hiệu quả đường gluocse, acid acetic đến khả năng tăng sinh của vi khuẩn pseudomonas stutzeri d3b, bacillus subtilis tgt.013l và ứng dụng vi khuẩn trong xử lý nước rỉ rác và nước thải chăn nuôi heo

Hiệu quả nguồn carbon đến khả năng tăng sinh của vi khuẩn chuyển hóa nitơ Pseudomonas stutzeri dòng D3b và vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus subtilis dòng TGT.013L trong nước rỉ rác .

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-o0o -

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HIỆU QUẢ ĐƯỜNG GLUOCSE, ACID ACETIC ĐẾN

KHẢ NĂNG TĂNG SINH CỦA VI KHUẨN

Pseudomonas stutzeri D3b, Bacillus subtilis TGT.013L

VÀ ỨNG DỤNG VI KHUẨN TRONG XỬ LÝ

NƯỚC RỈ RÁC VÀ NƯỚC THẢI CHĂN NUÔI HEO

MSSV: 3096833 LỚP: CNSH TT 35

Cần Thơ, Tháng 11/2013

PHẦN KÝ DUYỆT

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

PGs.Ts Trương Trọng Ngôn

Đặc biệt, tôi xin dành lời cảm ơn chân thành đến thầy Gs.Ts Cao Ngọc Điệp đã

đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất, chỉ dạy tôi nhiều kiến thức khoa học trong quá trình học tập, cung cấp cho tôi những tài liệu cập nhật và chính xác

để tôi nhìn nhận, phát hiện những nội dung mà đồ án tốt nghiệp của tôi đề cập dưới sự hướng dẫn của Thầy

Tôi xin cám ơn chị Trần Thị Giang và chị Nguyễn Thị Xuân Mỵ - cán bộ phòng thí nghiệm Vi sinh vật Môi trường và Vi sinh vật Đất cùng quý thầy cô, anh chị cán bộ các phòng thí nghiệm của Viện NC&PT CNSH đã hỗ trợ, đóng góp ý kiến và tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện tốt đề tài này

Xin chân thành cám ơn các anh chị học viên cao học, các bạn học viên của phòng thí nghiệm đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình và người thân đã động viên, khích lệ và luôn ủng hộ tôi về mặt vật chất cũng như tinh thần trong suốt thời gian qua để tôi vững tin thực hiện đề tài

Tôi xin kính chúc quý Thầy Cô cùng các bạn sinh viên luôn dồi dào sức khỏe, công tác tốt

Xin chân trọng cám ơn!

Cần Thơ, ngày…… tháng… năm 2013

Nguyễn Văn Lượng

TÓM LƯỢC

Nước rỉ rác và nước thải chăn nuôi heo chứa hàm lượng chất ô nhiễm rất cao đặc biệt là hàm lượng ammonium và lân hòa tan (orthophosphate) góp phần gây ô nhiễm môi trường Vì vậy việc xử lí ammonium và orthophosphate trong nước rỉ rác và nước

thải chăn nuôi trước khi thải ra môi trường là điều rất cần thiết Đề tài “Hiệu quả đường glucose, acid acetic đến khả năng tăng sinh của vi khuẩn Pseudomonas stutzeri B3b, Bacillus subtilis TGT.013L và ứng dụng vi khuẩn trong xử lý nước rỉ rác và nước thải chăn nuôi heo” được thực hiện

Thí nghiệm sử dụng vi khuẩn khử đạm Pseudomonas stutzeri dòng D 3 b và vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus subtilis dòng TGT.013L với nguồn carbon là glucose (5 g/L) và acid acetic (1 mL/L) với tỉ lệ khác nhau được tiến hành Kết quả chỉ ra rằng mật số vi khuẩn chuyển hoá nitơ và vi khuẩn tích luỹ phosphate đều đạt mật số cao nhất với các nghiệm thức: NT4 (50% glucose – 50% acid acetic); NT5 (75% glucose – 25% acid acid acetic) và NT6 (100% glucose) Khi áp dụng ba nghiệm thức này vào xử lý nước rỉ rác và nước thải chăn nuôi heo trên mô hình 1 lít; kết quả sau 48 giờ xử lý hiệu suất khử đạm nước rỉ rác và nước thải chăn nuôi heo lần lượt ở các nghiệm thức là NT4: 91,25% và 77,31%; NT5: 98,73% và 63,14%; NT6: 99,58% và 98,00% Hiệu suất khử lân nước rỉ rác và nước thải chăn nuôi heo lần lượt là NT4: 100% và 99,49%; NT5: 100% và 100%; NT6: 100% và 100% Khi chuyển sang thể tích lớn hơn với mô hình 8 lít thì kết quả thu được sau 48 giờ xử lý như sau: hiệu suất khử đạm nước rỉ rác và nước thải chăn nuôi lần lượt là: NT4: 71,90% và 92,14%; NT5: 80,92% và 93,34%; NT6: 96,81% và 93,42% Hiệu suất khử lân nước rỉ rác và nước thải chăn nuôi heo lần lượt

là NT4: 85,36% và 61,29%; NT5: 99,10% và 96,25%; NT6: 99,13% và 88,32% Tuy nhiên sau 3 lần thay 50% nước thì hiệu suất xử lý ở 3 nghiệm thức sau 48 giờ là khác biệt không nhiều

Từ khoá: acid acetic, ammonium, Bacillus subtilis glucose, nước rỉ rác, nước thải

chăn nuôi heo, phosphate, Pseudomonas stutzeri

MỤC LỤC

PHẦN KÝ DUYỆT ii

LỜI CẢM TẠ iii

TÓM LƯỢC iv

DANH SÁCH HÌNH ix

DANH SÁCH BẢNG xi

CÁC TỪ VIẾT TẮT xii

CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về nước rỉ rác và nước thải chăn nuôi heo 3

2.1.1 Cơ chế phát sinh nước rỉ rác 3

2.1.2 Phân loại nước rác 4

2.1.3 Đặc tính nước rác 4

2.1.4 Sơ lược về nước thải chăn nuôi 6

2.2 Quá trình cố định nitơ phân tử 7

2.2.1 Sự đồng hóa nitrogen 7

2.2.2 Quá trình nitrate hóa 8

2.2.3 Quá trình phản nitrate hóa 9

2.3 Sơ lược về vi khuẩn chuyển hóa nitơ Pseudomonas stutzeri 10

2.4 Sơ lược về quá trình loại bỏ phospho sinh học 12

2.4.1 Quá trình loại bỏ phospho sinh học 13

2.4.2 Poly-P 14

2.5 Vi khuẩn tích lũy phosphate (PAOs) 15

2.6 Chuyển hóa và điều hòa sự trao đổi chất trong PAOs 17

2.6.1 Trao đổi chất với nguồn carbon là acetate 17

2.6.2 Trao đổi chất với nguồn carbon khác 18

2.6.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ giữa hàm lượng carbon và phosphate trên khả năng đồng hóa và dị hóa poly-P 18

2.6.4 Ảnh hưởng pH đến quá trình đồng hóa và dị hóa poly-P và acetate 20

2.7 Các nghiền cứu liên quan 21

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

3.1 Thời gian và địa điểm 22

3.1.1 Thời gian nghiền cứu 22

3.1.2 Địa điểm nghiền cứu 22

3.2 Phương tiện thí nghiệm 22

3.2.1 Vật liệu 22

3.2.2 Dụng cụ, trang thiết bị 22

3.2.3 Hóa chất 22

3.3 Phương pháp nghiền cứu 23

3.3.1 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn 23

3.3.2 Tiến hành thí nghiệm 25

3.3.3 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu hóa lý 29

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

4.1 Thí nghiệm 1: Hiệu quả đường glucose, acid acetic đến khả năng tăng sinh của vi khuẩn Pseudomonas stutzeri dòng D3b và vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus subtilis dòng TGT.013L trong nước rỉ rác và nước thải chăn nuôi heo trên mô hình bình tam giác 0,5 lít/đơn vị thí nghiệm 36

4.1.1 Hiệu quả nguồn carbon đến khả năng tăng sinh của vi khuẩn chuyển hóa nitơ Pseudomonas stutzeri dòng D3b và vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus subtilis dòng TGT.013L trong nước rỉ rác 36

