Nghiên cứu đa dạng kiểu nhân ở tỏi cô đơn(alliumsativum) trên đảo lý sơn, tỉnh quảng ngãi

... đơn, tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Nghiên cứu đa dạng kiểu nhân tỏi cô đơn (Allium sativum) đảo Lý Sơn, tỉnh Quảng Ngãi ” Mục tiêu đề tài - Khảo sát tìm phương pháp làm tiêu kiểu nhân tối ưu -... thái tỏi cô đơn tỏi nhiều tép đảo Lý Sơn - Phân tích kiểu nhân, kiểm tra độ đa dạng kiểu nhân tỏi cô đơn tỏi nhiều tép đảo Lý Sơn Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học - Nghiên cứu. .. quan tài liệu tỏi cô đơn tỏi nhiều tép đảo Lý Sơn - Khảo sát tìm phương pháp làm tiêu kiểu nhân tối ưu - Nghiên cứu đặc điểm hình thái tỏi cô đơn tỏi nhiều tép - Xây dựng kiểu nhân, nhân đồ (karyogram),

LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả Bùi Thị Minh Hòa i LỜI CÁM ƠN Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp của mình, tôi xin chân thành cám ơn tất cả các thầy cô giáo Khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng đã tận tình dạy dỗ, truyền đạt những tri thức và kinh nghiệm quý báu cho tôi. Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS. Trương Thị Thanh Mai đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu làm luận văn. Xin gửi lời cám ơn đến gia đình, bạn bè những người đã luôn động viên, đóng góp những ý kiến quý báu cho tôi. Đà Nẵng, tháng 5 năm 2013 Sinh viên Bùi Thị Minh Hòa ii MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU .............................................................................................................. i 1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................... 1 2. Mục tiêu đề tài .................................................................................................. 2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .................................................................2 3.1. Ý nghĩa khoa học ...................................................................................................2 3.2. Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................... 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................... 3 1.1. Sơ lược về cây tỏi ...................................................................................................3 1.2. Tình hình nghiên cứu .............................................................................................4 1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ............................................................. 4 1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ............................................................. 5 1.3. Một số khái niệm....................................................................................................6 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............. 8 2.1. Đối tương nghiên cứu ............................................................................................8 2.2. Thời gian nghiên cứu .............................................................................................8 2.3. Địa điểm nghiên cứu ..............................................................................................9 2.4. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................9 2.4.1. Phương pháp nghiên cứu NST ...........................................................................9 2.4.2. Phương pháp nghiên cứu hình thái ................................................................ 10 2.4.3. Phương pháp xây dựng kiểu nhân .................................................................. 11 2.4.4. Phương pháp xử lí số liệu ................................................................................ 12 CHƢƠNG 3: NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .......................... 13 3.1. Kết quả khảo sát các công thức làm tiêu bản kiểu nhân (karyotype) .............. 13 3.2. Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái tỏi cô đơn và tỏi nhiều tép Lý Sơn. .. 15 3.2.1. Tỏi cô đơn......................................................................................................... 15 3.2.2. Tỏi nhiều tép..................................................................................................... 15 3.3. Kết quả phân tích kiểu nhân ở tỏi Lý Sơn ......................................................... 17 iii 3.3.1. Kết quả phân tích kiểu nhân tỏi cô đơn .......................................................... 17 3.3.2. Kết quả phân tích kiểu nhân (karyotype) tỏi nhiều tép.............................28 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................. 31 4.1. Kết luận ................................................................................................................ 31 4.2. Kiến nghị ............................................................................................................. 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 33 iv DANH MỤC BẢNG Số hiệu Tên bảng Trang 3.1 Kết quả khảo sát các cách tiền cố định bằng 8-hydroxyquinon 13 3.2 Kết quả khảo sát nồng độ dung dịch HCl thủy phân mẫu 13 3.3 Các thông số hình thái dạng tam bội tỏi cô đơn trên mẫu rễ 18 3.4 Các thông số hình thái NST dạng tứ bội tỏi cô đơn trên mẫu 20 bảng rễ 3.5 Các thông số hình thái NST dạng tứ bội tỏi cô đơn trên callus 22 mới phát sinh 3.6 Các thông số hình thái NST dạng tứ bội tỏi cô đơn trên callus 24 qua cấy chuyển nhiều lần 3.7 Các thông số hình thái NST dạng ngũ bội tỏi cô đơn trên 25 callus qua cấy chuyển nhiều lần 3.8 Các thông số hình thái NST dạng lưỡng bội tỏi nhiều tép v 28 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ Tên biểu đồ Trang 3.1 Idiogram của dạng tam bội tỏi cô đơn trên mẫu rễ 19 3.2 Idiogram dạng tứ bội tỏi cô đơn trên mẫu rễ 20 3.3 Idiogram dạng tứ bội tỏi cô đơn trên callus mới phát sinh 22 3.4 Idiogram dạng tứ bội tỏi cô đơn trên callus qua cấy chuyển 24 nhiều lần 3.5 Idiogram dạng ngũ bội