Sử dụng các trang thiết bị hiện có tại phòng thí nghiệm Công nhệ sinh học Thực phẩm, Viện nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học.
- Thiệt bị, dụng cụ dung để mổ tách lấy phần vật chất trong dạ dày – ruột cá: chài, xô, kéo, dao mổ, găng tay,…
- Thiết bị, dụng cụ dung để phân lập vi khuẩn Lactobacillus sp: Đĩa Petri, que cấy, bình tam giác, bộ pipetman (20-1000 l), tủ cấy vi sinh vật, tủ ủ vi sinh, nồi háp khử trùng nhiệt ướt (autoclave), lò vi sóng, bể điều nhiệt, buồng đếm hồng cầu, máy lắc mẫu, kính hiển vi Olympus,…
- Một số thiết bị, dụng cụ khác: Tủ lạnh, bình hút ẩm (đã loại bỏ các hạt hút ẩm), máy chụp ảnh kỹ thuật số, máy vi tính phân tích và lưu trữ số liệu.
3.1.3. Nguyên vật liệu
Mẫu cá tra, cá trê được thu tại ao nuôi cá tại các ao nuôi theo mô hình thâm canh, bán thâm canh, quản canh và cá bán ngoài chợ ở Đồng Tháp và Vĩnh Long. Đây là 2 địa phương có diện tích ao nuôi và lồng bè nuôi cá tra và cá trê lớn ở Đồng bằng sông Cửu Long.
Chủng vi khuẩn bệnh Edwardsiella ictaluri được nhận từ Bộ môn Sinh học và bệnh thủy sản thuộc khoa thủy sản trường Đại học Cần Thơ.
3.1.4. Hóa chất, môi trƣờng
a. Môi trường :
- Môi trường dùng để phân lập vi khuẩn Lactobacillus spp. : + Môi trường lỏng MRS (De Man, Rogosa and Sharpe).
Bảng 4: Thành phần của môi trƣờng MRS broth (Microbiology manual, MERCK, 2005 (Cat.No.1.10660).
Thành phần Khối lƣợng (g/l)
Peptone from casein 10.0
Meat extract 5.0
Yeast extract 5.0
D (+) glucose 20.0
Di-potassium hydrogen phosphate 2.0
Tween 80 1.0 ml
Di-amonium hydrogen citrate 2.0
Sodium acetate 5.0
Magnesium sulfate 0.1
Manganese sulfate 0.05
+ Môi trường MRS agar
Bảng 5: Thành phần môi trƣờng Trypticase (tryptic) Soy (TSB) (Nguyễn Đức Lƣợng et al.,2003) Thành phần Khối lƣợng (g/l) Trypticase peptone 17 NaCl 5 Phytone peptone 3 K2HPO4 2.5 b. Hóa chất:
- Hóa chất dùng nhuộm Gram vi khuẩn: Dung dịch Iod, fushin, crystal violet, cồn 700, nước cất vô trùng.
- Hóa chất nhuộm bào tử vi khuẩn: Dung dịch lục Malachite (Malachite green) 5%, dung dịch Safranin 0,5%.
- Hóa chất thử khả năng sinh catalase: H2O2 3%
- Hóa chất thử oxydase: Dung dịch Tetramethyl - p - phenylenediamine dihydrocchloride 1% (mua từ công ty Nam Khoa biotek)
- Thuốc thử Kovacs
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.2.1. Thu mẫu 3.2.1. Thu mẫu
Ở các ao nuôi theo mô hình quản canh và bán thâm canh cá tra, cá trê được thu bằng cách chài. Ở các ao nuôi theo mô hình thâm canh cá được vớt bằng vợt. Chọn ngẫu nhiên từ 3-4 con/ao và cá được mua ở các chợ sẽ được trữ trong thùng đá để mang về phòng thí nghiệm tiến hành giải phẩu và phân lập vi khuẩn.
3.2.2. Phân lập và nhận diện các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc thuộc giống
* Mục đích: Phân lập được các dòng vi khuẩn Lactobacillus spp. thuần từ dạ dày, ruột của cá tra, cá trê.