4.1.2 Hiệu quả nguồn carbon đến khả năng tăng sinh của vi khuẩn chuyển

hóa nitơ Pseudomonas stutzeri dòng D3b và vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus subtilis dòng TGT.013L trong nước thải chăn nuôi

heo 41

4.2 Thí nghiệm 2: Hiệu quả xử lý nitơ, phospho trong nước rỉ rác và nước

thải chăn nuôi heo với vi khuẩn chuyển hóa nitơ Pseudomonas stutzeri dòng D3b, vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus subtilis dòng TGT.013L,

nguồn carbon và giá thể trên mô hình bình 1 lít 44

4.2.1 Hiệu quả xử lý nitơ, phospho trong nước rỉ rác với vi khuẩn chuyển

hóa nitơ Pseudomonas stutzeri dòng D3b, vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus subtilis dòng TGT.013L, nguồn carbon và giá thể trên mô

hình bình 1 lít 45

4.2.2 Hiệu quả xử lý nitơ, phospho trong nước nước thải chăn nuôi heo với

vi khuẩn chuyển hóa nitơ Pseudomonas stutzeri dòng D3b, vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus subtilis dòng TGT.013L, nguồn carbon và

giá thể trên mô hình bình 1 lít 48

4.3 Thí nghiệm 3: Hiệu quả xử lý nitơ, phospho trong nước rỉ rác và nước

thải chăn nuôi heo với vi khuẩn chuyển hóa nitơ Pseudomonas stutzeri dòng D3b, vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus subtilis dòng TGT.013L,

nguồn carbon và giá thể trên mô hình bình 8 lít 51

4.3.1 Hiệu quả xử lý nitơ, phospho trong nước rỉ rác với vi khuẩn chuyển

hóa nitơ Pseudomonas stutzeri dòng D3b, vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus subtilis dòng TGT.013L, nguồn carbon và giá thể trên mô

hình bình 8 lít 51

4.3.2 Hiệu quả xử lý nitơ, phospho trong nước thải chăn nuôi heo với vi

khuẩn chuyển hóa nitơ Pseudomonas stutzeri dòng D3b, vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus subtilis dòng TGT.013L, nguồn carbon và giá

thể trên mô hình bình 8 lít 54

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 5.1 Kết luận 58

5.2 Đề nghị 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

PHỤ LỤC I

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1 Một số dạng khuẩn lạc của Pseudomonas stutzeri 12

Hình 2 Cấu trúc chuỗi poly-P 14

Hình 3 Ảnh chụp dưới kính hiển vi điện tử Burkholderia cepacia, các chấm

đen là hạt poly-P 14 Hình 4 Mô tả các đặc điểm sinh hóa chính trong quá trình EBPR Sự chuyển

đổi kiểu trao đổi chất xảy ra dưới điều kiện kỵ khí và hiếu khí 17 Hình 5 Mối tương quan giữa tốc độ hấp thu phosphate và hàm lượng COD

ngoại bào 19 Hình 6 Phương pháp đếm sống 30 Hình 7 Ảnh hưởng nguồn carbon đến mật số vi khuẩn chuyển hóa nitơ

Pseudomonas stutzeri (D3b) trong nước rỉ rác 36

Hình 8 Ảnh hưởng nguồn carbon đến mật số vi khuẩn tích lũy phosphate

Bacillus subtilis (TGT.013L) trong nước rỉ rác 38

Hình 9 Ảnh hưởng nguồn carbon với vi khuẩn chuyển hóa nitơ Pseudomonas

stutzeri (D3b) và vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus subtilis

(TGT.013L) lên giá trị pH nước rỉ rác 40 Hình 10 Ảnh hưởng nguồn carbon đến mật số vi khuẩn chuyển hóa nitơ

Pseudomonas stutzeri (D3b) trong nước thải chăn nuôi heo 42

Hình 12 Ảnh hưởng nguồn carbon với vi khuẩn chuyển hóa nitơ

Pseudomonas stutzeri (D3b) và vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus subtilis (TGT.013L) lên giá trị pH nước thải chăn nuôi heo 44

Hình 13 Ảnh hưởng nguồn carbon với vi khuẩn chuyển hóa nitơ

Pseudomonas stutzeri (D3b), vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus subtilis (TGT.013L) và giá thể lên hàm lượng ammonium trong nước

rỉ rác 45 Hình 14 Ảnh hưởng nguồn carbon với vi khuẩn chuyển hóa nitơ

Pseudomonas stutzeri (D3b), vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus subtilis (TGT.013L) và giá thể lên hàm lượng orthophosphate trong

nước rỉ rác 46 Hình 15 Ảnh hưởng nguồn carbon với vi khuẩn chuyển hóa nitơ

Pseudomonas stutzeri (D3b), vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus

subtilis (TGT.013L) và giá thể lên giá trị pH trong nước rỉ rác Sự

biến động giá trị pH nước rỉ rác theo thời gian 48 Hình 16 Ảnh hưởng nguồn carbon với vi khuẩn chuyển hóa nitơ

Pseudomonas stutzeri (D3b), vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus subtilis (TGT.013L) và giá thể lên hàm lượng ammonium trong nước

thải chăn nuôi heo 49 Hình 17 Ảnh hưởng nguồn carbon với vi khuẩn chuyển hóa nitơ

Pseudomonas stutzeri (D3b), vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus subtilis (TGT.013L) và giá thể lên hàm lượng orthophosphate trong

nước thải chăn nuôi heo 50 Hình 18 Ảnh hưởng nguồn carbon với vi khuẩn chuyển hóa nitơ

Pseudomonas stutzeri (D3b), vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus subtilis (TGT.013L) và giá thể lên giá trị pH trong nước thải chăn

nuôi heo 51 Hình 19 Ảnh hưởng nguồn carbon với vi khuẩn chuyển hóa nitơ

Pseudomonas stutzeri (D3b), vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus subtilis (TGT.013L) và giá thể lên hàm lượng ammonium trong nước

rỉ rác 52 Hình 20 Ảnh hưởng nguồn carbon với vi khuẩn chuyển hóa nitơ

Pseudomonas stutzeri (D3b), vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus subtilis (TGT.013L) và giá thể lên hàm lượng orthophosphate trong

nước rỉ rác 53 Hình 21 Ảnh hưởng nguồn carbon với vi khuẩn chuyển hóa nitơ

Pseudomonas stutzeri (D3b), vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus subtilis (TGT.013L) và giá thể lên giá trị pH trong nước rỉ rác 54

Hình 22 Ảnh hưởng nguồn carbon với vi khuẩn chuyển hóa nitơ

Pseudomonas stutzeri (D3b), vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus subtilis (TGT.013L) và giá thể lên hàm lượng ammonium trong nước

thải chăn nuôi heo 55 Hình 23 Ảnh hưởng nguồn carbon với vi khuẩn chuyển hóa nitơ

Pseudomonas stutzeri (D3b), vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus

subtilis (TGT.013L) và giá thể lên hàm lượng orthophosphate trong

nước thải chăn nuôi heo 56 Hình 24 Ảnh hưởng nguồn carbon với vi khuẩn chuyển hóa nitơ

Pseudomonas stutzeri (D3b), vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus subtilis (TGT.013L) và giá thể lên giá trị pH trong nước thải chăn

nuôi heo 57

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm trên mô hình 0,5 lít với nguồn carbon là glucose

và acetate với hàm lượng vi khuẩn là 5% 25

Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm trên mô hình 0,5 lít với nguồn carbon là glucose và acetate với hàm lượng vi khuẩn là 5% 26

Bảng 3.3: Thành phần hóa chất trong dãy đường chuẩn đo đạm NH4+ 31

Bảng 3.4: Phương trình đường chuẩn NH4+ 32

Bảng 3.5: Thành phần hóa chất trong dãy đường chuẩn đo lân PO43- 33

Bảng 3.6: Giá trị giới hạn các thông số và nồng độ chất ô nhiễm theo QCVN 40:2011/BTNMT 34

Bảng 3.7: Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về chất lượng nước mặt Quyết định số16/2008/QĐ-BTNMT do Bộ trưởng Bộ Tài nguyên và Môi trường ban hành ngày 31 tháng 12 năm 2008 35