tỏi cô đơn trên callus qua cấy 26 chuyển nhiều lần 3.6 Idiogram dạng lưỡng bội tỏi nhiều tép vi 28 DANH MỤC HÌNH ẢNH Số hiệu Tên hình vẽ hình Trang vẽ 2.1 Mẫu rễ tỏi cô đơn 8 2.2 Mẫu callus mới phát sinh 8 2.3 Mẫu callus cấy chuyển nhiều lần 8 3.1 Hình thái ngoài tỏi cô đơn 15 3.2 Hình thái ngoài tỏi nhiều tép 16 3.3 Rễ tỏi cô đơn 17 3.4 Rễ tỏi nhiều tép 17 3.5 Bộ NST tam bội ở mẫu rễ 18 3.6 Karyogram dạng tam bội tỏi cô đơn trên mẫu rễ 19 3.7 Bộ NST tứ bội ở mẫu rễ 19 3.8 Karyogram dạng tứ bội tỏi cô đơn trên mẫu rễ 21 3.9 Bộ NST tứ bội tỏi cô đơn trên callus mới phát sinh 22 3.10 Karyogram dạng tứ bội tỏi cô đơn trên callus mới phát sinh 23 3.11 Bộ NST tứ bội ở callus cấy chuyển nhiều lần 23 3.12 Karyogram dạng tứ bội tỏi cô đơn trên callus qua cấy chuyển 25 nhiều lần 3.13 Bộ NST ngũ bội ở callus cấy chuyển nhiều lần 25 3.14 Karyogram dạng ngũ bội tỏi cô đơn trên callus qua cấy 26 chuyển nhiều lần 3.15 Bộ NST thập bội ở callus cấy chuyển nhiều lần vii 27 3.16 Bộ NST dạng lưỡng bội tỏi nhiều tép 27 3.17 Karyogram bộ lưỡng bội tỏi nhiều tép 29 viii MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Lý Sơn – một hòn đảo nổi tiếng của Việt Nam với điều kiện thiên nhiên vô cùng khắc nghiệt: đất chủ yếu là đất cát biển xâm thực và đất bazan do hoạt động của núi lửa; khí hậu thì khô hạn vào mùa nắng, giông, bão vào mùa mưa. Tuy nhiên, chính điều đó lại tạo điều kiện thuận lợi để nông dân vận dụng trồng tỏi. Tỏi Lý Sơn đã trở thành thương hiệu tỏi của Việt Nam, đặc biệt là tỏi cô đơn. Theo nông dân trồng tỏi, sau khi gieo tỏi giống sẽ thu được củ tỏi với nhiều tép. Tuy nhiên trên 1ha đất trồng tỏi có thể thu được 1 – 2 kg tỏi đặc biệt, củ tỏi chỉ có 1 tép lớn hơn tép tỏi bình thường, gọi là tỏi cô đơn. Theo người dân đảo cũng như các thực khách thì tỏi Lý Sơn đặc biệt là tỏi cô đơn có hương vị thơm ngon và hoạt tính hơn hẳn các loại tỏi khác. Tỏi có chứa nhiều hợp chất sinh học quý như allicin, ajoen, dialyl disulfid, các saponin [12], steroid, flavonoid, axit amin, chất béo, đường khử, polysacharid, sterol và tinh dầu [1] trong đó tỏi Lý Sơn chứa hàm lượng allicin cao hơn so với tỏi ta và tỏi Trung Quốc [1]. Chính nhờ những hoạt chất đó nên tỏi không chỉ được dùng làm gia vị mà còn là một loại dược liệu được hầu hết các nước trên thế giới sử dụng để chữa một số nhóm bệnh như: bệnh thấp khớp, tim mạch, phế quản, tiêu hóa, bệnh trĩ, bệnh đái tháo đường [10].Ngoài ra, tỏi còn có vai trò kháng một số loại vi trùng như Staphylloccocus, thương hàn, lỵ amip, trực khuẩn bạch hầu [6]. Ngày nay tỏi còn được chú ý đến trong khả năng ức chế ung thư do tỏi chứa phong phú của các hợp chất hóa học được hữu ích trong phòng và điều trị các loại ung thư khác nhau, đặc biệt, allicin - một hợp chất có antithrombotic, chống oxy hóa, và các hoạt tính chống ung thư. Allicin có thể thâm nhập rất nhanh vào các khoang khác nhau của tế bàovà hoàn toàn được chuyển hóa ở gan. Nghiên cứu thực nghiệm cung cấp bằng chứng thuyết phục rằng tỏi với thành phần chứa lưu huỳnh hữu cơ allyl là chất ức chế hiệu quả sự tăng trưởng của khối u [5]. 1 Đối với tỏi Lý Sơn, bên cạnh việc có hương vị thơm ngon hơn so với tỏi ta hay tỏi Trung Quốc, hoạt tính sinh học của tỏi cũng hơn hẳn, đặc biệt là hàm lượng allicin. Vì vậy, tỏi trở thành một loài thực vật hữu ích cho con người. Tuy nhiên các nghiên cứu về tỏi còn khá ít, chủ yếu là các nghiên cứu về hình thái học, sinh thái học, kĩ thuật canh tác, các bài thuốc chữa bệnh từ tỏi… Riêng đối với tỏi cô đơn Lý Sơn mặc dù chứa hoạt tính cao, được người tiêu dùng yêu thích, giá thành khá đắt nhưng hầu như chưa được quan tâm nghiên cứu. Do đó, để góp thêm nguồn tư liệu khoa học về tỏi Lý Sơn, đặc biệt là tỏi cô đơn, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Nghiên cứu đa dạng kiểu nhân ở tỏi cô đơn (Allium sativum) trên đảo Lý Sơn, tỉnh Quảng Ngãi ”. 2. Mục tiêu đề tài - Khảo sát tìm ra phương pháp làm tiêu bản kiểu nhân tối ưu. - Phân tích tổng hợp những tư liệu mô tả hình thái tỏi cô đơn và tỏi nhiều tép của đảo Lý Sơn. - Phân tích kiểu nhân, kiểm tra độ đa dạng kiểu nhân ở tỏi cô đơn và tỏi nhiều tép của đảo Lý Sơn. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học - Nghiên cứu tổng quan tài liệu về tỏi cô đơn và tỏi nhiều tép của đảo Lý Sơn. - Khảo sát tìm ra phương pháp làm tiêu bản kiểu nhân tối ưu. - Nghiên cứu đặc điểm hình thái của tỏi cô đơn và tỏi nhiều tép. - Xây dựng kiểu nhân, nhân đồ (karyogram), NST đồ (idiogram), xác định công thức kiểu nhân và phân tích sự đa dạng kiểu nhân của tỏi cô đơn và tỏi nhiều tép. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả của đề tài góp thêm nguồn tư liệu khoa học về tỏi Lý Sơn, đặc biệt là tỏi cô đơn. 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Sơ lƣợc về cây tỏi Tỏi có tên khoa học là Allium sativum, thuộc chi Hành (Allium), họ Hành (Alliacae). Tỏi là một loại địa thực vật cao khoảng 30-60 cm; hành tròn, to 2-4 cm; cầu hành có bao trắng; lá dẹp, dài 40-60 cm, rộng 1,2 cm [4]. Theo Đỗ Tất Lợi cho rằng trong thành phần của tỏi có chứa một ít iot và tinh dầu. Tuy nhiên, thành phần chính của tỏi là một chất kháng sinh allicin C6H10OS2 có tác dụng diệt vi khuẩn rất mạnh. Theo ông, trong tỏi không chứa allicin mà chỉ có chất alliin, khi chất này chịu tác dụng của enzim alinaza (có trong tỏi) và tiếp xúc với không khí thì hình thành allicin. Dung dịch allicin với nồng độ 1/85.000-1/25.000 có thể ức chế sinh trưởng các trùng Staphylococcus, Streptococcus, trùng thương hàn,trực trùng lỵ [6]. Trong dịch chiết tỏi có hơn 100 loại hợp chất chứa lưu huỳnh có giá trị trong y học, tiêu biểu là N-aceryl-S-allyl cysteine, allyl mercaptan, diallyl disulfide, diallyl sulfide, diallyl sulfoxide, diallyl sulfone, và allyl methyl sulfide… Trong đó hợp chất allicin có vai trò quan trọng trong ức chế quá trình nhân lên của tế bào ung thư và điều hoà apoptosis [16]. Một vài nghiên cứu cho thấy trong 3 loại tỏi: tỏi ta, tỏi Trung Quốc và tỏi Lý