* Sơ đồ thí nghiệm:
Cá Tra, Cá Trê
Mổ tách lấy phần vật chất trong dạ dày- ruột trong tủ cấy vô trùng, cho vào bình tam giác đã khử trùng, đậy kín
Đồng nhất với nước cất vô trùng đưa về dạng lỏng Nuôi trong môi trường MRS broth
( kỵ khí ở nhiệt độ 300C trong 48 giờ) Cấy trên môi trường MRS agar
(ủ kỵ khí ở nhiệt độ 300C trong 48 giờ, trong bình hút ẩm) Kiểm tra hình thái- sinh hóa, tách ròng Lactobacillus spp.
Dòng Lactobacillus spp. thuần
Trữ trong ống thạch nghiêng chứa môi trường MRS agar ở 40 C
Qui trình phân lập vi khuẩn Lactobacillus spp. từ mẫu cá da trơn:
Cá tra, cá trê được thu từ các ao nuôi được mổ ra để lấy phần ruột. Các bộ phận này được rửa sạch bằng nước cất vô trùng và cồn 700 sau đó mổ ra. Phần thức ăn đang được tiêu hóa có trong ruột được cho vào bình tam giác đã được khử trùng và trữ lạnh và mang về phòng thí nghiệm để tiến hành phân lập vi khuẩn Lactobacillus spp.
Mẫu sau khi thu được trong một ao sẽ được đồng nhất bằng nước cất, để lên máy lắc 20 phút (150 vòng/phút), để lắng. Dùng micropipet hút 1ml phần dịch trong cho vào bình tam giác chứa 100ml MRS broth rồi đem ủ ở 300C trong điều kiện kỵ khí trong thời gian 48 giờ.
Pha loãng dịch nuôi cấy trên trong nước cất vô trùng. Sau đó hút 50 l từ các ống nghiệm nhỏ lên môi trường MRS agar và tiến hành trãi mẫu, đậy kín, đem ủ kỵ khí ở 300C trong 48 giờ.
Tiến hành pha loãng và cấy ria từ các khuẩn lạc đã mọc sau 48 giờ ủ ra các đĩa petri có chứa MRS agar để tiến hành tách ròng (khuẩn lạc rời, nhỏ, có kích thước và màu sắc giống nhau). Sau đó quan sát dưới kính hiển vi và thực hiện nhuộm Gram, nhuộm bào tử để định danh sơ bộ dòng vi khuẩn phân lập được thuộc giống Lactobacillus. Nếu mẫu ròng cấy chuyển vào ống nghiệm và đem trữ ở 40C cho những nghiên cứu tiếp theo.
3.2.3. Tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus spp. có khả năng kháng vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri cao.
* Mục đích: tuyển chọn các dòng Lactobacillus phân lâp có khả năng kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cao..
* Phương pháp: Có hai phương pháp phổ biến để kiểm tra khả năng ức chế lại vi sinh vật khác của vi khuẩn lactic đã được nhiều tác giả trong và ngoài nước thực hiện là nhỏ giọt (agar spot test) và khuếch tán giếng thạch (well diffusion agar). Sau đó dựa vào đường kính vòng vô khuẩn để tuyển chọn những dòng Lactobacillus spp. có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ cao.
* Sơ đồ thí nghiệm tổng quát:
Lactobacillus spp.
Kiểm tra khả năng ức chế E. ictaluri bằng phương pháp nhỏ giọt
Nuôi và ly tâm thu bacteriocin thô
Kiểm tra và chọn dòng ức chế E.ictaluri bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch
Chọn ra những dòng Lactobacillus có khả năng kháng E. ictaluri cao
a. Phương pháp 1: Khảo sát vi khuẩn Lactobacillus spp. có khả năng kháng vi khuẩn Edwardsiella -ictaluri cao bằng phương pháp nhỏ giọt:
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 lần lặp lại. - Nhân tố thí nghiệm: 1 nhân tố là 17 dòng vi khuẩn Lactobacillus spp. phân lập
được
- Số đơn vị thí nghiệm: 17 (dòng vi khuẩn phân lập được) x 2 (số lần lặp lại) = 34 Phương pháp nhỏ giọt được tiến hành theo như mô tả bởi Galindo (2004) nhưng có một số biến đổi cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm.
Thực hiện thí nghiệm:
- Kiểm tra khả năng ức chế E. ictaluri của 17 dòng Lactobacillus spp. phân lập bằng phương pháp nhỏ giọt, sau đó chọn những dòng có khả năng kháng E. ictaluri cao. Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào khả năng ức chế của các thành phần mà Lactobacillus spp. sinh ra trong môi trường MRS broth (acid lactic, ethanol, diacetyl, bacteriocin,…) lên dòng vi khuẩn chỉ thị.