CÁC TỪ VIẾT TẮT

ANAMOX: Anaerobic ammonium oxidation-oxy

BOD: Biological oxygen demand

COD: Chemical oxygen demand

CCCP: carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone

ĐBSCL: Đồng Bằng Sông Cửu Long

DPAOs: Denitrifying polyphosphate accumulating organisms

EBPR: Enhanced biological phosphorus removal

GAOs: glycogen accumulating organisms

SEM: Scanning electron microscopy

TEM: Transmission electron microscopy

VFAs: Volatile fatty acids

CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1 Đặt vấn đề

Theo số liệu tại Hội thảo "Công nghệ xử lý và quản lý chất thải rắn" tại Cần Thơ tháng 3-2013 cho thấy, hằng năm, tại đồng bằng sông Cửu Long (ÐBSCL) phát sinh hơn 600 nghìn tấn chất thải rắn thông thường và khoảng 47 triệu m3 chất thải rắn công nghiệp, hầu hết đều chưa được quản lý và xử lý triệt để trước khi đưa ra môi trường Dự báo đến năm 2015, tổng khối lượng chất thải rắn phát sinh tại các tỉnh, thành phố thuộc ÐBSCL là khoảng 5.000 tấn/ngày và sẽ tăng lên đến gần 8.000 tấn/ngày vào năm 2020 Riêng thành phố Cần Thơ, hiện toàn bộ chất thải rắn sinh hoạt thu gom được xử lý bằng cách chôn lấp tại bãi rác Tân Long (20 ha, Hậu Giang) và bãi rác Ô Môn (4ha ở Q Ô Môn, TP Cần Thơ) Trong khi theo Công ty Công trình đô thị Cần Thơ, bãi rác tại Q Ô Môn hiện đã lấp đầy khoảng 95% và đang quá tải Hiện lượng rác đã đổ tại bãi rác Tân Long khoảng 700.000 tấn và phải tiếp nhận 450-500 tấn rác/ngày đêm của cả TP Cần Thơ và tỉnh Hậu Giang (hầu hết rác là của TP Cần Thơ) Với lượng rác khổng lồ như thế, bãi chôn lấp rác trở thành nơi bị ô nhiễm nghiêm trọng bởi một lượng nước rỉ rác khổng lồ có hàm lượng ô nhiễm hữu cơ cao do đó vùng đất này trở thành vùng đất chết Nước thải từ rác ở các khu xử lý rác chứa hàm lượng chất hữu cơ, nitơ, phospho cao đã

và đang gây nguy hại đối với môi trường và sức khỏe con người (Nguyễn Thành Nhân, 2008) Vì thế, việc xử lý lượng nước rỉ rác là một trong những vấn đề quan trọng và cấp thiết hiện nay

Trong thời gian qua, các nghiên cứu về vấn đề xử lý nước rỉ rác mang tính hiệu quả đã và đang được thực hiện ở trong và ngoài nước Để có thể xử lý đồng thời các loại chất hữu cơ, phospho và nitơ có trong nước rác, cần phải kết hợp đúng đắn giữa công đoạn xử lý sinh vật với công đoạn xử lý hóa lý Hiện nay, việc ứng dụng vi khuẩn tích lũy phosphate (Polyphosphate accumulating organisms – PAOs) thông qua quá trình EPBR, vi khuẩn nitrate hóa và khử nitrate hóa để xử lý đồng thời các chất hữu cơ, phospho, nitơ có trong nước rác hiện nay được áp dụng rộng rãi trong các biện pháp sinh học Tuy nhiên quá trình xử lý đã gặp nhiều gián đoạn và đi đến thất bại Hàng loạt các nghiên cứu đã được thực hiện để tìm ra nguyên nhân Trong số rất nhiều các nguyên nhân được đưa ra thì nguồn carbon bổ sung là yếu tố đang được chú ý nhất Các nghiên cứu cho thấy rằng khi nguồn carbon bổ sung chủ yếu là acetate hoặc propionate thì quá

trình xử lý hoạt động rất hiệu quả, tuy nhiên với nguồn carbon chủ yếu là glucose thì quá trình bị gián đoạn và đi đến thất bại Ngược lại, một số báo cáo khác cũng cho thấy ảnh hưởng tăng cường của glucose đến quá trình xử lý Để giải quyết tốt vấn đề trên thì cần phải hiểu rõ cơ chế hoạt động của EPBR và khả năng khử đạm của vi khuẩn bằng

biện pháp sinh học Vì thế đề tài “Hiệu quả đường glucose, acid acetic đến khả năng

tăng sinh của vi khuẩn Pseudomonas stutzeri dòng B3b, Bacillus subtilis dòng

TGT.013L và ứng dụng vi khuẩn trong xử lý nước rỉ rác và nước thải chăn nuôi heo” được tiến hành nhằm khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn carbon đến sự phát triển

của vi khuẩn và tìm ra phương pháp tối ưu trong việc sử dụng hiệu quả nguồn carbon

để tăng hiệu quả xử lý nước thải

1.2 Mục tiêu đề tài

- Xác định được tỷ lệ đường glucose và acid acetic thích hợp nhất cho sự sinh

trưởng của vi khuẩn chuyển hóa nitơ Pseudomonas stutzeri dòng D3b và vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus subtilis dòng TGT.013L trong nước rỉ rác và nước thải chăn nuôi

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về nước rỉ rác và nước thải chăn nuôi heo

2.1.1 Cơ chế phát sinh nước rỉ rác

Nước rỉ rác từ các bãi chôn lấp có thể được định nghĩa là chất lỏng thấm qua các lớp chất thải rắn mang theo các chất hòa tan hoặc các chất lơ lửng Trong hầu hết các bãi chôn lấp nước rỉ rác bao gồm chất lỏng đi vào bãi chôn lấp từ các nguồn bên ngoài, như nước mặt, nước mưa, nước ngầm và chất lỏng tạo thành trong quá trình phân hủy

các chất thải Đặc tính của chất thải phụ thuộc vào nhiều hệ số

Nước rác được hình thành từ 5 nguồn chính sau đây:

Khả năng giữ nước của nguyên liệu lấp đất có nước mưa thấm vào khu chôn rác

và hàm lượng nước có trong rác thải vượt quá mức cho phép sẽ đi qua tầng rác thải dị tính (inhomogeneous) sinh ra các vật chất gây ô nhiễm; đồng thời do rác thải bên trong khu chôn lấp bị phân huỷ nên hiện tượng này xảy ra liên tục hơn và làm xuất hiện nước rác Nước rác được sinh ra có trạng thái khác nhau tuỳ theo thành phần rác thải chôn, hàm lượng nước của tầng rác thải, số năm sau khi chôn, lượng nước mưa, điều kiện thiết

kế bãi chôn lấp

Một số đặc điểm của nước rác: sau khi chôn rác được khoảng 2-3 năm, nước rác

có nồng độ đạt chỉ số tối đa, sau đó có khuynh hướng giảm dần - nghĩa là: khoảng 233 năm sau khi chôn, nồng độ chất hữu cơ có trong nước rác tăng cao, nhu cầu oxy hóa học (COD) là khoảng 10.000~30.000 mg/l, tỷ lệ nhu cầu oxy sinh hóa/ nhu cầu oxy hóa học (BOD/COD) cũng ở mức khoảng 0,4-0,8 Quá trình tự phân huỷ khá đơn giản Thời gian chôn càng lâu, điều kiện trong bãi chôn lấp sẽ ở tình trạng kị khí bắt buộc (không sinh trưởng được trong môi trường có O2), COD giảm xuống còn 1.000-3.000mg/l, BOD/COD cũng ở dưới mức 0,4 Lúc này quá trình tự phân huỷ diễn ra phức tạp, đặc biệt thành phần nitơ trong nước rác cao dần, làm một số công đoạn chưa được xử lý phát

sinh Do đó, qua một thời gian dài sau khi chôn lấp rác thải, chúng đều mang đặc tính của loại nước rác không chứa thành phần có thể xử lý bằng phương pháp sinh học

2.1.2 Phân loại nước rác

Theo đặc điểm và tính chất, nước rác được phân ra làm 4 loại:

- Nước rác tươi – nước rỉ rác khi không có mưa;

- Nước rác khi có nước mưa: nước mưa thấm qua bãi rác và hoà lẫn nước rác; Theo đặc điểm hoạt động của bãi chôn lấp:

- Nước rác phát sinh từ các bãi chôn lấp cũ, đã đóng cửa hoặc ngừng hoạt động; thành phần và tính chất loại nước rác này phụ thuộc vào thời gian đã đóng bãi, mức độ phân huỷ các thành phần hữu cơ trong bãi rác

- Nước rác phát sinh từ các bãi chôn lấp đang hoạt động và vận hành;

2.1.3 Đặc tính của nước rác

 2.1.3.1 Đặc trưng pH

Giá trị pH nằm trong khoảng 7,0 – 9,5; giá trị thường gặp nằm trong vùng 7,6 – 8,6 thiên về tính kiềm Nước rác tuổi cao có giá trị pH lớn, về mùa khô giá trị pH cao hơn so với mùa mưa pH cao của nước rác là do các nguyên nhân: độ kiềm cao, quá trình phân hủy yếm khí sâu và do hoạt động của tảo ở các hồ trữ nước rác

 2.1.3.2 Đặc trưng của độ kiềm

Độ kiềm của nước rác gây ra chủ yếu bởi muối bicarbonate (pH < 8,2), một phần

do CO32- và OH- khi pH > 8,2 Sự biến động độ kiềm không theo quy luật nhất định Độ kiềm có khuynh hướng giảm vào mùa khô, rất có thể do quá trình thoát khí CO2 từ nước thải

 2.1.3.3 Cặn không tan

Nhìn chung lượng cặn không tan trong nước rác không lớn, thường nằm trong khoảng 100 – 200 mg/l Thành phần cặn không tan chủ yếu là chất hữu cơ: xác vi sinh vật và tảo Tuy hàm lượng cặn không cao (khối lượng riêng của chất hữu cơ thấp) nhưng

nó gây độ đục lớn vì chúng thường có màu sẫm

 2.1.3.4 Acid hữu cơ dễ bay hơi (VFAs)

Acid hữu cơ dễ bay hơi là sản phẩm trung gian của quá trình phân hủy yếm khí Chúng là acid béo có phân tử lượng thấp (C1 – C6) nên dễ bay hơi Acid hữu cơ dễ bay hơi hình thành trong quá trình acid hóa, do loại vi sinh vật yếm khí acidogens, từ các

sản phẩm của giai đoạn thủy phân trước đó Giai đoạn tiếp theo là sự hình thành khí metan từ các loại acid trên với khí hydro

 2.1.3.5 Nhu cầu oxy hóa học, độ oxy hóa

Nhu cầu oxy hóa học là đại lượng thể hiện nồng độ chất hữu cơ có thể oxy hóa được trong điều kiện phản ứng cụ thể

 2.1.3.6 Hợp chất nitơ

Trong nước rác, hợp chất nitơ có thể tồn tại ở các dạng khác nhau, là thành phần trong hợp chất hữu cơ (protein, acid amin), dạng amoniac/amoni, nitrite, nitrate Ngoài các dạng chính nêu trên, một số dạng khác có thể tồn tại trong nước rác như: NO, N2O,

N2

Chu trình biến đổi các hợp chất nitơ trong nước rác bao gồm: thủy phân các phân

tử hữu cơ lớn (protein) thành các acid amin và tiếp tục thành amoni Một phần amoni được vi sinh vật sử dụng để tổng hợp tế bào Trong các ao hồ có chứa đầy dủ các điều kiện thì xảy ra quá trình oxy hóa amoni thành nitrite, nitrate và khử nitrite, nitrate về khí

N2 (khử với chất hữu cơ hoặc với amoni) Trong quá trình thủy phân, xác vi sinh vật hoặc tảo lắng xuống đáy hồ và quá trình tiếp diễn cũng như trên

Khác với chu trình carbon, một phần lớn chất hữu cơ được tách loại khỏi môi trường nước rác trong quá trình chôn lấp và thu gom, hợp chất nitơ trong nước rác ít có điều kiện để thoát ra khỏi môi trường nước rác do sự hình thành khí N2 trong chu trình không thuận lợi

Do sự biến đổi nồng độ amoniac trong nước rác phụ thuộc vào các điều kiện: mức

độ pha loãng do mưa, mức độ phân hủy (tuổi của nước rác, điều kiện phân hủy) càng cao thì hàm lượng amoniac càng lớn và tỷ lệ giữa amoniac và nitơ tổng càng cao Nồng

độ nitrite, nitrate trong nước rác thấp (< 0,1 mg/l) do quá trình oxy hóa không có điều kiện thuận lợi để xảy ra

 2.1.3.7 Hợp chất phospho

Hàm lượng phosphate trong nước rác không cao, ngang với mức độ của nước thải sinh hoạt Nồng độ phosphate tính theo P của các mẫu khảo sát nằm trong khoảng 0,5 – 31,6 mg/l

 2.1.3.8 Thành phần vô cơ

Trong quá trình ủ rác hình thành một loạt các thành phần vô cơ cũng như chiết tách một số các chất vô cơ bám dính trên rác thải Các chất vô cơ có ảnh hưởng đáng kể đến

công nghệ xử lý nước rác bao gồm: Ca, Mg, Cl-, SO42-, HCO3- Các thành phần vô cơ tan tạo ra tổng chất tan (chủ yếu) của nước rác, quyết định độ dẫn điện và độ muối của nước rác

2.1.4 Sơ lược về nước thải chăn nuôi

Nước thải chăn nuôi là một loại nước thải rất đặc trưng và có khả năng gây ô nhiễm môi trường cao do có chứa hàm lượng cao các chất hữu cơ, cặn lơ lửng, N, P và vi sinh vật gây bệnh Theo kết quả điều tra đánh giá hiện trạng môi trường của Viện chăn nuôi (2006) cho thấy đặc điểm của nước thải chăn nuôi (Cao Đức Phát, 2010):

 Các chất hữu cơ: hợp chất hữu cơ chiếm 70–80% bao gồm cellulose, protit, acid

amin, chất béo, hidrat carbon và các dẫn xuất của chúng, thức ăn thừa Các chất vô cơ chiếm 20–30% gồm cát, đất, muối, ure, ammonium, muối chlorua, SO42-…

 N và P: khả năng hấp thụ N và P của các loài gia súc, gia cầm rất kém, nên khi

ăn thức ăn có chứa N và P thì chúng sẽ bài tiết ra ngoài theo phân và nước tiểu Trong nước thải chăn nuôi heo thường chứa hàm lượng N và P rất cao Hàm lượng N-tổng khoảng 200 – 350mg/l trong đó N-NH4 chiếm khoảng 80-90%; P-tổng = 60-100mg/l

 Sinh vật gây bệnh: Nước thải chăn nuôi chứa nhiều loại vi trùng, virus và trứng

ấu trùng giun sán gây bệnh

Trong những năm gần đây, ngành chăn nuôi lợn phát triển với tốc độ rất nhanh nhưng chủ yếu là tự phát và chưa đáp ứng được các tiêu chuẩn kỹ thuật về chuồng trại

và kỹ thuật chăn nuôi Do đó năng suất chăn nuôi thấp và gây ô nhiễm môi trường một cách trầm trọng Ô nhiễm môi trường không những ảnh hưởng đến sức khỏe vật nuôi, năng suất chăn nuôi mà còn ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe con người và môi trường sống xung quanh Mỗi năm ngành chăn nuôi gia súc gia cầm thải ra khoảng 75-85 triệu tấn phân, với phương thức sử dụng phân chuồng không qua xử lý ổn định và nước thải không qua xử lý xả trực tiếp ra môi trường gây ô nhiễm nghiêm trọng

Chất thải chăn nuôi tác động đến môi trường và sức khỏe con người trên nhiều khía cạnh: gây ô nhiễm nguồn nước mặt, nước ngầm, môi trường khí, môi trường đất và các sản phẩm nông nghiệp Đây chính là nguyên nhân gây ra nhiều căn bệnh về hô hấp, tiêu hoá, do trong chất thải chứa nhiều vi sinh vật gây bệnh, trứng giun tổ chức y tế thế giới (WHO) đã cảnh báo: nếu không có biện pháp thu gom và xử lý chất thải chăn nuôi một cách thỏa đáng sẽ ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe con người, vật nuôi và gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng Đặc biệt là các virus biến thể từ các dịch bệnh như lở

mồm long móng, dịch bệnh tai xanh ở lợn có thể lây lan nhanh chóng và có thể cướp đi sinh mạng của rất nhiều người