Sơn đều có các nhóm hoạt chất gồm: saponin steroid, flavonoid, axit amin, chất béo, đường khử, polysacharid, sterol và tinh dầu [1] trong đó tỏi Lý Sơn chứa hàm lượng allicin cao hơn so với tỏi ta và tỏi Trung Quốc [1]. Có sự khác biệt này có thể là do điều kiện thời tiết, đất đai, do quy trình và kinh nghiệm trồng tỏi từ lâu đời của người dân Lý Sơn. Thời vụ trồng tỏi Lý Sơn hằng năm bắt đầu từ tháng 9 đến tháng 10. Tuy nhiên, từ trước đó nhiều tháng người dân đảo Lý Sơn đã xuống biển lấy cát san hô lên để phục vụ việc gieo trồng. Trước tiên, lớp cát san hô cũ được cào sang một bên, sau đó buồi một lớp đất đỏ bazan dày khoảng 1-2cm (đất đỏ này được lấy từ trên núi hoặc đào dưới hầm) đầm chặt rồi bón phân lót. Lớp đất san hô mới được lấy lên từ dưới biển sẽ được phơi khô rồi phủ lên bề mặt lớp đất và phân lón vừa xử lý. Sau đó, người dân tiến 3 hành găm đứng tép tỏi, phủ nhẹ một lớp cát mỏng, tránh tép tỏi tiếp xúc với phân bón lót. Mât độ trồng: Hàng x hàng: 14-15 cm; Cây x Cây: 6 - 7 cm. 1.2. Tình hình nghiên cứu 1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Trên thế giới có khá nhiều các nghiên cứu về hoạt chất và tác dụng của tỏi: Năm 2008, một kết quả nghiên cứu được công bố cho rằng tỏi có tác dụng làm giảm nguy cơ xơ vữa động mạch do các hợp chất có chứa lưu huỳnh của tỏi có tác dụng phân giải cholesterol, triglyceride trong huyết thanh làm giảm lipit máu [24]. Năm 2009, một bài tổng hợp khoa học đã cho rằng tỏi là một tác nhân hiệu quả trong chống ung thư, chống oxi hóa, chống vi khuẩn, kích thích miễn dịch cơ thể [17]. Trong thành phần của tỏi chứa ~ 2% protein trên trọng lượng tươi, các protein chính hiện diện trong củ là agglutinins (25 kD; ASA25) và alliinase (110 kD) [21]. Ngoài các protein này, trong tỏi còn hiện diện các protein khác như cao phân tử agglutinin glycoprotein (110 kD; ASA110) [20], protein kháng nấm, allivin (13 kD) [27], và protein chống vi khuẩn, alliumin (13 kD) [28]. Hiệu quả của toàn bộ các chất chiết xuất từ tỏi và ASA110 đã được nghiên cứu trên tế bào lympho T [19]. Năm 2011, một nghiên cứu khác chứng minh được rằng: Sử dụng tỏi bổ sung với thuốc trị đái tháo đường giúp cải thiện kiểm soát đường huyết ở bệnh nhân tiểu đường type 2 [25]. Năm 2009, các nhà khoa học Hàn Quốc đã nghiên cứu nhân giống vô tính thông qua tái sinh in vitro cây tỏi thành công [26]. Đối với nghiên cứu kiểu nhân của các loại thực vật thuộc chi Hành tỏi trên thế giới đã có nhiều công trình như: + Nghiên cứu của Konvicka. O và Albert Levan năm 1972 về bộ NST ở tỏi (Allium sativum): nghiên cứu về bộ NST của 4 chủng tỏi thuộc 2 dạng hình thái khác nhau trong đó có 3 chủng loại H và 1 chủng loại U. Mục tiêu của 4 nghiên cứu này là xác định cách li di truyền đã gây nên sự tích lũy các NST khác biệt giữa các dòng vô tính [22]. + Nghiên cứu của Deniz Yuzbasioglu và Fatma Unal về kiểu nhân ở tỏi (Allium sativum.L) được trồng phổ biến tại Thổ Nhĩ Kỳ: nghiên cứu này sử dụng tế bào mô phân sinh ở đỉnh rễ trong nguyên phân để phân tích số lượng NST, chiều dài thực tế của từng NST, tỉ lệ cánh…thông qua đó thiết lập bộ kiểu nhân cho tế bào [17]. + Một nghiên cứu khác của R Paknia và G Karimzadeh về đa dạng kiểu nhân của một số quần thể hành bản địa ở Iran: Dựa vào các tế bào mô phân sinh đang tiến hành nguyên phân để đo tổng chiều dài NST (TL), cánh dài (L), cánh ngắn (S), chiều dài tương đối NST (RL), tỉ lệ cánh (AR). Hiển thị các công thức nhiễm sắc thể 8m (hai quần thể), 7m1sm (tám quần thể) và 6m2sm (hai quần thể) [18]. 1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam Năm 2010, nghiên cứu của hai tác giả Phạm Thị Minh Phương và Yosuke Tashiro cho thấy tỏi có số lượng NST là 2n=16 [9]. Riêng đối với tỏi Lý Sơn, theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Minh Chính cho thấy: trong 3 loại tỏi (tỏi Lý Sơn, tỏi ta và tỏi Trung Quốc) đều có các nhóm hoạt chất gồm: saponin steroid, flavonoid, axit amin, chất béo, đường khử, polysacharid, sterol và tinh dầu. Bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector PDA đã xác định được hàm lượng allicin trong tỏi Lý Sơn, tỏi ta và tỏi Trung Quốc lần lượt là 0,767%, 0,712% và 0,670% [10]. Trong lĩnh vực y dược kết quả nghiên cứu của Nguyễn Lĩnh Toàn (2011) cho thấy dịch chiết tỏi Lý Sơn ở nồng độ 5-10mg/l ức chế phát triển tế bào ung thư tuyến tiền liệt người dòng PC-3 trên in vitro [15]. Hiện nay, ở Việt Nam, vấn đề nghiên cứu kiểu nhân và sự đa dạng kiểu nhân cũng được thực hiện trên một vài đối tượng động, thực vật và người. Ở đối tượng động vật có nghiên cứu của Ngô Giang Liên (ĐH KHTN, ĐH QGHN) và Phạm Thị Khoa (Viện sốt rét, Ký sinh trùng, Côn trùng Hà Nội) về đặc điểm kiểu nhân của loài Anopheles. dirus ở đảo Hải Nam, Trung Quốc bằng cách sử dụng phương pháp phân tích NST trong kì giữa nguyên phân của 5 Baimai (1984), tiêu bản NST sau khi giữ ấm 370C trong 24h được nhuộm bằng Giêm sa [5]. Nghiên cứu của Tô Cao Ly và Dương Thu Hương (2004) về kiểu nhân của 2 đối tượng lợn Đại Mạch, lợn Móng Cái và con lai F1 của 2 giống này bằng phương pháp nhuộm Band G để xác định cơ sở di truyền tế bào trong lai tạo giống vật nuôi [7]. Ở Việt Nam kĩ thuật karyotype còn đang được nghiên cứu và bước đầu ứng dụng để chuẩn đoán cho thai nhi. Điển hình có: nghiên cứu của Phùng Như Toàn (2004), “ Khảo sát Karyotype thai nhi qua nuôi cấy tế bào ối trong chẩn đoán trước sinh” [14], cùng với nghiên cứu của Đặng Thị Nhâm (2011), “ Phân tích bộ nhiễm sắt thể (Karyotype) ở những cặp vợ chồng sẩy thai liên tiếp và con bị dị tật bẩm sinh ” bằng cách phối hợp nhiều phương pháp khác nhau như: nuôi cấy tế bào bạch cầu lympho máu ngoại vi của Hungerford D.A. (1965), phương pháp nhuộm băng theo Seabright M (1971), phương pháp phân tích nhiễm sắc thể và lập karyotype: theo tiêu chuẩn ISCN (2005) [8]. Trên đối tượng thực vật có nghiên cứu của Vũ Thị Hạnh (2001) về kiểu nhân của một số loài trong chi Ráy (Alocasia) và chi Khoai môn (Colocasia), nghiên cứu của