Nghiên cứu đa dạng kiểu nhân ở tỏi cô đơn(alliumsativum) trên đảo lý sơn, tỉnh quảng ngãi

... đơn, tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Nghiên cứu đa dạng kiểu nhân tỏi cô đơn (Allium sativum) đảo Lý Sơn, tỉnh Quảng Ngãi ” Mục tiêu đề tài - Khảo sát tìm phương pháp làm tiêu kiểu nhân tối ưu -... thái tỏi cô đơn tỏi nhiều tép đảo Lý Sơn - Phân tích kiểu nhân, kiểm tra độ đa dạng kiểu nhân tỏi cô đơn tỏi nhiều tép đảo Lý Sơn Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học - Nghiên cứu. .. quan tài liệu tỏi cô đơn tỏi nhiều tép đảo Lý Sơn - Khảo sát tìm phương pháp làm tiêu kiểu nhân tối ưu - Nghiên cứu đặc điểm hình thái tỏi cô đơn tỏi nhiều tép - Xây dựng kiểu nhân, nhân đồ (karyogram),

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chưa từng được

ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

Bùi Thị Minh Hòa

LỜI CÁM ƠN

Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp của mình, tôi xin chân thành cám ơn tất cả các thầy cô giáo Khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng đã tận tình dạy dỗ, truyền đạt những tri thức và kinh nghiệm quý báu cho tôi

Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS Trương Thị Thanh Mai đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu làm luận văn

Xin gửi lời cám ơn đến gia đình, bạn bè những người đã luôn động viên, đóng góp những ý kiến quý báu cho tôi

Đà Nẵng, tháng 5 năm 2013

Sinh viên

Bùi Thị Minh Hòa

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU i

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu đề tài 2

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

3.1 Ý nghĩa khoa học 2

3.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Sơ lược về cây tỏi 3

1.2 Tình hình nghiên cứu 4

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 4

1.2.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 5

1.3 Một số khái niệm 6

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 8

2.1 Đối tương nghiên cứu 8

2.2 Thời gian nghiên cứu 8

2.3 Địa điểm nghiên cứu 9

2.4 Phương pháp nghiên cứu 9

2.4.1 Phương pháp nghiên cứu NST 9

2.4.2 Phương pháp nghiên cứu hình thái 10

2.4.3 Phương pháp xây dựng kiểu nhân 11

2.4.4 Phương pháp xử lí số liệu 12

CHƯƠNG 3: NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 13

3.1 Kết quả khảo sát các công thức làm tiêu bản kiểu nhân (karyotype) 13

3.2 Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái tỏi cô đơn và tỏi nhiều tép Lý Sơn 15