Cho đến nay, chưa có một báo cáo nào đánh giá chi tiết và đầy đủ về ô nhiễm môi trường do ngành chăn nuôi gây ra Theo báo cáo tổng kết của viện chăn nuôi, hầu hết các hộ chăn nuôi đều để nước thải chảy tự do ra môi trường xung quanh gây mùi hôi thối nồng nặc, đặc biệt là vào những ngày oi bức Nồng độ khí H2S và NH3 cao hơn mức cho phép khoảng 30-40 lần (Bùi Xuân An, 2007) Tổng số vi sinh vật và bào tử nấm cũng cao hơn mức cho phép rất nhiều lần Ngoài ra nước thải chăn nuôi còn có chứa Coliform, E.coli, COD , và trứng giun sán cao hơn rất nhiều lần so với tiêu chuẩn cho phép

Ô nhiễm môi trường khu vực trại chăn nuôi do sự phân huỷ các chất hữu cơ có mặt trong phân và nước thải của lợn Sau khi chất thải ra khỏi cơ thể của lợn thì các chất khí

đã lập tức bay lên, khí thải chăn nuôi bao gồm hỗn hợp nhiều loại khí trong đó có trên

40 loại gây mùi, chủ yếu là H2S và NH3 Trong điều kiện kỵ khí cộng với sự có mặt của

vi khuẩn trong phân và nước thải xảy ra quá trình khử các ion sunphát (SO42-) thành sunphua (S2-) Trong điều kiện bình thường thì H2S là một trong những nguyên nhân gây ra các vấn đề về màu và mùi Nồng độ S2- tại hố thu nước thải chăn nuôi lợn có thể lên đến 330 mg/l cao hơn rất nhiều so với tiêu chuẩn (theo TCVN 5945-2005 cột C nồng

độ sunfua là 1,0mg/l) (Bùi Xuân An, 2007)

Việc kiểm soát chất thải chăn nuôi là một nội dung cấp bách cần được các cấp quản lý, các nhà sản xuất và cộng đồng dân cư bắt buộc quan tâm để: hạn chế ô nhiễm môi trường, bảo vệ sức khỏe của con người, cảnh quan khu dân cư cũng như không kìm hãm sự phát triển của ngành

2.2 Quá trình cố định nitơ phân tử

2.2.1 Sự đồng hóa nitrogen

Những sinh vật tự dưỡng và dị dưỡng hấp thu và đồng hóa NH4+, NO3- Tế bào của thực vật và tảo hấp thu nitrogen tốt nhất ở hình thức NH4+ Sau khi hấp thụ, những tế bào này sẽ biến đổi NH4+, NO3- thành protein Để đồng hóa được 100 ĐVC, tế bào cần

10 đơn vị nitrogen (tỷ lệ C/N = 10) (Bitton, 2005)

Quá trình amon hóa protein là quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ chứa nitơ, giải phóng NH3 do nhiều vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí gây ra như vi khuẩn, nấm mốc

và xạ khuẩn (Bitton, 2005)

Tất cả các loài vi sinh vật amon hóa điều tiết ra enzym thủy phân protein ra ngoài môi trường làm cho protein bị phân cắt thành pepton, polypeptid, dipeptid và acid amin Các acid amin được đối tượng biến đổi trong tế bào thông qua con đường trao đổi năng lượng và trao đổi xây dựng, sản phẩm cuối cùng chủ yếu của quá trình vô cơ hóa hiếu khí protein là amonia, carbonic, các muối của acid sulfuric và acid phosphoric Trong điều kiện kỵ khí, các acid amin không được vô cơ hóa hoàn toàn, bên cạnh NH3 và CO2

còn tích lũy nhiều hợp chất hữu cơ khác như acid hữu cơ, rượu, H2S và những dẫn xuất của nó như mecaptan, các chất độc như diammine và tomain (độc tố thịt thối) các sản phẩm bốc mùi rất khó chịu như indol và scatol (Bitton, 2005)

Quá trình amon hóa protein giữ vai trò quan trọng trong việc khép kín vòng tuần hoàn nitơ vì quá trình này mà nitơ chuyển từ dạng khó hấp thu sang dạng muối amon dễ dàng được thực vật hấp thu

2.2.2 Quá trình nitrate hóa

Nitrate hóa là quá trình oxy hóa amonia và muối amonium hình thành acid nitrous (HNO2) và acid nitric (HNO3) Qua đó, vi sinh vật thu năng lượng cần thiết cho hoạt động sống của mình Vi sinh vật thực hiện quá trình oxy hóa này kèm theo sự đồng hóa

CO2 xây dựng các hợp chất hữu cơ của cơ thể chúng, chúng là vi khuẩn hóa tự dưỡng

và là những cơ thể hiếu khí bắt buộc

Quá trình này gồm 2 giai đoạn:

 Sự biến đổi amonia thành nitrite

(enzyme amoni monoxygenase xúc tác quá trình)

Phản ứng bao gồm

 Sự biến đổi nitrite – nitrate: enzyme xúc tác là oxidoreductase

Sự nitrate hóa được kiểm soát bởi nhiều nhân tố: nồng độ amonia/nitrite, nồng độ oxy, pH, nhiệt độ,…(Grady và Lim, 1980; Hawkes, 1983; Metcalf và Eddy, 1991) Sự nitrate hóa tự dưỡng chiếm ưu thế trong tự nhiên, bên cạnh đó sự nitrate hóa cũng được

NH3 + O2 + 2H+ NH2OH + H2O

NH2OH + H2O NO2- + 5H+

NH3 + 3/2O2 NO2- + H+ + H2O

-thực hiện bởi những vi khuẩn dị dưỡng (Arthrobacter) và nấm (Falih và Wainwright, 1995; Verstract và Alexander, 1972) Tuy nhiên sự nitrate hóa dị dưỡng cần năng lượng kém hơn sự nitrate hóa tự dưỡng (Barraclough và Puri, 1995)

2.2.3 Quá trình phản nitrate hóa

Trong điều kiện có không khí, các dạng nitơ hợp chất (NO3-, NO2-) bị phân hủy để tạo thành nitơ phân tử bởi các vi khuẩn khử nitrate (denitrifying bacteria), được gọi là quá trình phản nitrate hóa (quá trình khử nitrate) làm giảm lượng nitrate, khép kín và hoàn thiện vòng tuần hoàn nitơ

Sự khử đạm là một quá trình dị hóa của vi khuẩn trong việc oxy hóa hợp chất nitơ Những khí và những sản phẩm như: NO, N2O, và N2 được phóng thích kèm theo Trong môi trường, sự khử đạm phóng thích N2 Sự tích lũy của khí NO và NO2 gây hiệu ứng nhà kính dẫn đến sự hủy hoại tầng ozone Như vậy, vi khuẩn chuyển hóa nitơ loại bỏ hợp chất nitơ từ nước thải, nơi mà sự khử đạm được đi đôi với quá trình nitrate hóa Khả năng làm sạch môi trường ô nhiễm có thể đạt được dưới điều kiện khử đạm (Bracker et al., 1998)

Quá trình khử đạm được coi như là một tiến trình then chốt trong chu trình nitơ (Lee et al., 2002) Sự khử là một quá trình dị hóa làm giảm bớt nitrate và tạo ra sản phẩm cuối cùng là phân tử nitrogen (Throback et al, 2004) Theo Nguyễn Đức Lượng và Nguyễn Thị Thùy Dương (2003), Schloesing là người đầu tiên phát hiện ra hiện tượng khử nitrate và nitrite thành nitơ phân tử vào năm 1868

Quá trình này được xem như là sự tập hợp của sự hô hấp nitrate, nitrite kết hợp với

sự khử nitrite oxide và sự hô hấp nitrous oxide (Zumft, 1997):

Nitrate Nitrite Nitrite oxide Nitrous oxide Dinitrogen gas

(NO3- ) (NO2- ) (NO) ( N2O) (N2)

xử lý nguồn nước thải giàu nitơ Toàn bộ phản ứng dị hóa này là:

NH4+ + NO2- N2 + 2H2O

3NH4+ + 2NO3- 5/2 N2 + 6H2O

Sự khử nitrate được kiểm soát bởi các nhân tố: nồng độ nitrate, điều kiện thiếu oxy, pH, nhiệt độ, (Bames và Biliss, 1983; Hawkes, 1983a) Trong nước thải, sự khử nitrate hiệu quả nhất ở giá trị pH 7,0 – 8,5, tốt nhất ở pH = 7,0 và nhiệt độ 35 – 500C (Christensen và Harremoes, 1997; Metcalf và Eddy, 1991)

