spp 25 Chuyên ngành Công nghệ sinh học Vi n NC & PT Công Nghệ... số, máy vi tính phân tích và lưu trữ số liệu 3.1.3 Nguyên vật liệu Mẫu cá tra, cá trê được thu tại ao nuôi cá tại các ao nuôi theo mô hình thâm canh, bán thâm canh, quản canh và cá bán ngoài chợ ở Đồng Tháp và Vĩnh Long Đây là 2 địa phương có diện tích ao nuôi và lồng bè nuôi cá tra và cá trê lớn ở Đồng bằng sông Cửu Long Chủng vi khuẩn bệnh Edwardsiella ictaluri được nhận từ Bộ môn Sinh học và bệnh... bằng Lactobacillus spp đã được nuôi trước 24 giờ trong MRS broth Ủ kỵ khí ở 300C, 24h Chủng 5ml môi trường BHI có chứa 0,7% agar và 30% E .ictaluri đã nuôi 24 giờ trong BHI Ủ 280C, 48 giờ Đo đường kính vòng vô khuẩn ( nếu có) b Phương pháp 2: Khảo sát vi khuẩn Lactobacillus spp có khả năng kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cao bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch: Kiểm tra khả năng ức chế Edwardsiella. .. hút 50 l bacteriocin thô của Lactobacillus spp bơm vào mỗi lỗ thạch + Ủ ở 280C, 48 giờ +Lấy các đĩa Petri này ra quan sát, ghi nhận khả năng ức chế vi khuẩn E ictaluri thông qua sự hình thành vòng vô khuẩn và đường kính của vòng vô khuẩn (đường kính của vòng vô khuẩn = đường kính tổng – đường kính lỗ thạch (8 mm)) *Sơ đồ khảo sát khả năng ức chế E ictaluri và của các dòng Lactobacillus bằng phương pháp... nhỏ, có kích thước và màu sắc giống nhau) Sau đó quan sát dưới kính hiển vi và thực hiện nhuộm Gram, nhuộm bào tử để định danh sơ bộ dòng vi khuẩn phân lập được thuộc giống Lactobacillus Nếu mẫu ròng cấy chuyển vào ống nghiệm và đem trữ ở 40C cho những nghiên cứu tiếp theo 3.2.3 Tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus spp có khả năng kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cao * Mục đích: tuyển chọn các dòng Lactobacillus. .. và Lucke (1989): Lewus et al (1991); Karthikeyan và Santosh (2009)) Tuy nhiên cho đến nay có khá ít 1 Chuyên ngành Công nghệ sinh học Vi n NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT nghiên cứu sử dụng Lactobaciilus spp hay bacteriocin từ Lactobacillus spp để ức chế lại E ictaluri Vì thế đề tài PHÂN LẬP VI KHUẨN Lactobacillus spp TRONG CÁ TRA VÀ CÁ TRÊ CÓ KHẢ NĂNG . NGUYỄN VĂN THÀNH NGUYỄN TRƢƠNG DUY ANH MSSV:3102719 LỚP:CNSH K 36 Cần Thơ, Tháng 12/2013 Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT i Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC.  -TB7 và CT2-TB11. 46 Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT ix Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT.   Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 6 Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học  10