3.2.1 Tỏi cô đơn 15

3.2.2 Tỏi nhiều tép 15

3.3 Kết quả phân tích kiểu nhân ở tỏi Lý Sơn 17

3.3.1 Kết quả phân tích kiểu nhân tỏi cô đơn 17

3.3.2 Kết quả phân tích kiểu nhân (karyotype) tỏi nhiều tép 28

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31

4.1 Kết luận 31

4.2 Kiến nghị 32

TÀI LIỆU THAM KHẢO 33

3.1 Kết quả khảo sát các cách tiền cố định bằng 8-hydroxyquinon 13

3.2 Kết quả khảo sát nồng độ dung dịch HCl thủy phân mẫu 13

3.3 Các thông số hình thái dạng tam bội tỏi cô đơn trên mẫu rễ 18

3.4 Các thông số hình thái NST dạng tứ bội tỏi cô đơn trên mẫu

3.6 Các thông số hình thái NST dạng tứ bội tỏi cô đơn trên callus

qua cấy chuyển nhiều lần

24

3.7 Các thông số hình thái NST dạng ngũ bội tỏi cô đơn trên

callus qua cấy chuyển nhiều lần

25

3.8 Các thông số hình thái NST dạng lưỡng bội tỏi nhiều tép 28

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

3.1 Idiogram của dạng tam bội tỏi cô đơn trên mẫu rễ 19

3.2 Idiogram dạng tứ bội tỏi cô đơn trên mẫu rễ 20

3.3 Idiogram dạng tứ bội tỏi cô đơn trên callus mới phát sinh 22

3.4 Idiogram dạng tứ bội tỏi cô đơn trên callus qua cấy chuyển

3.6 Karyogram dạng tam bội tỏi cô đơn trên mẫu rễ 19

3.8 Karyogram dạng tứ bội tỏi cô đơn trên mẫu rễ 21

3.9 Bộ NST tứ bội tỏi cô đơn trên callus mới phát sinh 22

3.10 Karyogram dạng tứ bội tỏi cô đơn trên callus mới phát sinh 23

3.11 Bộ NST tứ bội ở callus cấy chuyển nhiều lần 23

3.12 Karyogram dạng tứ bội tỏi cô đơn trên callus qua cấy chuyển

nhiều lần

25

3.13 Bộ NST ngũ bội ở callus cấy chuyển nhiều lần 25

3.14 Karyogram dạng ngũ bội tỏi cô đơn trên callus qua cấy

chuyển nhiều lần

26

3.15 Bộ NST thập bội ở callus cấy chuyển nhiều lần 27

3.16 Bộ NST dạng lưỡng bội tỏi nhiều tép 27

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Lý Sơn – một hòn đảo nổi tiếng của Việt Nam với điều kiện thiên nhiên

vô cùng khắc nghiệt: đất chủ yếu là đất cát biển xâm thực và đất bazan do hoạt động của núi lửa; khí hậu thì khô hạn vào mùa nắng, giông, bão vào mùa mưa Tuy nhiên, chính điều đó lại tạo điều kiện thuận lợi để nông dân vận dụng trồng tỏi Tỏi Lý Sơn đã trở thành thương hiệu tỏi của Việt Nam, đặc biệt là tỏi cô đơn Theo nông dân trồng tỏi, sau khi gieo tỏi giống sẽ thu được củ tỏi với nhiều tép Tuy nhiên trên 1ha đất trồng tỏi có thể thu được 1 – 2 kg tỏi đặc biệt, củ tỏi chỉ có 1 tép lớn hơn tép tỏi bình thường, gọi là tỏi cô đơn Theo người dân đảo cũng như các thực khách thì tỏi Lý Sơn đặc biệt là tỏi cô đơn có hương vị thơm ngon và hoạt tính hơn hẳn các loại tỏi khác

Tỏi có chứa nhiều hợp chất sinh học quý như allicin, ajoen, dialyl disulfid, các saponin [12], steroid, flavonoid, axit amin, chất béo, đường khử, polysacharid, sterol và tinh dầu [1] trong đó tỏi Lý Sơn chứa hàm lượng allicin cao hơn so với tỏi ta và tỏi Trung Quốc [1] Chính nhờ những hoạt chất đó nên tỏi không chỉ được dùng làm gia vị mà còn là một loại dược liệu được hầu hết các nước trên thế giới sử dụng để chữa một số nhóm bệnh như: bệnh thấp khớp, tim mạch, phế quản, tiêu hóa, bệnh trĩ, bệnh đái tháo đường [10].Ngoài ra, tỏi còn có vai trò kháng một số loại vi trùng như Staphylloccocus, thương hàn, lỵ amip, trực khuẩn bạch hầu [6] Ngày nay tỏi còn được chú ý đến trong khả năng

ức chế ung thư do tỏi chứa phong phú của các hợp chất hóa học được hữu ích trong phòng và điều trị các loại ung thư khác nhau, đặc biệt, allicin - một hợp chất có antithrombotic, chống oxy hóa, và các hoạt tính chống ung thư Allicin

có thể thâm nhập rất nhanh vào các khoang khác nhau của tế bàovà hoàn toàn được chuyển hóa ở gan Nghiên cứu thực nghiệm cung cấp bằng chứng thuyết phục rằng tỏi với thành phần chứa lưu huỳnh hữu cơ allyl là chất ức chế hiệu quả sự tăng trưởng của khối u [5]

Đối với tỏi Lý Sơn, bên cạnh việc có hương vị thơm ngon hơn so với tỏi

ta hay tỏi Trung Quốc, hoạt tính sinh học của tỏi cũng hơn hẳn, đặc biệt là hàm lượng allicin