Võ Thị Kim Diệp (2007) “ Đa dạng kiểu nhân của một số loài trong chi Hành ” [2]. Tuy nhiên, cho đến nay tại Việt Nam vẫn chưa có một nghiên cứu nào về mặt di truyền đối với tỏi Lý Sơn. 1.3. Một số khái niệm Với vấn đề nghiên cứu kiểu nhân (karyotype) thì ở nước ta các khái niệm về kiểu nhân, nhân đồ, NST đồ cũng đã được định nghĩa trong một số tài liệu như: Di truyền học, Phân loại thực vật học… Theo định nghĩa của Di truyền học thì kiểu nhân (karyotype) là tập hợp tất cả các thể nhiễm sắc ở trung kỳ (kì giữa) phân chia của một tế bào và ở hầu hết các sinh vật các tế bào có cùng một kiểu nhân [3]. Trong Phân loại thực vật học kiểu nhân (karyotype) là tập hợp tất cả các đặc tính số lượng, chất lượng của bộ NST (Số lượng, kích thước, hình thái và 6 cấu trúc NST). Nhân đồ (karyogram) là hình ảnh cụ thể của chính bộ NST được sắp xếp theo một thứ tự nhất định từng đôi tương đồng một từ NST tâm giữa, tâm lệch đến tâm mút. Nhiễm sắc thể đồ (idiogram) là dựa vào nhân đồ rồi mô hình hóa lên bằng các đường thẳng có chiều dài, chiều rộng cũng như vị trí tâm động tương ứng với NST thực như trên nhân đồ [13]. 7 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣơng nghiên cứu Tỏi Lý Sơn (Allium sativum) tại đảo Lý Sơn, tỉnh Quảng Ngãi thuộc chi Hành (Allium), họ Hành (Alliaceae). Trong nghiên cứu sử dụng 2 dạng tỏi Lý Sơn bao gồm: Tỏi cô đơn và tỏi nhiều tép. Riêng đối với tỏi cô đơn sử dụng trong phân tích bao gồm 2 loại mẫu: mẫu rễ thu được trong điều kiện trồng tự nhiên và mẫu callus đang nuôi cấy tại phòng Công nghệ sinh học, trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng. Hình 2.1. Mẫu rễ tỏi cô đơn Hình 2.2. Mẫu callus mới phát sinh Hình 2.3. Mẫu callus cấy chuyển nhiều lần 2.2. Thời gian nghiên cứu Đề tài được tiến hành từ tháng 11/2012 đến 5/2013. 8 2.3. Địa điểm nghiên cứu Phân tích NST được tiến hành tại phòng thí nghiệm bộ môn Di truyền Khoa Sinh – Môi Trường, trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng. 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp nghiên cứu NST a. Cách xử lý mẫu - Mẫu rễ + Thu rễ: Trồng trên đất cát ẩm khoảng 2-3 ngày đến khi rễ ra dài khoảng 2 cm, cắt lấy đoạn đầu rễ dài 1-1,5 cm, rửa sạch, thấm khô, chuyển vào dung dịch tiền cố định. + Tiền cố định: Tiền cố định bằng 8-hydroxyquinoline 0,002M theo các cách:  Cách 1: 2h ở nhiệt độ phòng và chuyển vào tủ lạnh trong 3h.  Cách 2: 3h ở nhiệt độ phòng và chuyển vào tủ lạnh trong 2h.  Cách 3: 5h ở nhiệt độ phòng  Cách 4: 3h ở nhiệt độ phòng  Cách 5: 5h trong tủ lạnh  Cách 6: 3h trong tủ lạnh + Cố định:  Lấy rễ từ dung dịch tiền cố định, rửa sạch bằng nước cất thấm khô.  Chuyển vào dung dịch cố định Carnua (3:1), để qua ít nhất 1 đêm mới sử dụng. + Làm mềm rễ  Rễ đem ra rửa sạch trong nước cất, ngâm trong vài phút, sau đó thấm khô, làm mềm trong dung dịch HCl trong 10 phút ở 60oC trong nồi cách thủy. Dung dịch HCl được thử nghiệm với các nồng độ 1N; 1,5N; 2N. + Nhuộm NST 9  Rễ đã làm mềm rửa nhanh qua nước cất, thấm khô và nhuộm trong dung dịch Schiff trong 30-40 phút.  Nhuộm phụ rễ trong dung dịch Carmin acetic từ 5-10 phút. - Mẫu callus Xử lí mẫu callus cũng được tiến hành tương tự như trong xử lí mẫu rễ b. Làm tiêu bản NST - Mẫu rễ + Dùng panh lấy rễ đã nhuộm đặt lên lam kính sạch, dung dao lam cắt lấy phần chóp rễ bắt màu đậm. + Nhỏ một giọt dung dịch acetic 45% lên lát cắt mẫu và đậy lamen. + Hơ nóng nhẹ lam kính lên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi mẫu chuyển sang màu đỏ. + Đặt lam kính lên trên mặt phẳng dùng đầu bút chì gõ nhẹ và thẳng đứng lên trên lamen để dàn mỏng mẫu. - Mẫu callus + Dùng kim mũi mác lấy nhẹ một ít phần callus bên ngoài bắt màu đậm đặt lên lam kính sạch rồi nhỏ một giọt dung dịch acetic 45% lên lát cắt mẫu và đậy lamen. Hơ nóng nhẹ lam kính lên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi mẫu chuyển sang màu đỏ, dàn mỏng mẫu và tiến hành quan sát. c. Quan sát và đếm số lượng NST Tiêu bản được quan sát trên kính hiển vi ở độ bội giác x100 d. Chụp ảnh tiêu bản NST - Các tế bào phân chia kì giữa có hình thái NST rõ ràng, tách rời nhau sẽ được dùng để chụp ảnh phân tích kiểu nhân. - Sử dụng máy ảnh Olympus 16.0 và máy ảnh Canon 14.0 với độ phóng đại 5.0 kết hợp với kính hiển vi tại phòng thí nghiệm Di truyền ĐHSP ĐN. 2.4.2. Phương pháp nghiên cứu hình thái - Kích thước căn (cm) + Đo đường kính căn 10 - Kích thước lá + Đo chiều dài thân và lá (cm) - Số lượng căn và dạng căn + Đếm số lượng căn + Dạng căn: hình cầu, hình chóp,… 2.4.3. Phương pháp xây dựng kiểu nhân a. Đo NST để thu thập số liệu về hình thái NST - Các NST được đo trực tiếp bằng compa kĩ thuật trên ảnh chụp NST đã phóng đại, các phép đo đối với mỗi NST về chiều dài cánh: cánh dài (p), cánh ngắn (q) và thể kèm (Ls) được minh họa theo hình vẽ dưới. Tâm động q p Ls - Chiều dài trung bình của mỗi NST được xác định như là số liệu trung bình đối với tất cả tế bào đã phân tích. - Chiều dài thể kèm được xác định không bao gồm khoảng cách giữa đầu mút cánh đến thể kèm. - Tỉ lệ cánh được xác định theo công thức sau: Chiều dài cánh dài NST Tỉ lệ cánh (R) = p = Chiều dài cánh ngắn NST q b. Phân loại NST Phân loại hình thái dựa vào vị trí tâm động và tỉ lệ cánh (R) Phân loại NST được tiến hành theo Levan (1964), cho trên bảng sau: Vị trí tâm động Tỉ lệ cánh (R) Phân loại NST Vùng chính giữa 1 M: Tâm cân Vùng giữa 1,1 – 1,7 m: Tâm cân 11 Vùng gần giữa 1,7 – 3 Sm: Tâm lệch giữa Vùng gần tận 3,1 – 7 St: Tâm lệch mút Vùng tận >7 T: Tâm mút c. Thiết lập Nhân đồ (Karyogram) và NST đồ (Idiogram) Nhân đồ và NST đồ được xây dựng trên số lượng, hình thái NST và số đo chiều dài tương đối, tỉ lệ cánh. Các cặp NST trong Karyogram và Idiogram được sắp xếp theo giá trị tăng dần về chiều dài trung bình NST. 2.4.4. Phương pháp xử lí số liệu Xử lí các số liệu hình thái NST được tính toán thống kê và vẽ biểu đồ bằng chương trình Excel 2007, phần mềm Photoshop CS 5.0 thực hiện trên máy vi tính. 12 CHƢƠNG 3: NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Kết quả khảo sát các công thức làm tiêu bản kiểu nhân (karyotype) Kết quả khảo sát các cách tiền cố định bằng dung dịch 8-hydroxyquinon và kết quả khảo sát các nồng độ HCl giai đoạn thủy phân mẫu thể hiện lần lượt trên 2 bảng 3.1 và 3.2. Bảng 3.1. Kết quả khảo sát các cách tiền cố định bằng 8-hydroxyquinon Cách Tiền cố định Kết quả khảo sát bằng 8-hydroxyquinon 0,002M Đánh giá kết quả 1 2h nhiệt độ phòng + 3h trong tủ lạnh NST bắt màu tốt, hình thái NST rõ rang ++ 2 3h nhiệt độ phòng + 2h trong tủ lạnh NST bắt màu tốt, hình thái NST rõ rang +++ 3 5h nhiệt độ phòng NST bắt màu kém, hình thái NST không rõ rang 4 5h trong tủ lạnh NST bắt màu tốt, hình thái NST rõ ràng 5 3h nhiệt độ phòng NST bắt màu kém, hình thái NST không rõ - 6 3h trong tủ lạnh NST bắt màu kém, hình thái NST không rõ - ++ Bảng 3.2. Kết quả khảo sát nồng độ dung dịch HCl thủy phân mẫu Cách 1 Thủy phân mẫu Kết quả khảo sát bằng dung dịch HCl HCl 1N Bắt màu tốt NST tách rời tốt, tiêu bản tốt, khi dàn mỏng các tế bào nằm trên 1 mặt phẳng  dễ quan sát 13 Đánh giá kết quả +++ 2 HCl 1,5N Bắt màu tốt hơn ở HCl 1N ++ NST tách rời tốt hơn ở HCl 1N Tiêu bản không tốt, khi dàn mỏng các tế bào bị biến dạng, kết dính hoặc chồng lớp lên nhau  khó quan sát 3 HCl 2N Bắt màu tốt hơn ở HCl 1N + Tiêu bản không tốt, khi dàn mỏng các tế bào bị biến dạng, kết dính hoặc chồng lớp lên nhau  khó quan sát Chú thích: (-): Xấu (+): Trung bình (++): Tốt (+++): Rất tốt Trong giai đoạn tiền cố định, kết quả khảo sát cho thấy xử lý bằng dung dịch 8 – hydroxyquinon 0,002M trong 3h nhiệt độ phòng và 2h tiếp theo trong tủ lạnh cho mẫu tiêu bản kiểu nhân tốt nhất (hình thái NST rõ và bắt màu tốt nhất). Như vậy, trong giai đoạn này thời gian ngâm mẫu trong dung dịch tiền cố định và nhiệt độ xử lý có ảnh hưởng khá rõ rệt đến độ bắt màu và hình thái NST. Trong giai đoạn thủy phân mẫu, kết quả khảo sát cho thấy khi xử lý mẫu bằng dung dịch HCl ở 3 nồng độ 1N, 1,5N, 2N thì tại nồng độ HCl 1N cho tiêu bản kiểu nhân tốt nhất (các chiếc NST tách rời tốt nhất). Kết quả này đúng với phương pháp làm tiêu bản kiểu nhân được trình bày trong quyển Thực hành tế bào thực vật của Pause Z. P. (1974) [23]. Kết quả này cho thấy nồng độ dung dịch HCl có ảnh hưởng quan trọng đến khả năng tách rời các chiếc NST và độ bền của tế bào thực vật. 14 3.2. Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái tỏi cô đơn và tỏi nhiều tép Lý Sơn. 3.2.1. Tỏi cô đơn Tỏi cô đơn thuộc dạng cây thân thảo, kích thước trung bình từ 24 – 35 cm, lá dẹt màu xanh nhạt, chiều dài lá trung bình từ 20 – 30 cm. Căn bình dạng cầu chóp nhọn đường kính khoảng từ 0,8 – 1,5 cm, màu trắng đục và chỉ có 1 tép. Phần bẹ lá màu xanh nhạt. Hiếm khi có hoa. Hình 3.1. Hình thái ngoài tỏi cô đơn 3.2.2. Tỏi nhiều tép Tỏi nhiều tép thuộc dạng cây thân thảo, kích thước trung bình từ 20 – 30 cm, lá dẹt màu xanh nhạt, chiều dài lá trung bình từ 16 – 25 cm. Căn chia làm nhiều tép trung bình từ 6 – 15 tép màu trắng đục, đường kính trung bình từ 1,5 – 2,5 cm, các tép có hình dạng và kích thước khá đồng nhất, dạng tép suông thẳng đường kính trung bình của mỗi tép từ 0,3 – 0,6 cm. Phần bẹ lá màu xanh nhạt. Hiếm khi có hoa. 15 Hình 3.2. Hình thái ngoài tỏi nhiều tép Kết quả phân tích hình thái ngoài 2 dạng tỏi Lý Sơn: tỏi cô đơn và tỏi nhiều tép cùng 1 giống phát sinh nhưng lại có một số sai khác về hình thái như: dạng căn, số lượng tép, kích thước căn, kích thước thân và lá. Trong đó cho thấy tỏi cô đơn vượt trội hơn tỏi nhiều tép về tất cả các thông số hình thái phân tích. Đồng thời, trong quá trình trồng 2 dạng tỏi này phát hiện thấy tỏi cô đơn có khả năng sinh trưởng, sức sống tốt hơn so với tỏi nhiều tép thể hiện qua thời gian ra rễ, đường kính rễ, thời gian lên mầm, thời gian sinh trưởng đạt kích thước tối đa, dạng lá. Như vậy, tuy cùng một giống phát sinh nhưng ở 2 dạng tỏi này đã thể hiện sự khác biệt rõ rệt về hình thái ngoài và khả năng sinh trưởng. 16 Hình 3.3. Rễ tỏi cô đơn Hình 3.4. Rễ tỏi nhiều tép 3.3. Kết quả phân tích kiểu nhân ở tỏi Lý Sơn 3.3.1. Kết quả phân tích kiểu nhân tỏi cô đơn a. Mẫu rễ Phân tích hình thái NST được tiến hành trên ảnh chụp hiển vi tiêu bản NST kì giữa tế bào đỉnh rễ đã phóng đại lớn. Ảnh chụp phóng đại của ít nhất 3 tế bào đang phân chia ở kì giữa với hình thái NST rõ được dùng để phân tích NST để xác định công thức kiểu nhân.Số liệu về chiều dài tương đối của cánh dài, cánh ngắn, chiều dài trung bình NST, tỉ lệ cánh được trình bày trong bảng 3.3, 3.4. Nhân đồ (Karyogram) và NST đồ (Idiogram) của NST được vẽ dựa trên số liệu trung bình chiều dài tương đối của mỗi NST thể trên hình 3.5, 3.6 và biểu đồ 3.1, 3.2. Các NST được sắp xếp và đánh số theo sự tăng dần của chiều dài trung bình NST. Kết quả phân tích trên mẫu rễ cho thấy ở tỏi cô đơn tồn tại bộ NST gồm dạng tam bội và dạng tứ bội - Dạng tam bội: 17 Hình 3.5. Bộ NST tam bội ở mẫu rễ Bảng 3.3. Các thông số hình thái dạng tam bội tỏi cô đơn trên mẫu rễ NST q ± SE p ± SE L R Phân loại NST 1 2,45 ± 0,06 2,62 ± 0,08 5,07 1,07 m 2 2,23 ± 0,08 4,56 ± 0,06 6,79 2,04 Sm 3 2,84 ± 0,08 4,51 ± 0,08 7,35 1,59 m 4 3,79 ± 0,08 4,23 ± 0,06 8,02 1,12 m 5 2,39 ± 0,08 5,85 ± 0,08 8,24 2,45 Sm 6 3,17 ± 0,08 5,96 ± 0,08 9,13 1,88 Sm 7 3,62 ± 0,06 5,96 ± 0,08 9,58 1,65 m 8 5,34 ± 0,06 6,46 ± 0,08 11,8 1,21 m Dạng tam bội gồm 24 chiếc NST trong đó có 5 cặp tâm cân (m) và 3 cặp tâm lệch giữa ( Sm). Công thức kiểu nhân là: 3n = 24:15m + 9Sm 18 Biểu đồ 3.1. Idiogram của dạng tam bội tỏi cô đơn trên mẫu rễ 12 10 8 6 4 2 0 Cánh ngắn Cánh dài 1 2 3 4 5 6 7 8 Hình 3.6. Karyogram dạng tam bội tỏi cô đơn trên mẫu rễ - Dạng tứ bội: Hình 3.7. Bộ NST tứ bội ở mẫu rễ 19 Bảng 3.4. Các thông số hình thái NST dạng tứ bội tỏi cô đơn trên mẫu rễ NST q ± SE p ± SE L R Phân loại NST 1 1,59 ± 0,04 1,96 ± 0,04 3,55 1,23 M 2 2,35 ± 0,06 3,67± 0,06 6,02 1,56 M 3 2,59 ± 0,08 4,88 ± 0,08 7,47 1,88 Sm 4 2,21 ± 0,08 5,30 ± 0,08 7,51 2,40 Sm 5 3,05 ± 