2.3 Sơ lược về vi khuẩn chuyển hóa nitơ Pseudomonas stutzeri

Pseudomonas stutzeri được phân lập lần đầu tiên bởi Burri và Stutzer (Burri và Stutzer, 1895), có tên gọi là Bacillus denitrificans II, sau đó được van Neil và Allen đổi tên thành Pseudomonas stutzeri (van Neil và Allen, 1952)

Theo hệ thống phân loại, Pseudomonas stutzeri thuộc:

Pseudomonas stutzeri là vi khuẩn không có sắc tố huỳnh quang, đây là đặc điểm

để phân biệt chúng với những thành viên khác của giống Pseudomonas (Rius et al.,

2001)

Pseudomonas stutzeri có phạm vi phân bố rất rộng: đất, ao nuôi, đầm lầy, biển

(Rossello – Mora et al., 1991; Rius et al., 2001; Sikorski et al., 2002), trong chất thải chăn nuôi (Hubalek et al., 1998; Su et al., 2001), hóa chất làm giấy (Vaisanen et al.,

1998), trong các mẫu bệnh lý (Rossello - Mora et al., 1994)

Pseudomonas stutzeri là vi khuẩn Gram âm, tế bào có dạng hình que, kích thước

khoảng 1-3μm x 0,5μm, di chuyển bằng một chiên mao đỉnh; trong những điều kiện xác

định, một hoặc hai chiên mao ngắn hơn có thể được hình thành(Guasp et al., 2000) Pseudomonas stutzeri có khả năng khử nitrate thành nitơ phân tử và được xem như vi

khuẩn đại diện cho những nghiên cứu về quá trình khử đạm (Zumft, 1997); có khả năng

tăng trưởng trong maltose và tinh bột (Bennasar et al., 1998; Sikorsky et al., 1999), cho

phản ứng dương tính với kiểm tra catalase và oxidase, phản ứng âm tính trong các kiểm

tra arginine dihydrolase và thủy phân glycogen (Lalucat et al., 2006) Pseudomonas stutzeri là loài không tạo ra sắc tố do có sự tập trung cao hàm lượng cytochrom c trong

tế bào Hàm lượng G + C trong DNA dao động từ 60 - 66 % mol (Palleroni et al., 1970; Rossello – Mora et al., 1991; Lalucat et al., 2006) Phương pháp lai DNA - DNA cho thấy có ít nhất 17 nhóm hệ gen (genomovar) đã được phân biệt (Lalucat et al., 2006)

Gần đây, vi khuẩn P stutzeri được phân lập từ phân heo (Su et al, 2001) P stutzeri có

khả năng khử nitơ theo nhiều con đường khác nhau khử nitrat thành N2 mà không có sự tích lũy nitrit, khử nitrat theo 2 bước ( khử NO3- thành NO2- và khử NO2- thành N2), khử nitrat với sự tích tụ nitrit ở nồng độ thấp (Su et al, 2001) Sự biến đổi nitrit là một bước quan trọng trong chu trình nitrogen, trong đó NO2 bị khử thành NO sau đó thành

N2 Hầu hết các enzyme khử nitơ của P stutzeri được nghiên cứu bao quát (Coyle et al,

1985; Heiss et al, 1989; Körner và Zumft et al, 1989) Enzyme khử nitrat và nitrit thể hiện khi nồng độ oxy hòa tan không vượt quá 5% và 2,5%, trong khi đó enzyme khử nitrous oxide hiện diện khi nồng độ oxy không cao hơn 5% (Körner và Zumft, 1989) Ở nồng độ oxy bảo hòa các chất nhận điện tử có nguồn gốc nitơ không bị ảnh hưởng trên

sự hiện diện enzyme khử nitơ của vi khuẩn P stutzeri Ở nồng độ oxy bão hòa 27%,

nitrat kích thích sự thể hiện hầu hết các enzyme khử nitrat và thể hiện đáng kể enzyme

khử nitrit, nitrous oxid (Körner và Zumft, 1989)

Các khuẩn lạc của Pseudomonas stutzeri có thể được phân biệt qua hình dạng không bình thường và độ sệt của chúng (hình 3) Khuẩn lạc của Pseudomonas stutzeri

thường dính nhau dày đặc, bề mặt nhăn nheo, gấp nếp, khô, cứng, có màu nâu sáng, không vàng (Rius et al., 2001) Có thể di chuyển dễ dàng khuẩn lạc ra khỏi bề mặt môi

trường Khuẩn lạc của Pseudomonas stutzeri có hình dạng không đồng nhất và không

ổn định, thay đổi theo thời gian Sau nhiều lần cấy chuyển trên môi trường phòng thí nghiệm, bề mặt khuẩn lạc trở nên trơn, láng và màu tái đi Sorokin et al (1999) đã mô

tả chi tiết về hình thái khuẩn lạc, sự khác nhau giữa các khuẩn lạc có bề mặt trơn láng (kiểu S) và sần sùi (kiểu R) Khuẩn lạc kiểu R thì ổn định, còn khuẩn lạc kiểu S dưới những điều kiện thích hợp có khả năng tạo ra cả hai kiểu khuẩn lạc S và R Khuẩn lạc loại S tăng trưởng ở 300C và được trữ ở 40C trong 24 giờ thường phát triển đặc tính nhầy (Cladera et al., 2004)

Hình 1 Một số dạng khuẩn lạc của Pseudomonas stutzeri

(Nguồn: Lalucat et al., 2006)

Pseudomonas stutzeri có thể phát triển trên môi trường minimal (Sikorski et al.,

2002); không chịu được điều kiện acid: chúng không thể phát triển ở pH 4,5

Các loài Pseudomonas stutzeri phát triển tốt dưới điều kiện oxy khí quyển và sử

dụng oxy là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi hô hấp Tuy nhiên, ở điều kiện vi

hiếu khí thì Pseudommonas stutzeri có khả năng sử dụng nitrate làm chất nhận điện tử

cuối cùng thay cho oxy và thực hiện quá trình khử nitrate (Stanier et al., 1996) nhờ có

các gen nar, nir, nor, nos (Sylvia et al., 2005; Lalucat et al., 2006) Ngoài ra, một số dòng Psedomonas stutzeri còn có gen nifH có khả năng cố định đạm như dòng A1501

sống cộng sinh trong rễ lúa (Desnoues et al., 2003; Cladera et al., 2004)

2.4 Sơ lược về quá trình loại bỏ phospho sinh học

Phospho được xác định như là yếu tố dinh dưỡng thiết yếu cho sự sống P là thành phần cấu tạo nên các hợp chất quan trọng của sự sống như: các phân tử di truyền DNA, RNA; các phân tử cấu trúc như protein, lipid; các phân tử dự trữ năng lượng cho tế bào như ATP, poly-P…Tuy nhiên, mặc dù P vừa là một yếu tố kiểm soát sự tăng trưởng và phát triển của sinh vật nhưng chúng cũng là nhân tố chủ yếu gây ra hiện tượng phú dưỡng hóa Ở hàm lượng vượt mức cho phép, P kích thích mạnh mẽ khả năng tăng sinh khối của thủy sinh vật như tảo, tảo lam,…(Bowman et al., 2007), chỉ ra rằng, một lượng nhỏ P trong nước 0,1 mg/l và duy trì thời gian dài sẽ gây sự phát triển mạnh mẽ của tảo

Sự biểu hiện có thể nhận biết rõ của hiện tượng này là sự bùng nổ của tảo, sự giảm hàm

lượng oxy hòa tan kéo theo nước ô nhiễm nặng, cá chết, các thực vật – động vật thủy sinh dần dần bị tiêu diệt Trong một vài trường hợp, có sự xuất hiện của tảo độc như

Microsystis Sự quá dư thừa lượng dinh dưỡng trong nước làm gia tăng sự hoạt động các vi sinh vật có hại như Pfisteria Điều này sẽ tác động đến nền kinh tế thông qua ảnh

hưởng của chúng đến nghề nuôi cá thương mại, du lịch sinh thái và có thể ảnh hưởng đến sức khỏe con người