Vì vậy, tỏi trở thành một loài thực vật hữu ích cho con người Tuy nhiên các nghiên cứu về tỏi còn khá ít, chủ yếu là các nghiên cứu về hình thái học, sinh thái học, kĩ thuật canh tác, các bài thuốc chữa bệnh từ tỏi… Riêng đối với tỏi cô đơn Lý Sơn mặc dù chứa hoạt tính cao, được người tiêu dùng yêu thích, giá thành khá đắt nhưng hầu như chưa được quan tâm nghiên cứu Do đó, để góp thêm nguồn tư liệu khoa học về tỏi Lý Sơn, đặc biệt là tỏi cô đơn, chúng tôi tiến

hành nghiên cứu đề tài: “ Nghiên cứu đa dạng kiểu nhân ở tỏi cô đơn (Allium sativum) trên đảo Lý Sơn, tỉnh Quảng Ngãi ”

2 Mục tiêu đề tài

- Khảo sát tìm ra phương pháp làm tiêu bản kiểu nhân tối ưu

- Phân tích tổng hợp những tư liệu mô tả hình thái tỏi cô đơn và tỏi nhiều tép của đảo Lý Sơn

- Phân tích kiểu nhân, kiểm tra độ đa dạng kiểu nhân ở tỏi cô đơn và tỏi nhiều tép của đảo Lý Sơn

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

- Nghiên cứu tổng quan tài liệu về tỏi cô đơn và tỏi nhiều tép của đảo Lý Sơn

- Khảo sát tìm ra phương pháp làm tiêu bản kiểu nhân tối ưu

- Nghiên cứu đặc điểm hình thái của tỏi cô đơn và tỏi nhiều tép

- Xây dựng kiểu nhân, nhân đồ (karyogram), NST đồ (idiogram), xác định công thức kiểu nhân và phân tích sự đa dạng kiểu nhân của tỏi cô đơn và tỏi nhiều tép

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả của đề tài góp thêm nguồn tư liệu khoa học về tỏi Lý Sơn, đặc biệt là tỏi cô đơn

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược về cây tỏi

Tỏi có tên khoa học là Allium sativum, thuộc chi Hành (Allium), họ Hành (Alliacae) Tỏi là một loại địa thực vật cao khoảng 30-60 cm; hành tròn, to 2-4

cm; cầu hành có bao trắng; lá dẹp, dài 40-60 cm, rộng 1,2 cm [4]

Theo Đỗ Tất Lợi cho rằng trong thành phần của tỏi có chứa một ít iot và tinh dầu Tuy nhiên, thành phần chính của tỏi là một chất kháng sinh allicin C6H10OS2 có tác dụng diệt vi khuẩn rất mạnh Theo ông, trong tỏi không chứa allicin mà chỉ có chất alliin, khi chất này chịu tác dụng của enzim alinaza (có trong tỏi) và tiếp xúc với không khí thì hình thành allicin Dung dịch allicin với nồng độ 1/85.000-1/25.000 có thể ức chế sinh trưởng các trùng Staphylococcus, Streptococcus, trùng thương hàn,trực trùng lỵ [6]

Trong dịch chiết tỏi có hơn 100 loại hợp chất chứa lưu huỳnh có giá trị trong y học, tiêu biểu là N-aceryl-S-allyl cysteine, allyl mercaptan, diallyl disulfide, diallyl sulfide, diallyl sulfoxide, diallyl sulfone, và allyl methyl sulfide… Trong đó hợp chất allicin có vai trò quan trọng trong ức chế quá trình nhân lên của tế bào ung thư và điều hoà apoptosis [16]

Một vài nghiên cứu cho thấy trong 3 loại tỏi: tỏi ta, tỏi Trung Quốc và tỏi

Lý Sơn đều có các nhóm hoạt chất gồm: saponin steroid, flavonoid, axit amin, chất béo, đường khử, polysacharid, sterol và tinh dầu [1] trong đó tỏi Lý Sơn chứa hàm lượng allicin cao hơn so với tỏi ta và tỏi Trung Quốc [1] Có sự khác biệt này có thể là do điều kiện thời tiết, đất đai, do quy trình và kinh nghiệm trồng tỏi từ lâu đời của người dân Lý Sơn Thời vụ trồng tỏi Lý Sơn hằng năm bắt đầu từ tháng 9 đến tháng 10 Tuy nhiên, từ trước đó nhiều tháng người dân đảo Lý Sơn đã xuống biển lấy cát san hô lên để phục vụ việc gieo trồng Trước tiên, lớp cát san hô cũ được cào sang một bên, sau đó buồi một lớp đất đỏ bazan dày khoảng 1-2cm (đất đỏ này được lấy từ trên núi hoặc đào dưới hầm) đầm chặt rồi bón phân lót Lớp đất san hô mới được lấy lên từ dưới biển sẽ được phơi khô rồi phủ lên bề mặt lớp đất và phân lón vừa xử lý Sau đó, người dân tiến