0,08 5,51 ± 0,08 8,56 1,81 Sm 6 1,96 ± 0,08 6,68 ± 0,08 8,64 3,41 St 7 4,80 ± 0,08 5,43 ± 0,08 10,23 1,13 M 8 3,72 ± 0,04 6,68 ± 0,08 10,40 1,80 Sm Dạng tứ bội gồm 32 chiếc NST trong đó có 3 cặp tâm cân (m), 4 cặp tâm lệch giữa (Sm) và 1 cặp tâm lệch mút (St). Công thức kiểu nhân là: 4n = 32: 12m + 16Sm + 4St Biểu đồ 3.2. Idiogram dạng tứ bội tỏi cô đơn trên mẫu rễ 20 Hình 3.8. Karyogram dạng tứ bội tỏi cô đơn trên mẫu rễ b. Mẫu callus nuôi cấy mô Phương pháp phân tích NST để xác định kiểu nhân tỏi cô đơn trên callus cũng được tiến hành tương tự như trên mẫu rễ. Sử dụng 2 loại callus: + Callus mới phát sinh + Callus đã qua cấy chuyển nhiều lần * Phân tích kiểu nhân tỏi cô đơn trên callus mới phát sinh Các số liệu về chiều dài tương đối của NST, cánh dài, cánh ngắn và tỉ lệ cánh được thể hiện trong bảng 3.5, sơ đồ Idiogram và Karyogram của callus mới phát sinh được trình bày trên biểu đồ 3.3 và hình 3.10. Kết quả phân tích cho thấy: Callus mới phát sinh chỉ tồn tại bộ NST dạng tứ bội gồm 32 chiếc NST trong đó có 3 cặp tâm cân (m) và 5 cặp tâm lệch giữa (Sm). Công thức kiểu nhân: 4n = 12m + 20Sm 21 Hình 3.9. Bộ NST tứ bội tỏi cô đơn trên callus mới phát sinh Bảng 3.5. Các thông số hình thái NST dạng tứ bội tỏi cô đơn trên callus mới phát sinh NST q ± SE p ± SE L R Phân loại NST 1 1,88 ± 0,08 4,21± 0,04 6,09 2,24 Sm 2 2,42 ± 0,08 4,72± 0,04 7,14 1,95 Sm 3 3,38 ± 0,04 5,47 ± 0,08 8,85 1,62 m 4 2,63 ± 0,08 6,64 ± 0,08 9,27 2,52 Sm 5 4,88 ± 0,08 4,97 ± 0,08 9,85 1,10 m 6 3,47 ± 0,08 6,43 ± 0,08 9,90 1,85 Sm 7 4,22± 0,04 8,56 ± 0,08 12,78 2,03 Sm 8 6,22 ± 0,04 6,97 ± 0,08 13,19 1,12 m Biểu đồ 3.3. Idiogram dạng tứ bội tỏi cô đơn trên callus mới phát sinh 14 12 10 8 6 4 2 0 Cánh ngắn Cánh dài 1 2 3 4 5 6 22 7 8 Hình 3.10. Karyogram dạng tứ bội tỏi cô đơn trên callus mới phát sinh * Phân tích kiểu nhân tỏi cô đơn trên callus qua cấy chuyển nhiều lần Các số liệu về chiều dài tương đối của NST, cánh dài, cánh ngắn và tỉ lệ cánh được thể hiện trong bảng 3.6, 3.7, sơ đồ Idiogram và Karyogram của callus mới phát sinh và callus cấy chuyển nhiều lần được trình bày lần lượt trên các biểu đồ 3.4, 3.5 và các hình 3.12, 3.14. Callus đã qua cấy chuyển nhiều lần phát hiện bộ NST ở 3 dạng: tứ bội, ngũ bội và thập bội. - Dạng tứ bội Hình 3.11. Bộ NST tứ bội ở callus cấy chuyển nhiều lần 23 Bảng 3.6. Các thông số hình thái NST dạng tứ bội tỏi cô đơn trên callus qua cấy chuyển nhiều lần NST q ± SE p ± SE L R Phân loại NST 1 1,59 ± 0,04 3,38 ± 0,04 4,97 2,13 Sm 2 2,84 ± 0,08 3,80 ± 0,08 6,64 1,34 m 3 2,21 ± 0,08 4,68 ± 0,06 6,89 2,12 Sm 4 2,08 ± 0,08 5,56 ± 0,08 7,64 2,67 Sm 5 3,55 ± 0,04 5,09 ± 0,06 8,64 1,43 m 6 3,21 ± 0,08 6,01 ± 0,08 9,22 1,87 Sm 7 2,55 ± 0,06 6,76 ± 0,08 9,31 2,65 Sm 8 3,13 ± 0,08 6,85 ± 0,04 9,98 2,19 Sm Dạng tứ bội gồm 32 chiếc NST trong đó có 2 cặp tâm cân (m) và 6 cặp tâm lệch giữa (Sm) Công thức kiểu nhân: 4n = 32: 8m + 24Sm Biểu đồ 3.4. Idiogram dạng tứ bội tỏi cô đơn trên callus qua cấy chuyển nhiều lần 24 Hình 3.12. Karyogram dạng tứ bội tỏi cô đơn trên callus qua cấy chuyển nhiều lần - Dạng ngũ bội: Hình 3.13. Bộ NST ngũ bội ở callus cấy chuyển nhiều lần Bảng 3.7. Các thông số hình thái NST dạng ngũ bội tỏi cô đơn trên callus qua cấy chuyển nhiều lần NST q ± SE p ± SE L R Phân loại NST 1 1,49 ± 0,02 1,64 ± 0,03 3,13 1,10 m 2 1,77 ± 0,07 2,14 ± 0,07 3,91 1,21 m 3 1,94 ± 0,03 3,01 ± 0,07 4,95 1,55 m 4 2,20 ± 0,07 4,61 ± 0,07 6,81 2,10 Sm 5 1,90 ± 0,07 5, 18 ± 0,08 7,08 2,73 Sm 25 6 2,54 ± 0,08 6,15 ± 0,08 8,69 2,42 Sm 7 4,18 ± 0,07 4,61 ± 0,03 8,79 1,10 m 8 3,64 ± 0,07 5,38 ± 0,08 9,02 1,48 m Dạng ngũ bội gồm 40 chiếc NST trong đó có 5 cặp tâm cân (m) và 3 cặp tâm lệch giữa (Sm) Công thức kiểu nhân: 5n = 40: 25m + 15Sm Biểu đồ 3.5. Idiogram dạng ngũ bội tỏi cô đơn trên callus qua cấy chuyển nhiều lần Hình 3.14. Karyogram dạng ngũ bội tỏi cô đơn trên callus qua cấy chuyển nhiều lần 26 - Dạng thập bội 10n = 80 Do số lượng ảnh chụp tiêu bản còn chưa đáp ứng đủ số lượng và chất lượng nên chưa tiến hành phân tích kiểu nhân. Hình 3.15. Bộ NST thập bội ở callus cấy chuyển nhiều lần Trong quá trình phân tích kiểu nhân của các mẫu tỏi cô đơn như trên không phát hiện thấy dạng lưỡng bội ở tỏi cô đơn. 3.3.2. Kết quả phân tích kiểu nhân (karyotype) tỏi nhiều tép Các số liệu về chiều dài tương đối của NST, cánh dài, cánh ngắn và tỉ lệ cánh được thể hiện trong bảng 3.8, Idiogram và Karyogram của tỏi nhiều tép được trình bày trên biểu đồ 3.6 và hình 3.17. Kết quả phân tích kiểu nhân tỏi nhiều tép phát hiện 1 dạng bội là dạng lưỡng bội Hình 3.16. Bộ NST dạng lưỡng bội tỏi nhiều tép 27 Bảng 3.8. Các thông số hình thái NST dạng lưỡng bội tỏi nhiều tép NST q ± SE p ± SE L R Phân loại NST 1 3,17 ± 0,08 5,18 ± 0,04 8,35 1,63 M 2 3,26 ± 0,04 6,60 ± 0,04 9,86 2,02 Sm 3 3,26 ± 0,04 8,10 ± 0,06 11,36 2,48 Sm 4 5,09 ± 0,04 6,51 ±0,04 11,60 1,28 M 5 5,34 ± 0,06 7,60 ± 0,04 12,94 1,42 M 6 6,43 ± 0,06 6,93 ± 0,05 13,36 1,08 M 7 6,68 ± 0,04 7,26 ± 0,04 13,94 1,09 M 8 8,18 ± 0,04 9,19 ± 0,04 17,37 1,12 m Dạng lưỡng bội gồm 16 chiếc NST trong đó có 2 cặp tâm cân (M), 4 cặp tâm cân (m) và 2 cặp tâm lệch giữa. Công thức kiểu nhân: 2n = 16 : 4M + 8m + 4Sm Biểu đồ 3.6. Idiogram dạng dạng lưỡng bội tỏi nhiều tép 28 Hình 3.17. Karyogram bộ lưỡng bội tỏi nhiều tép Biện luận Đối chiếu với kết quả nghiên cứu của tác giả Phạm Thị Minh Phương và Yosuke Tashiro thì bộ NST ở tỏi là 2n = 16 [4]. Trong khi đó kết quả phân tích của chúng tôi cho thấy tỏi cô đơn có bộ NST 3n, 4n, 5n, 10n và không có bộ lưỡng bội 2n. Đồng thời so sánh với kết quả phân tích kiểu nhân tỏi nhiều tép (cùng giống phát sinh với tỏi cô đơn) chỉ tồn tại bộ NST lưỡng bội 2n = 16, chứng tỏ ở tỏi cô đơn đã xảy ra các dạng đột biến đa bội so với giống ban đầu. Kết quả này phù hợp với đặc điểm hình thái ngoài vượt trội của tỏi cô đơn so với tỏi nhiều tép. Kết quả phân tích mẫu rễ cho thấy tỏi cô đơn tồn tại ở dạng tam bội 3n = 24, tứ bội 4n = 32. Kết quả phân tích callus