- Cách thức thực hiện phương pháp này như sau:
+ Mỗi dòng Lactobacillus spp. Được nuôi trong 2 ống nghiệm (chứa 9 ml MRS broth/ ống) trong 24 giờ. Mỗi ống nghiệm được xem như một lần lập lại.
+ Spot được bơm 50 l dịch nuôi Lactobacillus spp. Được nuôi trong 24 giờ trong MRS broth vào bề mặt mô trường MRS agar đã được rót ra đĩa Petri (mỗi đĩa Petri chỉ kiểm tra khả năng ức chế của một dòng Lactobacillus spp. Gồm 3 spot được làm từ một ống nghiệm của mỗi dòng được nuôi ở trên). Ủ kỵ khí 24 giờ ở 300C cho spot phát triển.
+ 5ml môi trường solf agar (nhiệt độ khoảng 370C) gồm : BHI có chứa 0,5% agar và 30% của E. ictaluri đã nuôi 24 giờ trong môi trường BHI, rót vào MRS agar đã có spot đã phát triển.
+ Ủ ở 280C, 48 giờ
+ Ghi nhận kết quả (đường kính vòng vô khuẩn = đường kính tổng – đường kính spot). Khả năng ức chế lại dòng vi khuẩn gây bệnh được đánh giá theo qui ước của Galindo (2004).
Sơ đồ khảo sát khả năng ức chế E. ictaluri và của các dòng Lactobacillus bằng phương pháp nhỏ giọt:
MRS agar được rót ra đĩa Petri, để nguội Tạo spot bằng Lactobacillus spp. đã được nuôi trước 24 giờ trong MRS broth
Ủ kỵ khí ở 300
C, 24h
Chủng 5ml môi trường BHI có chứa 0,7% agar và 30% E.ictaluri đã nuôi 24 giờ trong BHI
Ủ 280C, 48 giờ
Đo đường kính vòng vô khuẩn ( nếu có)
b. Phương pháp 2: Khảo sát vi khuẩn Lactobacillus spp. có khả năng kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cao bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch:
Kiểm tra khả năng ức chế Edwardsiella ictaluri của Lactobacillus spp. bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch theo như mô tả bởi Nguyễn Thúy Hương và Trần Thị Tưởng An (2008) nhưng được điều chỉnh cho phù hợp với đặc điểm dòng vi khuẩn sử dụng và điều kiện phòng thí nghiệm. Sau đó chọn ra những dòng có khả năng kháng vi khuẩn E. ictaluri cao.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 2 lần lặp lại.
- Nhân tố thí nghiệm: 1 nhân tố là 17 dòng vi khuẩn Lactobacillus phân lập được - Số đơn vị thí nghiệm: 17 (số dòng vi khuẩn phân lập được) x 2 (số lần lặp lại) = 34
Tất cả 17 dòng Lactobacillus spp. phân lập sẽ được nuôi trong môi trường MRS broth để ly tâm thu bacteriocin thô.
- Chuẩn bị bacteriocin thô từ vi khuẩn Lactobacillus spp. phân lập được:
+ Mười bảy (17) dòng Lactobacillus spp. phân lập, mỗi dòng được nuôi trong 2 ống nghiệm (mỗi ống nghiệm được xem như một lần lặp lại) có chứa 19 ml MRS broth/ ống trong 48 giờ, ly tâm 7000 rpm ở nhiệt độ 80C trong 10 phút để lấy phần dịch trong. Điều chỉnh pH của dịch trong về pH 6,0 bằng NaOH 1M. Dịch trong bây giờ được xem như là bacteriocin thô. Dịch thô này sẽ được trữ trong tủ lạnh ở 40C cho đến khi sử dụng.
+ Quy trình chuẩn bị Bacteriocin thô:
Lactobacillus spp.