hành găm đứng tép tỏi, phủ nhẹ một lớp cát mỏng, tránh tép tỏi tiếp xúc với

phân bón lót Mât độ trồng: Hàng x hàng: 14-15 cm; Cây x Cây: 6 - 7 cm

1.2 Tình hình nghiên cứu

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới có khá nhiều các nghiên cứu về hoạt chất và tác dụng của

tỏi: Năm 2008, một kết quả nghiên cứu được công bố cho rằng tỏi có tác dụng

làm giảm nguy cơ xơ vữa động mạch do các hợp chất có chứa lưu huỳnh của tỏi

có tác dụng phân giải cholesterol, triglyceride trong huyết thanh làm giảm lipit

máu [24]

Năm 2009, một bài tổng hợp khoa học đã cho rằng tỏi là một tác nhân hiệu quả trong chống ung thư, chống oxi hóa, chống vi khuẩn, kích thích miễn dịch cơ thể [17]

Trong thành phần của tỏi chứa ~ 2% protein trên trọng lượng tươi, các protein chính hiện diện trong củ là agglutinins (25 kD; ASA25) và alliinase (110 kD) [21] Ngoài các protein này, trong tỏi còn hiện diện các protein khác như cao phân tử agglutinin glycoprotein (110 kD; ASA110) [20], protein kháng nấm, allivin (13 kD) [27], và protein chống vi khuẩn, alliumin (13 kD) [28] Hiệu quả của toàn bộ các chất chiết xuất từ tỏi và ASA110 đã được nghiên cứu trên tế bào lympho T [19]

Năm 2011, một nghiên cứu khác chứng minh được rằng: Sử dụng tỏi bổ sung với thuốc trị đái tháo đường giúp cải thiện kiểm soát đường huyết ở bệnh nhân tiểu đường type 2 [25]

Năm 2009, các nhà khoa học Hàn Quốc đã nghiên cứu nhân giống vô tính thông qua tái sinh in vitro cây tỏi thành công [26]

Đối với nghiên cứu kiểu nhân của các loại thực vật thuộc chi Hành tỏi trên thế giới đã có nhiều công trình như:

+ Nghiên cứu của Konvicka O và Albert Levan năm 1972 về bộ NST ở

tỏi (Allium sativum): nghiên cứu về bộ NST của 4 chủng tỏi thuộc 2 dạng hình

thái khác nhau trong đó có 3 chủng loại H và 1 chủng loại U Mục tiêu của

nghiên cứu này là xác định cách li di truyền đã gây nên sự tích lũy các NST khác biệt giữa các dòng vô tính [22]

+ Nghiên cứu của Deniz Yuzbasioglu và Fatma Unal về kiểu nhân ở tỏi

(Allium sativum.L) được trồng phổ biến tại Thổ Nhĩ Kỳ: nghiên cứu này sử dụng

tế bào mô phân sinh ở đỉnh rễ trong nguyên phân để phân tích số lượng NST, chiều dài thực tế của từng NST, tỉ lệ cánh…thông qua đó thiết lập bộ kiểu nhân cho tế bào [17]

+ Một nghiên cứu khác của R Paknia và G Karimzadeh về đa dạng kiểu nhân của một số quần thể hành bản địa ở Iran: Dựa vào các tế bào mô phân sinh đang tiến hành nguyên phân để đo tổng chiều dài NST (TL), cánh dài (L), cánh ngắn (S), chiều dài tương đối NST (RL), tỉ lệ cánh (AR) Hiển thị các công thức nhiễm sắc thể 8m (hai quần thể), 7m1sm (tám quần thể) và 6m2sm (hai quần thể) [18]

1.2.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Năm 2010, nghiên cứu của hai tác giả Phạm Thị Minh Phương và

Yosuke Tashiro cho thấy tỏi có số lượng NST là 2n=16 [9]