nuôi cấy trên môi trường MS + 2 mg/l 2,4-D + 1mg/l kinetin lại cho thấy các dạng 3n, 4n, 5n, 10n ở tỏi cô đơn. Đặc biệt ở callus mới phát sinh thì chỉ phát hiện dạng 4n trong khi đó ở callus cấy chuyển nhiều lần, nuôi cấy thời gian dài thì phổ đột biến khá rộng từ dạng tứ bội 4n, ngũ bội 5n đến thập bội 10n trong đó dạng thập bội chiếm khoảng 20% và dạng ngũ bội tương đối nhiều chiếm khoảng 70% trên các tế bào đem phân tích. Đồng thời công thức kiểu nhân của dạng tứ bội trên mẫu callus cấy chuyển nhiều lần (4n = 32: 8m + 24Sm ) khác biệt hẳn so với mẫu rễ (4n = 32: 12m + 16Sm + 4St ) và mẫu callus mới phát sinh (4n = 32: 12m + 20Sm). Điều này cho 29 thấy tỏi cô đơn khá nhạy với tác nhân đột biến, đặc biệt là hóa chất và phổ đột biến khá rộng. Kết quả này cho thấy trong vấn đề sử dụng hóa chất bảo quản tỏi giống và thuốc BVTV trong quá trình canh tác trên đảo Lý Sơn chúng ta cần xem xét lại loại hóa chất và liều lượng. Đồng thời, cũng cần chú ý đến loại chất kích thích sinh trưởng, liều lượng trong môi trường nuôi cấy mô và nếu tái sinh cây tỏi cô đơn in vitro thông qua callus thì chỉ nên sử dụng loại callus mới phát sinh, không nên dùng loại callus qua cấy chuyển nhiều lần để tránh gây nên thay đổi yếu tố di truyền của giống. 30 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận - Qua khảo sát các cách làm tiêu bản kiểu nhân chúng tôi đã tìm ra được phương pháp làm tiêu bản tối ưu nhất trong 2 giai đoạn: tiền cố định và thủy phân mẫu. + Giai đoạn tiền cố định: xử lý bằng dung dịch 8 – hydroxyquinon 0,002M trong 3h nhiệt độ phòng và 2h trong tủ lạnh cho kết quả tiêu bản tốt nhất. + Giai đoạn thủy phân mẫu: xử lý mẫu bằng dung dịch HCl 1N cho kết quả tiêu bản kiểu nhân tốt nhất. - Hình thái 2 dạng tỏi Lý Sơn: tỏi cô đơn và tỏi nhiều tép đã được mô tả và cho thấy một số sai khác về hình thái của 2 dạng tỏi này về dạng căn, kích thước căn, số lượng căn, kích thước thân và lá. - Qua nghiên cứu phân tích kiểu nhân ở tỏi cô đơn cho kết quả như sau: + Ở mẫu rễ tỏi cô đơn chúng tôi phát hiện 2 dạng bội là dạng tam bội và tứ bội.  Dạng tam bội: 3n = 24: 15m + 9Sm  Dạng tứ bội ở: 4n = 32: 12m + 16Sm + 4St + Ở tế bào thu được từ callus mới phát sinh phát hiện 1 dạng bội NST:  Dạng tứ bội: 4n = 32: 12m + 20Sm + Ở tế bào thu được từ callus cấy chuyển nhiều lần phát hiện 3 dạng bội NST:  Dạng tứ bội: 4n = 32: 8m + 24Sm  Dạng ngũ bội: 5n = 40: 25m + 15Sm  Dạng thập bội 10n = 80. - Qua phân tích tất cả các mẫu tỏi cô đơn thu được chúng tôi chưa tìm thấy dạng lưỡng bội 2n. 31 - Phân tích kiểu nhân tỏi nhiều tép chỉ phát hiện 1 dạng bội là dạng lưỡng bội 2n = 16: 4M + 8m + 4Sm. Như vậy, ở tỏi cô đơn đã xảy ra các dạng đột biến đa bội so với giống ban đầu với phổ đột biến rộng và tỏi cô đơn có kiểu nhân khá đa dạng. 4.2. Kiến nghị - Đề nghị tiếp tục nghiên cứu mở rộng hơn: + Tăng số lượng mẫu để phát hiện thêm những dạng đa bội khác. + Tiếp tục thu thập và phân tích kiểu nhân của các dạng tỏi khác của tỏi Lý Sơn. + Nghiên cứu ở mức độ cao hơn (nhuộm băng, phân tích ADN) để làm rõ nguyên nhân của sự tồn tại nhiều dạng công thức kiểu nhân khác nhau từ các dạng bội NST thu được. 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt 1. Nguyễn Minh Chính, Nguyễn Văn Long, Đào Văn Đôn, Nguyễn Duy Thức (2011), “Nghiên cứu thành phần hóa học của tỏi Lý Sơn (Allium sativum L.)”. 2. Vũ Thị Hạnh (2001), Nghiên cứu kiểu nhân một số loài trong chi Ráy (Alocasia) và chi khoai môn (Colocasia) ở Việt Nam, ĐHSPHN, tr 109. 3. Nguyễn Duy Hiền (2005), Di truyền học tế bào, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, chương 2-Thể nhiễm sắc của tế bào, tr 18. 4. Phạm Hoàng Hộ (1993), Cây cỏ Việt Nam, Quyển III, NXB Mekong printing, 477. 5. Ngô Giang Liên, Phạm Thị Khoa (2011), Nghiên cứu đặc điểm kiểu nhân của loài Anophenles.dirus ở đảo Hải Nam Trung Quốc, Đại học quốc gia Hà Nội, tr 88. 6. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y Học, tr 181-183. 7. Tô Cao Ly, Dương Thu Hương (2004), Nghiên cứu kiểu nhân và đa dạng kiểu nhân cửa một số giống lợn: Đại Mạch (large white), Móng Cái và con lai F1 nuôi tại miền Bắc nước ta, ĐHSPHN. 8. Đặng Thị Nhâm (2011), “ Phân tích bộ nhiễm sắt thể (Karyotype) ở những cặp vợ chồng sẩy thai liên tiếp và con bị dị tật bẩm sinh”, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên. 9. Phạm Thị Minh Phương và Yosuke Tashiro (2010), Nghiên cứu sự đa dạng và số lượng bộ nhiễm sắc thể cây trồng ăn được chi hành tỏi ở Việt Nam, ĐH Nông nghiệp Hà Nội, tr 138-144. 10. Phạm Xuân Quyên (2005), Bài thuốc của Tổ chức Y tế Thế giới WHOLHQ, tập san KHKT, Tạp chí Y tế 1984. 11. Phạm Thanh Trang, Nguyễn Minh Đức, Vũ Khánh (1998), “ Chiết tách và xác định cấu trúc allicin từ tỏi Allium sativum L.”, Tạp chí dược liệu, tập 4, số 3/1999, tr 80-83. 33 12. Nguyễn Nghĩa Thìn (2006), Thực vật có hoa, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, chương 7-Các phương pháp phân loại, tr 17. 13. Phùng Như Toàn (2004), “Khảo sát Karyotype thai nhi qua nuôi cấy tế bào ối trong chẩn đoán trước sinh”, TC Nghiên cứu y học , 2006/Số 1-Cd, tr 53-57. 14. Nguyễn Lĩnh Toàn (2011), “ Dịch chiết tỏi Lý Sơn ức chế phát triển tế bào ung thư tuyến tiền liệt người dòng PC-3 trên in vitro”, Học viện Quân y. Tài liệu nƣớc ngoài 15. Arunkumar A, Vijayababu MR, Srinivasan N, Aruldhas MM, Arunakaran J. Garlic compound, diallyl disulfide induces cell cycle arrest in prostate cancer cell line PC-3. Mol Cell Biochem. 2006, Epub May 12, 288 (1-2), pp.107-13. 16. Deniz Yuzbasioglu và Fatma Unal (2004), Karyotying, C-and nor banding of Allium sativum. L (Liliaceae) cultivated in Turkey, Pak. J. Bot., 36(2), pp. 1-2. 17. Ejaz. S, L.C. Woong, A. Ejaz (2003), South Korea Extract of garlic (Allium sativum) in cancer chemoprevention, Experimental Oncology, pp. 93-97. 18. Fatima Clement, Siddanakoppalu N. Pramod , Yeldur P. Venkatesh (2009), Identity of the immunomodulatory proteins from garlic (Allium sativum) with the major garlic lectins or agglutinins, INTIMP-01936, pp. 1-9. 