Nuôi trong môi trường MRS broth (ở điều kiện kỵ khí trong 48 giờ, 300
C)
Ly tâm lấy phần dịch trong ( ly tâm 7000 rpm, trong 10 phút ở 8 0
C)
Điều chỉnh đến pH 6,0 bằng NaOH 1 M Bacteriocin thô
- Kiểm tra khả năng ức chế E. ictaluri của bacteriocin thô bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch:
+ E. ictaluri nhận từ Bộ môn sinh học và Bệnh thủy sản sẽ được nuôi trong môi trường BHI trong 48 giờ, đếm mật số bằng buồng đếm hồng cầu, pha loãng sao cho mật số khoảng 108
tb/ml. Sau đó hút 50 l dịch nuôi này cho vào môi trường TSA đã được rót ra đĩa Petri, trải mẫu, để ráo.
+ Lấy đĩa Petri có chứa vi khuẩn gây bệnh, đục lỗ thạch có đường kính 8 mm (mỗi đĩa Petri đục 4 lỗ: 3 lỗ cho bacteriocin thô vào và 1 lỗ đối chứng cho nước cất vô trùng
+ Dùng micropipette hút 50 l bacteriocin thô của Lactobacillus spp. bơm vào mỗi lỗ thạch.
+ Ủ ở 280C, 48 giờ
+Lấy các đĩa Petri này ra quan sát, ghi nhận khả năng ức chế vi khuẩn E. ictaluri thông qua sự hình thành vòng vô khuẩn và đường kính của vòng vô khuẩn (đường kính của vòng vô khuẩn = đường kính tổng – đường kính lỗ thạch (8 mm)).
*Sơ đồ khảo sát khả năng ức chế E. ictaluri và của các dòng Lactobacillus bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch:
Môi trường TSA Rót ra đĩa Petri, để nguội
Chủng 50 l dịch nuôi E. ictaluri được nuôi 48 giờ, pha loãng để đạt mật số khoảng 108
tb/ml. trãi mẫu, để ráo
Tạo giếng có đường kính 8 mm Bơm 50 l bacteriocin thô/ giếng
Ủ ở 280C, 48 giờ
Đo dường kính vòng vô khuẩn ( nếu có)
* Tuyển chọn những dòng Lactobacillus có khả năng kháng lại vi khuẩn E. ictaluri cao: Sau khi đã xác định 2 dòng Lactobacillus (CT2-TB7 và CT2-TB11) có khả năng kháng lại vi khuẩn E. ictaluri bằng 2 phương pháp trên, xác định mức độ kháng vi khuẩn E. ictaluri từ đó chọn dòng Lactobacillus CT2-TB7 có khả năng kháng vi khuẩn E. ictaluri cao nhờ vào đường kính vòng tròn kháng khuẩn lớn nhất (Galindo, 2004).
3.2.4. Khảo sát ảnh hƣởng của thành phần môi trƣờng nuôi cấy đến khả năng ức chế Edwardsiella ictaluri của vi khuẩn Lactobacillus spp.
a. Mục đích: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ 4 thành phần môi trường nuôi cấy (Yeast extract, Glucose, Peptone và Tween 80) đến khả năng ức chế Edwardsiella ictaluri của vi khuẩn Lactobacillus spp.
b. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 lần lặp lại.
- Nhân tố thí nghiệm: 1 nhân tố (nồng độ từng thành phần môi trường thêm vào). - Số đơn vị thí nghiệm: (2 (số dòng Lactobacillus spp.chọn làm thí nghiệm) x 3 ( nồng độ từng thành phần) x 4 (4 thành phần thêm vào) + 2 (đối chứng: MRS không thêm thành phần nào của từng dòng vi khuẩn)) x 2 lần lặp lại = 52
Sơ đồ thực hiện thí nghiệm:
Lactobacillus spp. (có khả năng sinh bacteriocin)
Nuôi trong môi trường lỏng MRS với thành phần được biến đổi (ở điều kiện kỵ khí trong 48 giờ, ở 300
C)
Ly tâm lấy phần dịch trong
(ly tâm 10.000 vòng/phút, trong 5 phút ở 40C)
Điều chỉnh đến pH 6,5 bằng NaOH 1M
Kiểm tra khả năng ức chế kháng khuẩn
c. Thực hiện thí nghiệm:
Dòng vi khuẩn Lactobacillus spp. có khả năng ức chế loài vi khuẩn gây bệnh trên khi được kiểm tra bằng phương pháp well diffusion agar mạnh nhất sẽ được chọn để khảo
Trong thí nghiệm này chọn loài vi khuẩn gây bệnh trên làm loài chỉ thị.