Riêng đối với tỏi Lý Sơn, theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Minh Chính cho thấy: trong 3 loại tỏi (tỏi Lý Sơn, tỏi ta và tỏi Trung Quốc) đều có các nhóm hoạt chất gồm: saponin steroid, flavonoid, axit amin, chất béo, đường khử, polysacharid, sterol và tinh dầu Bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector PDA đã xác định được hàm lượng allicin trong tỏi Lý Sơn, tỏi ta và tỏi Trung Quốc lần lượt là 0,767%, 0,712% và 0,670% [10]

Trong lĩnh vực y dược kết quả nghiên cứu của Nguyễn Lĩnh Toàn (2011) cho thấy dịch chiết tỏi Lý Sơn ở nồng độ 5-10mg/l ức chế phát triển tế bào ung thư tuyến tiền liệt người dòng PC-3 trên in vitro [15]

Hiện nay, ở Việt Nam, vấn đề nghiên cứu kiểu nhân và sự đa dạng kiểu nhân cũng được thực hiện trên một vài đối tượng động, thực vật và người

Ở đối tượng động vật có nghiên cứu của Ngô Giang Liên (ĐH KHTN,

ĐH QGHN) và Phạm Thị Khoa (Viện sốt rét, Ký sinh trùng, Côn trùng Hà Nội)

về đặc điểm kiểu nhân của loài Anopheles dirus ở đảo Hải Nam, Trung Quốc

bằng cách sử dụng phương pháp phân tích NST trong kì giữa nguyên phân của

Baimai (1984), tiêu bản NST sau khi giữ ấm 370C trong 24h được nhuộm bằng Giêm sa [5] Nghiên cứu của Tô Cao Ly và Dương Thu Hương (2004) về kiểu nhân của 2 đối tượng lợn Đại Mạch, lợn Móng Cái và con lai F1 của 2 giống này bằng phương pháp nhuộm Band G để xác định cơ sở di truyền tế bào trong lai tạo giống vật nuôi [7]

Ở Việt Nam kĩ thuật karyotype còn đang được nghiên cứu và bước đầu ứng dụng để chuẩn đoán cho thai nhi Điển hình có: nghiên cứu của Phùng Như

Toàn (2004), “ Khảo sát Karyotype thai nhi qua nuôi cấy tế bào ối trong chẩn

đoán trước sinh” [14], cùng với nghiên cứu của Đặng Thị Nhâm (2011), “ Phân tích bộ nhiễm sắt thể (Karyotype) ở những cặp vợ chồng sẩy thai liên tiếp và con

bị dị tật bẩm sinh ” bằng cách phối hợp nhiều phương pháp khác nhau như: nuôi

cấy tế bào bạch cầu lympho máu ngoại vi của Hungerford D.A (1965), phương pháp nhuộm băng theo Seabright M (1971), phương pháp phân tích nhiễm sắc thể và lập karyotype: theo tiêu chuẩn ISCN (2005) [8]

Trên đối tượng thực vật có nghiên cứu của Vũ Thị Hạnh (2001) về kiểu

nhân của một số loài trong chi Ráy (Alocasia) và chi Khoai môn (Colocasia), nghiên cứu của Võ Thị Kim Diệp (2007) “ Đa dạng kiểu nhân của một số loài

trong chi Hành ” [2]

Tuy nhiên, cho đến nay tại Việt Nam vẫn chưa có một nghiên cứu nào về mặt di truyền đối với tỏi Lý Sơn

1.3 Một số khái niệm

Với vấn đề nghiên cứu kiểu nhân (karyotype) thì ở nước ta các khái niệm

về kiểu nhân, nhân đồ, NST đồ cũng đã được định nghĩa trong một số tài liệu như: Di truyền học, Phân loại thực vật học…

Theo định nghĩa của Di truyền học thì kiểu nhân (karyotype) là tập hợp tất

cả các thể nhiễm sắc ở trung kỳ (kì giữa) phân chia của một tế bào và ở hầu hết các sinh vật các tế bào có cùng một kiểu nhân [3]