2.4.1 Quá trình loại bỏ phospho sinh học

Loại bỏ P hòa tan có ý nghĩa vô cùng quan trọng Hiện nay, một số biện pháp có thể loại bỏ P được sử dụng là biện pháp hóa học và sinh học Ba biện pháp được áp dụng như lắng tụ P bằng quá trình bổ sung các kim loại như muối natri hoặc kẽm, loại bỏ P bằng màng thấm lọc, tích tụ P trong tế bào vi sinh vật

Quá trình loại bỏ P hòa tan bằng sinh học tùy thuộc vào hàm lượng P hòa tan và hiệu quả của quá trình tách bùn Sinh khối có thể chứa một lượng P từ 1,5 đến 2,5% (w/w) trên chất rắn dễ bay hơi Trong quá trình làm tăng cường sự loại bỏ P hòa tan, thì sinh khối có thể chứa từ 6 đến 8%, một lượng P vượt quá mức nhu cầu thiết yếu của tế bào P tích lũy trong tế bào sẽ được loại bỏ bằng quá trình lắng tụ sinh học

Quá trình loại bỏ P bằng con đường sinh học tùy thuộc vào sự tăng cường khả năng của vi sinh vật hấp thu lượng phosphate tự do trong môi trường vào tế bào Do đó, quá trình này thường cho là quá trình làm tăng cường sự loại bỏ P sinh học (Enhanced biological phosphorus removal – EBPR) EBPR được ứng dụng trong hầu hết các hệ thống xử lý nước thải Mặc dù EBPR cho thấy loại bỏ P hiệu quả, nhưng đôi lúc hoạt động này bị gián đoạn Nhiều nghiên cứu trong 50 năm qua đã góp phần giải thích hiện tượng này Tuy còn vài khía cạnh chưa được làm sáng tỏ, nhưng các nghiên cứu cũng

đã mang lại nhiều sự hiểu biết quan trọng về con đường trao đổi chất và được áp dụng vào thực tiễn Về mặt cơ bản, con đường trao đổi chất kỵ khí - hiếu khí và xác định vi sinh vật có vai trò cho EBPR là rất quan trọng Về mặt thực tiễn, sự áp dụng đồng thời

2 quá trình: loại bỏ N và P với nồng độ oxy hòa tan thấp thì rất có ý nghĩa, sẽ làm giảm đáng kể chi phí xử lý Phương pháp xử lý bằng sinh học có thể làm giảm nồng độ P trong nước xuống dưới 0,5 mg/l

Trải qua nhiều năm nghiên cứu và áp dụng thực tế, các hệ thống xử lý nước thải

đã ứng dụng các đặc tính sinh lý của một vài nhóm vi khuẩn để loại bỏ P hòa tan, các vi khuẩn này hấp thu lượng lớn phosphate hơn nhu cầu cần thiết cho quá trình trao đổi chất

và tồn trữ dạng P nội bào Nhóm vi sinh vật này được gọi là vi khuẩn tích lũy

poly-P (poly-poly-P accumulating organisms – poly-PAOs) (Mino et al., 1998) hay còn được gọi với

tên khác là Candidatus accumulibacter hay Accumulibacter phosphatis (He et al., 2011

and McMahon, 2011)

2.4.2 Poly-P

Hình 2 Cấu trúc chuỗi poly-P

Poly-P là polymer đầu tiên được xác định bởi Wiame (1947) như là một trong những thành phần hạt quan trọng được tích lũy trong nội bào Chúng có khả năng bắt màu khi nhuộm và được mô tả từ năm 1900 (Wiame, 1947) Ngày nay, poly-P được nhận biết như là biopolymer hiện diện hầu hết trong các sinh vật: vi khuẩn, nấm, thực vật và động vật (Dawes và Senior, 1973) Poly-P là chuỗi thẳng bao gồm gốc phosphate nối với nhau bằng cầu nối giàu năng lượng phosphoalhydride và chiều dài từ 3 tới 1000 gốc phosphate (Kulaev, 2000) (hình 1)

Hình 3 Ảnh chụp dưới kính hiển vi điện tử Burkholderia

cepacia, các chấm đen là hạt poly-P

Poly-P hiện diện trong nội bào dưới dạng hạt màu đen với kích thước và số lượng khác nhau khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử (hình 3) Dưới điều kiện thích hợp, poly-P có thể tích lũy trong nội bào chiếm khoảng 10 – 20% trọng lượng khô của tế bào

và vượt mức nhu cầu cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của vi khuẩn, điều này chứng minh sự hấp thu phosphate ngoại bào và tích lũy chúng dạng poly-P nội bào biểu

hiện vai trò trao đổi chất đặc biệt không chỉ là nguồn phosphate tồn trữ cho nhu cầu của

tế bào (Pick et al., 1990) Các nghiên cứu mô tả các đặc tính vật lý và hóa học của chuỗi poly-P cũng như vai trò của chúng trong quá trình tiến hóa (Kortstee et al., 1994) Nhiều nghiên cứu xác định sự diện hiện và ước lượng hàm lượng poly-P nội bào dựa vào số lượng và kích thước các hạt poly-P thông qua hình ảnh chụp TEM (Boswell et al., 2001; Eixler et al., 2005)

Trong một số điều kiện đặc biệt như môi trường nghèo dinh dưỡng, vi sinh vật tích lũy phosphate và đồng hóa thành poly-P như là nguồn năng lượng để duy trì sự sống Thường hạt poly-P định vị vùng ngoại vi gần màng tế bào chất và chúng dễ dàng hòa tan trong môi trường kiềm (Buzoleva et al., 2005)

2.5 Vi khuẩn tích lũy phosphate (PAOs)

Trải qua nhiều thập niên ứng dụng quá trình EBPR để xử lý nước thải, mặc dù chúng thể hiện tính hiệu quả về mặt kinh tế và thân thiện với môi trường, nhưng đôi lúc quá trình này biểu lộ tính không ổn định và quá trình loại bỏ P khỏi nước thải đôi khi thất bại (Neethling et al., 2005) Chính vì thế tìm hiểu rõ poly-P được tích lũy bởi nhóm

vi sinh vật nào, chúng tích lũy để làm gì và tích lũy như thế nào có vai trò quan trọng để cung cấp cơ sở cho thiết kế, vận hành và khắc phục các sự cố không mong muốn xảy ra trong các hệ thống xử lý nước thải

Từ nghiên cứu phân lập đầu tiên của Fuhs và Chen (1975) cho rằng các loài vi

khuẩn thuộc giống Acinetobacter được xác định như là PAOs Vào những năm 1980, nhiều báo cáo cũng cho rằng sự đa dạng loài trong giống Acinetobacter trong bùn hoạt tính của các hệ thống xử lý (Stephenson, 1987) Sau đó, Acinetobacter được xem là

nhóm vi khuẩn có vai trò chính trong quá trình EBPR (Auling et al., 1991; Carr et al., 2001; Ohtake et al., 1985; Tandoi et al., 1998; Boswell et al., 2001; Sidat et al., 1999), nhiều nghiên cứu về các kiểu trao đổi chất phản ánh các đặc tính trao đổi chất của PAOs tập trung vào nhóm vi khuẩn này (Wentzel et al., 1989) Trong các loài thuộc giống

Acinetobacter, A Johnsonii cho thấy có khả năng tích lũy lượng lớn poly-P và được

xem là loài vi khuẩn kiểu mẫu cho nghiên cứu về quá trình trao đổi năng lượng, các enzyme chuyển hóa poly-P và quá trình vận chuyển các hoạt chất qua màng tế bào (van Veen et al., 1994) Những năm gần đây, các kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng để

mô tả cấu trúc quần thể của PAOs dựa trên mối quan hệ phát sinh loài Áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong việc xác định quần thể của PAOs cho thấy vi khuẩn trong

bùn hoạt tính của các hệ thống xử lý nước thải rất đa dạng bao gồm các lớp Proteobacteria (α, β và ɣ), Gram positive với hàm lượng G+C cao (Actinobacteria), Planctomycetes và Bacteroides (Crocetti et al., 2000; Ahn et al., 2007; Bond et al., 1995; Bond et al., 1999; Kong et al., 2005; Liu et al., 2001; Gloess et al., 2008; Tamaki et al., 2005) Bên cạnh đó, thường có sự khác nhau về thành phần các nhóm vi khuẩn chiếm