- Chuẩn bị môi trường MRS broth được biến đổi một số thành phần với hàm lượng như sau: yeast extract (0; 1; 2; 3% w/v), peptone (0; 1; 2; 3% w/v), glucose (0; 1; 2; 3% w/v), tween 80 (0; 1; 2; 3% w/v).
- Dòng vi khuẩn Lactobacillus spp. được tuyển chọn sẽ được nuôi trong các môi trường MRS broth được biến đổi như trên trong 48 giờ ở 300C ở điều kiện kị khí tĩnh.
- Ly tâm thu nhận bacteriocin thô. Trữ các eppendorf (trong tủ lạnh ở 4 0C) chứa bacteriocin thô.
Bacteriocin thô thu được sẽ được đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh gan thân mủ bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch (well diffusion agar) từ đó chọn ra môi trường nuôi cấy để vi khuẩn Lactobacillus spp. có khả năng ức chế vi khuẩn E. ictaluri cao.
CHƢƠNG IV KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1 Phân lập và nhận diện các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc thuộc giống
Lactobacillus
4.1.1 Phân lập vi khuẩn từ dạ dày và ruột cá tra và cá trê
Mười bảy (17) dòng vi khuẩn đã được phân lập tách ròng trên môi trường MRS agar từ dạ dày và ruột cá tra và cá trê thu được từ 3 mô hình nuôi (quản canh, bán thâm canh, thâm canh) và tại các chợ và hộ gia đình khác nhau thuộc 2 tỉnh Đồng Tháp và Vĩnh Long (Bảng 7).
Bảng 6. Các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc từ cá tra và cá trê ở 2 tỉnh Đồng Tháp và Vĩnh Long
Stt Dòng lập từ Phân
Mô hình nuôi
Địa điểm thu
mẩu Nuôi bằng thức ăn
Quản canh Bán thâm canh Thâm canh Thu tại chợ
1 CT1-TB1 Cá trê + Tam Bình Công nghiệp
2 CT1-TB2 Cá trê + Tam Bình Công nghiệp
3 CT1-TB3 Cá trê + Tam Bình Công nghiệp
4 CT1-TB6 Cá trê + Tam Bình Công nghiệp
5 CT1-TB9 Cá trê + Tam Bình Công nghiệp
6 CT2-TB4 Cá trê + Tam Bình Tạp
7 CT2-TB7 Cá trê + Tam bình Tạp
8 CT2-TB11 Cá trê + Tam Bình Tạp
9 CT2-TB14 Cá trê + Tam Bình Tạp
10 CT2-TB18 Cá trê + Tam Bình Tạp
11 CT3-TB8 Cá trê + Tam Bình Công nghiệp
12 CTR1-LV1 Cá tra + Lấp Vò Công nghiệp
13 CTR1-LV3 Cá tra + Lấp Vò Công nghiệp
14 CTR1-LV4 Cá tra + Lấp Vò Công nghiệp
15 CTR1-LV6 Cá tra + Lấp Vò Bổ sung probiotic
16 CTR1-LV8 Cá tra + Lấp Vò Bổ sung probiotic
17 CTR1-LV9 Cá tra + Lấp Vò Bổ sung probiotic
Ghi chú: (+) mô hình nuôi mà cá được thu mẫu.Tên dòng vi khuẩn được đặt tên theo nguyên tắc: Loài cá phân lập + địa điểm thu mẫu, CT là cá trê, CTR là cá tra, TB là mẫu được thu ở Tam Bình, LV là mẫu được thu ở Lấp Vò.
Trong tổng số 17 dòng vi khuẩn phân lập được có 6 dòng được phân lập từ cá tra (chiếm 35,3 %), 11 dòng được phân lập từ cá trê (chiếm 64,7 %).
Trong số 6 dòng vi khuẩn phân lập từ cá tra: 3 dòng (chiếm 50%) được phân lập từ mô hình nuôi thâm canh chỉ cho cá ăn thức ăn thức ăn công nghiệp mà không bổ sung
chế phẩm probiotic. 3 dòng (chiếm 50 %) được phân lập từ mô hình nuôi bán thâm canh cho cá ăn thức ăn công nghiệp có bổ sung chế phẩm probiotic.
Có 11 dòng vi khuẩn được phân lập từ cá trê. Trong đó có 3 (chiếm 27,3 %) dòng được phân lập từ cá trê nuôi theo mô hình quản canh và 2 dòng (chiếm 18,2 %) phân lập