Trong Phân loại thực vật học kiểu nhân (karyotype) là tập hợp tất cả các đặc tính số lượng, chất lượng của bộ NST (Số lượng, kích thước, hình thái và

cấu trúc NST) Nhân đồ (karyogram) là hình ảnh cụ thể của chính bộ NST được sắp xếp theo một thứ tự nhất định từng đôi tương đồng một từ NST tâm giữa, tâm lệch đến tâm mút Nhiễm sắc thể đồ (idiogram) là dựa vào nhân đồ rồi mô hình hóa lên bằng các đường thẳng có chiều dài, chiều rộng cũng như vị trí tâm động tương ứng với NST thực như trên nhân đồ [13]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tương nghiên cứu

Tỏi Lý Sơn (Allium sativum) tại đảo Lý Sơn, tỉnh Quảng Ngãi thuộc chi Hành (Allium), họ Hành (Alliaceae)

Trong nghiên cứu sử dụng 2 dạng tỏi Lý Sơn bao gồm: Tỏi cô đơn và tỏi nhiều tép

Riêng đối với tỏi cô đơn sử dụng trong phân tích bao gồm 2 loại mẫu: mẫu rễ thu được trong điều kiện trồng tự nhiên và mẫu callus đang nuôi cấy tại phòng Công nghệ sinh học, trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng

Hình 2.1 Mẫu rễ tỏi cô đơn

Hình 2.2 Mẫu callus mới phát sinh Hình 2.3 Mẫu callus cấy chuyển nhiều lần

2.2 Thời gian nghiên cứu

Đề tài được tiến hành từ tháng 11/2012 đến 5/2013

2.3 Địa điểm nghiên cứu

Phân tích NST được tiến hành tại phòng thí nghiệm bộ môn Di truyền Khoa Sinh – Môi Trường, trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp nghiên cứu NST

a Cách xử lý mẫu

- Mẫu rễ

+ Thu rễ: Trồng trên đất cát ẩm khoảng 2-3 ngày đến khi rễ ra dài khoảng

2 cm, cắt lấy đoạn đầu rễ dài 1-1,5 cm, rửa sạch, thấm khô, chuyển vào dung dịch tiền cố định

+ Tiền cố định: Tiền cố định bằng 8-hydroxyquinoline 0,002M theo các cách:

 Cách 1: 2h ở nhiệt độ phòng và chuyển vào tủ lạnh trong 3h

 Cách 2: 3h ở nhiệt độ phòng và chuyển vào tủ lạnh trong 2h

 Lấy rễ từ dung dịch tiền cố định, rửa sạch bằng nước cất thấm khô

 Chuyển vào dung dịch cố định Carnua (3:1), để qua ít nhất 1 đêm mới

sử dụng

+ Làm mềm rễ

 Rễ đem ra rửa sạch trong nước cất, ngâm trong vài phút, sau đó thấm khô, làm mềm trong dung dịch HCl trong 10 phút ở 60oC trong nồi cách thủy Dung dịch HCl được thử nghiệm với các nồng độ 1N; 1,5N; 2N

+ Nhuộm NST

 Rễ đã làm mềm rửa nhanh qua nước cất, thấm khô và nhuộm trong dung dịch Schiff trong 30-40 phút

 Nhuộm phụ rễ trong dung dịch Carmin acetic từ 5-10 phút

+ Nhỏ một giọt dung dịch acetic 45% lên lát cắt mẫu và đậy lamen

+ Hơ nóng nhẹ lam kính lên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi mẫu chuyển sang màu đỏ

+ Đặt lam kính lên trên mặt phẳng dùng đầu bút chì gõ nhẹ và thẳng đứng lên trên lamen để dàn mỏng mẫu

- Mẫu callus

+ Dùng kim mũi mác lấy nhẹ một ít phần callus bên ngoài bắt màu đậm đặt lên lam kính sạch rồi nhỏ một giọt dung dịch acetic 45% lên lát cắt mẫu và đậy lamen Hơ nóng nhẹ lam kính lên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi mẫu chuyển sang màu đỏ, dàn mỏng mẫu và tiến hành quan sát

- Kích thước lá

+ Đo chiều dài thân và lá (cm)

- Số lượng căn và dạng căn

+ Đếm số lượng căn

+ Dạng căn: hình cầu, hình chóp,…

2.4.3 Phương pháp xây dựng kiểu nhân

a Đo NST để thu thập số liệu về hình thái NST

- Các NST được đo trực tiếp bằng compa kĩ thuật trên ảnh chụp NST đã phóng đại, các phép đo đối với mỗi NST về chiều dài cánh: cánh dài (p), cánh ngắn (q) và thể kèm (Ls) được minh họa theo hình vẽ dưới