19. Gorinstein S, Drzewiecki J, Leontowicz H, Leontowicz M, Najman K, Jastrzebski Z, et al (2005), Comparison of the bioactive compounds and antioxidant potentials of fresh and cooked Polish, Ukrainian, and Israeli garlic. J Agric Food Chem 53,pp. 2726–2732. 20. Gupta A, Sandhu RS (1996), Mitogenic activity of high molecular weight mannose specific agglutinin, Ind J Biochem Biophys 33, pp.325–327. 21. Konvicka. O và Albert Levan (1972), Chromosome studies in Alliurn sativum, Hereditas 72, pp. 1-2. 22. Paknia. R và Karimzadeh.G (2010), Karyotypic Study in Some Iranian Local Onion Populations, Journal of Plant Physiology and Breeding. 23. Pause Z. P (1974), Experimental of plant cell, Technology and Science, pp 150. 34 24. Raghuveer Choudhary (2008), Benificial effect of Allium sativum and Allium tuberosum on experimental hyperlipidemia and atherosclerosis, Pak J Physiol 4. 25. Rizwan Ashraf, Rafeeq Alam Khan, Imran Ashraf (2011), Garlic (Allium sativum) supplementation with standard antidiabetic agent provides better diabetic control in type 2 diabetes patients, Pak. J. Pharm. Sci., Vol.24, No.4, October 2011, pp. 1-2. 26. Sook Young Lee, Haeng Hoon Kim, Yong Kyoung Kim, Nam Il Park and Sang Un Park (2009), Plant regeneration of garlic (Allium sativum L.) via somatic embryogenesis, Scientific Research and Essay, pp. 1569-1574. 27. Wang HX, Ng TB (2001), Purification of allivin, a novel antifungal protein from bulbs of the round-cloved garlic, Life Sci 70, pp. 357–365. 27. Xia L, Ng TB (2005), Isolation of alliumin, a novel protein with antimicrobial and antiproliferative activities from multiple-cloved garlic bulbs, Peptides 26, pp. 177–183. 35 36 [...]... ở bệnh nhân tiểu đường type 2 [25] Năm 2009, các nhà khoa học Hàn Quốc đã nghiên cứu nhân giống vô tính thông qua tái sinh in vitro cây tỏi thành công [26] Đối với nghiên cứu kiểu nhân của các loại thực vật thuộc chi Hành tỏi trên thế giới đã có nhiều công trình như: + Nghiên cứu của Konvicka O và Albert Levan năm 1972 về bộ NST ở tỏi (Allium sativum): nghiên cứu về bộ NST của 4 chủng tỏi thuộc 2 dạng. .. NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣơng nghiên cứu Tỏi Lý Sơn (Allium sativum) tại đảo Lý Sơn, tỉnh Quảng Ngãi thuộc chi Hành (Allium), họ Hành (Alliaceae) Trong nghiên cứu sử dụng 2 dạng tỏi Lý Sơn bao gồm: Tỏi cô đơn và tỏi nhiều tép Riêng đối với tỏi cô đơn sử dụng trong phân tích bao gồm 2 loại mẫu: mẫu rễ thu được trong điều kiện trồng tự nhiên và mẫu callus đang nuôi cấy tại phòng Công nghệ sinh học, trường... allicin trong tỏi Lý Sơn, tỏi ta và tỏi Trung Quốc lần lượt là 0,767%, 0,712% và 0,670% [10] Trong lĩnh vực y dược kết quả nghiên cứu của Nguyễn Lĩnh Toàn (2011) cho thấy dịch chiết tỏi Lý Sơn ở nồng độ 5-10mg/l ức chế phát triển tế bào ung thư tuyến tiền liệt người dòng PC-3 trên in vitro [15] Hiện nay, ở Việt Nam, vấn đề nghiên cứu kiểu nhân và sự đa dạng kiểu nhân cũng được thực hiện trên một vài... (2005) [8] Trên đối tượng thực vật có nghiên cứu của Vũ Thị Hạnh (2001) về kiểu nhân của một số loài trong chi Ráy (Alocasia) và chi Khoai môn (Colocasia), nghiên cứu của Võ Thị Kim Diệp (2007) “ Đa dạng kiểu nhân của một số loài trong chi Hành ” [2] Tuy nhiên, cho đến nay tại Việt Nam vẫn chưa có một nghiên cứu nào về mặt di truyền đối với tỏi Lý Sơn 1.3 Một số khái niệm Với vấn đề nghiên cứu kiểu nhân. .. tích kiểu nhân của các mẫu tỏi cô đơn như trên không phát hiện thấy dạng lưỡng bội ở tỏi cô đơn 3.3.2 Kết quả phân tích kiểu nhân (karyotype) tỏi nhiều tép Các số liệu về chiều dài tương đối của NST, cánh dài, cánh ngắn và tỉ lệ cánh được thể hiện trong bảng 3.8, Idiogram và Karyogram của tỏi nhiều tép được trình bày trên biểu đồ 3.6 và hình 3.17 Kết quả phân tích kiểu nhân tỏi nhiều tép phát hiện 1 dạng. .. sinh trưởng, sức sống tốt hơn so với tỏi nhiều tép thể hiện qua thời gian ra rễ, đường kính rễ, thời gian lên mầm, thời gian sinh trưởng đạt kích thước tối đa, dạng lá Như vậy, tuy cùng một giống phát sinh nhưng ở 2 dạng tỏi này đã thể hiện sự khác biệt rõ rệt về hình thái ngoài và khả năng sinh trưởng 16 Hình 3.3 Rễ tỏi cô đơn Hình 3.4 Rễ tỏi nhiều tép 3.3 Kết quả phân tích kiểu nhân ở tỏi Lý Sơn 3.3.1... tâm cân (m) và 3 cặp tâm lệch giữa ( Sm) Công thức kiểu nhân là: 3n = 24:15m + 9Sm 18 Biểu đồ 3.1 Idiogram của dạng tam bội tỏi cô đơn trên mẫu rễ 12 10 8 6 4 2 0 Cánh ngắn Cánh dài 1 2 3 4 5 6 7 8 Hình 3.6 Karyogram dạng tam bội tỏi cô đơn trên mẫu rễ - Dạng tứ bội: Hình 3.7 Bộ NST tứ bội ở mẫu rễ 19 Bảng 3.4 Các thông số hình thái NST dạng tứ bội tỏi cô đơn trên mẫu rễ NST q ± SE p ± SE L R Phân loại... ± 0,08 10,40 1,80 Sm Dạng tứ bội gồm 32 chiếc NST trong đó có 3 cặp tâm cân (m), 4 cặp tâm lệch giữa (Sm) và 1 cặp tâm lệch mút (St) Công thức kiểu nhân là: 4n = 32: 12m + 16Sm + 4St Biểu đồ 3.2 Idiogram dạng tứ bội tỏi cô đơn trên mẫu rễ 20 Hình 3.8 Karyogram dạng tứ bội tỏi cô đơn trên mẫu rễ b Mẫu callus nuôi cấy mô Phương pháp phân tích NST để xác định kiểu nhân tỏi cô đơn trên callus cũng được... thể), 7m1sm (tám quần thể) và 6m2sm (hai quần thể) [18] 1.2.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam Năm 2010, nghiên cứu của hai tác giả Phạm Thị Minh Phương và Yosuke Tashiro cho thấy tỏi có số lượng NST là 2n=16 [9] Riêng đối với tỏi Lý Sơn, theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Minh Chính cho thấy: trong 3 loại tỏi (tỏi Lý Sơn, tỏi ta và tỏi Trung Quốc) đều có các nhóm hoạt chất gồm: saponin steroid, flavonoid,... phân lón vừa xử lý Sau đó, người dân tiến 3 hành găm đứng tép tỏi, phủ nhẹ một lớp cát mỏng, tránh tép tỏi tiếp xúc với phân bón lót Mât độ trồng: Hàng x hàng: 14-15 cm; Cây x Cây: 6 - 7 cm 1.2 Tình hình nghiên cứu 1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới Trên thế giới có khá nhiều các nghiên cứu về hoạt chất và tác dụng của tỏi: Năm 2008, một kết quả nghiên cứu được công bố cho rằng tỏi có tác dụng