- Tỉ lệ cánh được xác định theo công thức sau:

Chiều dài cánh dài NST p

Chiều dài cánh ngắn NST q

b Phân loại NST

Phân loại hình thái dựa vào vị trí tâm động và tỉ lệ cánh (R)

Phân loại NST được tiến hành theo Levan (1964), cho trên bảng sau:

Vị trí tâm động Tỉ lệ cánh (R) Phân loại NST

Vùng gần giữa 1,7 – 3 Sm: Tâm lệch giữa

c Thiết lập Nhân đồ (Karyogram) và NST đồ (Idiogram)

Nhân đồ và NST đồ được xây dựng trên số lượng, hình thái NST và số đo chiều dài tương đối, tỉ lệ cánh Các cặp NST trong Karyogram và Idiogram được sắp xếp theo giá trị tăng dần về chiều dài trung bình NST

2.4.4 Phương pháp xử lí số liệu

Xử lí các số liệu hình thái NST được tính toán thống kê và vẽ biểu đồ bằng chương trình Excel 2007, phần mềm Photoshop CS 5.0 thực hiện trên máy

vi tính

CHƯƠNG 3: NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Kết quả khảo sát các công thức làm tiêu bản kiểu nhân (karyotype)

Kết quả khảo sát các cách tiền cố định bằng dung dịch 8-hydroxyquinon

và kết quả khảo sát các nồng độ HCl giai đoạn thủy phân mẫu thể hiện lần lượt trên 2 bảng 3.1 và 3.2

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát các cách tiền cố định bằng 8-hydroxyquinon

bằng 8-hydroxyquinon 0,002M Kết quả khảo sát

Đánh giá kết quả

1 2h nhiệt độ phòng + 3h trong tủ

lạnh

NST bắt màu tốt, hình thái NST rõ rang

++

2 3h nhiệt độ phòng + 2h trong tủ

lạnh

NST bắt màu tốt, hình thái NST rõ rang

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát nồng độ dung dịch HCl thủy phân mẫu

Cách Thủy phân mẫu

bằng dung dịch HCl Kết quả khảo sát

Đánh giá kết quả

NST tách rời tốt, tiêu bản tốt, khi dàn mỏng các tế bào nằm trên 1 mặt phẳng  dễ quan sát

+++

2 HCl 1,5N Bắt màu tốt hơn ở HCl 1N

NST tách rời tốt hơn ở HCl 1N Tiêu bản không tốt, khi dàn mỏng các tế bào bị biến dạng, kết dính hoặc chồng lớp lên nhau  khó quan sát

++

3 HCl 2N Bắt màu tốt hơn ở HCl 1N

Tiêu bản không tốt, khi dàn mỏng các tế bào bị biến dạng, kết dính hoặc chồng lớp lên nhau  khó quan sát

+

Chú thích: (-): Xấu (+): Trung bình (++): Tốt (+++): Rất tốt

Trong giai đoạn tiền cố định, kết quả khảo sát cho thấy xử lý bằng dung dịch 8 – hydroxyquinon 0,002M trong 3h nhiệt độ phòng và 2h tiếp theo trong tủ lạnh cho mẫu tiêu bản kiểu nhân tốt nhất (hình thái NST rõ và bắt màu tốt nhất)

Như vậy, trong giai đoạn này thời gian ngâm mẫu trong dung dịch tiền cố định và nhiệt độ xử lý có ảnh hưởng khá rõ rệt đến độ bắt màu và hình thái NST

Trong giai đoạn thủy phân mẫu, kết quả khảo sát cho thấy khi xử lý mẫu bằng dung dịch HCl ở 3 nồng độ 1N, 1,5N, 2N thì tại nồng độ HCl 1N cho tiêu bản kiểu nhân tốt nhất (các chiếc NST tách rời tốt nhất) Kết quả này đúng với phương pháp làm tiêu bản kiểu nhân được trình bày trong quyển Thực hành tế bào thực vật của Pause Z P (1974) [23] Kết quả này cho thấy nồng độ dung dịch HCl có ảnh hưởng quan trọng đến khả năng tách rời các chiếc NST và độ bền của tế bào thực vật