ưu thế trong các hệ thống xử lý khác nhau Sự thể hiện thành phần và tính chất của từng loại nước thải mà có sự khác biệt trong thành phần của PAOs (Beer et al., 2006; Wong

et al., 2005; Crocetti et al., 2000) Trong lớp Actinobacteria các vi khuẩn được xem là

PAOs như Arthrobacter sp (Shoda et al., 1980), Mycobacterium sp (McMahon et al., 2002), Gordonia sp (Beer et al., 2006)

Nguyen et al., (2011) sử dụng kỹ thuật dò mẫu gen kết hợp khuếch đại và giải trình

tự đoạn 16S rRNA bằng cặp mồi (27F và 1492R) của nhóm vi khuẩn Actinobacteria trong các hệ thống EBPR phát hiện giống Tetrasphaera thuộc họ Intrasporangiaceae

chiếm khoảng 30% trên tổng số vi khuẩn quan sát và có các kiểu hình khác nhau Khả năng hấp thu orthophosphate và hình thành poly-P xảy ra ở hầu hết các dòng

Tetrasphaera Khả năng hấp thu orthophosphate dưới điều kiện hiếu khí chỉ xảy ra khi

chúng hấp thu nguồn carbon dưới điều kiện kỵ khí Nguồn carbon rất đa dạng như amino axít, glucose và acetate Chúng có hình dạng rất khác nhau như hình que ngắn, que chia nhánh, hình cầu, hình sợi

Nakamura et al (1991, 1995) phân lập Micrococcus strain NM-1 Chúng tích lũy

Poly-P trong điều kiện hiếu khí và sử dụng chúng như là năng lượng để hấp thu nguồn carbon trong điều kiện kỵ khí như glucose và casamino axít, không phải là acetate Ubukata và Takii (1994) cũng phân lập dòng vi khuẩn tương tự và chứng minh rằng các

vi khuẩn này chỉ thể hiện sự đồng hóa nguồn carbon (PHAs) và tích lũy poly-P vào trong

tế bào khi có sự luân phiên quá trình kỵ khí – hiếu khí Tuy nhiên, chúng không phải là một trong các vi khuẩn nổi trội trong tiến trình EBPR vì chúng không chuyển hóa acetate tới PHAs dưới điều kiện kỵ khí Gần đây, việc áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử như FISH (Fluorescence in situ hydridization) (Wagner et al., 1994 ; Kampfer et al., 1996 ; Liu, 1995) cho thấy có ít nhất ba nhóm vi khuẩn có vai trò quan trọng trong quá trình EBPR với hình dạng khác nhau

Sidat et al., (1999) phân lập các vi khuẩn tích lũy Poly-P trong bùn hoạt tính cho thấy có sự đa dạng trong thành phần các chủng vi khuẩn phân lập có khả năng tích lũy

Poly-P Bên cạnh hai giống Pseudomonas spp (chiếm 58% trên tổng số vi khuẩn phân lập được) và Staphylococcus spp (chiếm 40%), còn có một số giống cũng có khả năng tích lũy lượng lớn Poly-P như Acinetobacter calcoaceticus, Enterobacter spp., Aeromonas spp., Moraxella spp., Bacillus cereus Trong đó, Enterobacter spp và Pseudomonas spp tích lũy Poly-P nhiều nhất (> 5.3 x 10-12 mg/tế bào)

2.6 Chuyển hóa và điều hòa sự trao đổi chất trong PAOs

2.6.1 Trao đổi chất với nguồn carbon là acetate

Acetate là nguồn carbon được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu về quá trình

EBPR Trong E coli acetate được vận chuyển qua kênh đồng vận chuyển acetate xuyên màng (ActP) (Gimenez et al., 2003) Gen actP đã được xác định hiện diện trong bộ gen

của Accumulibacter Acetate được chuyển xuyên màng thông qua kênh ActP cùng với

sự chênh lệch gradient nồng độ H+ hoặc Na+ Tương tự như ActP của E coli, sự hấp thu acetate của vi khuẩn Accumulibacter bị ức chế bởi thể vận chuyển proton carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP)

Vài dạng trao đổi chất được nghiên cứu để mô tả sự biến đổi sinh hóa các nguồn carbon trong quá trình trao đổi chất Khi nghiên cứu với acetate như là nguồn carbon duy nhất, quá trình trao đổi chất được trình bày trong hình 4

Hình 4 Mô tả các đặc điểm sinh hóa chính trong quá trình EBPR Sự chuyển

đổi kiểu trao đổi chất xảy ra dưới điều kiện kỵ khí và hiếu khí

Quá trình EBPR được biết đến như sự biến đổi theo chu trình của các chất tích lũy nội bào như poly-P, PHAs và glycogen Trong điều kiện kỵ khí, poly-P nội bào bị thủy phân tạo năng lượng ATP cho quá trình hấp thu các chất hữu cơ như các axid béo mạch ngắn và thông qua quá trình đó phosphate phóng thích ra môi trường VFAs được chuyển hóa thành PHAs Ngược lại, dưới điều kiện hiếu khí, PHAs bị oxy hóa và P được hấp thu vào trong tế bào trở lại và đồng hóa thành poly-P Song song với quá trình này thì glycogen được tái tổng hợp và tế bào sẽ tăng trưởng và phát triển (Hình 4)

2.6.2 Trao đổi chất với nguồn carbon khác

Dạng trao đổi chất trên được nghiên cứu chủ yếu dựa trên các hệ thống bùn hoạt tính nhân tạo với acetate là nguồn carbon duy nhất Tuy nhiên, trong hệ thống bùn hoạt tính trong tự nhiên, bên cạnh acetate thì còn có nhiều hợp chất carbon mạch ngắn khác

Sự trao đổi chất kết hợp giữa các nguồn carbon khác nhau thì chưa được nghiên cứu nhiều Có báo cáo cho rằng, khi thí nghiệm với glucose là nguồn carbon duy nhất thì quá trình EBPR sẽ thất bại Tuy nhiên, dạng trao đổi sinh hóa cho quá trình EBPR với glucose cũng được báo cáo và cho rằng khi bổ sung glucose sẽ có tác dụng hỗ trợ cho

sự ổn định quá trình EBPR Đầu tiên glucose sẽ được chuyển hóa thành acid lactic bởi

vi khuẩn lên men lactic Chúng có vai trò đồng hóa glucose dưới điều kiện kỵ khí và tạo

ra acid lactic và cuối cùng là tồn trữ glycogen Một số giống có khả năng sử dụng amino acid như là nguồn hoạt chất

Các dạng trao đổi chất sinh hóa hiện nay vẫn chưa giải thích hết các thông tin nhận được từ các sự quan sát cho quá trình EBPR như sự đồng hóa hoạt chất dưới điều kiện

kỵ khí cùng với sự thủy phân poly-P và sự chuyển hóa glycogen tới PHA, EBPR cũng

có thể hoạt động với nguồn carbon là glucose nhưng không có sự tích lũy PHAs Điều này thể hiện thiếu các cơ sở để giải thích một cách hoàn toàn và đầy đủ về quá trình EBPR, cũng như thiếu các nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của quần thể vi khuẩn này Có lẽ các dạng trao đổi chất này chỉ có thể giải thích một cách thích đáng khi nghiên cứu quá trình trao đổi chất dưới điều kiện nuôi cấy thuần các dòng vi khuẩn phân lập được với các dạng khác nhau của PAOs để xác định lại các quá trình trao đổi chất được tìm thấy trong các hệ thống có sự tăng cường loại bỏ phosphate

2.6.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ giữa hàm lượng carbon và phosphate trên khả năng đồng hóa và dị hóa poly-P

Tính hữu dụng của nguồn carbon là yếu tố cơ bản cho quá trình EBPR bởi vì vi khuẩn tích lũy poly-P sử dụng nguồn carbon đặc biệt (như acetate) cho quá trình sinh tổng hợp Tỉ lệ COD (biểu thị qua hàm lượng carbon) và P (mg/mg) trên 40 thì thích hợp để xử lý phosphate hòa tan và quá trình EBPR được duy trì ổn định (Randall et al., 1992) Dạng hợp chất carbon cũng là yếu tố quan trọng, tỉ lệ các hợp chất hữu cơ mạch ngắn (như acetate, propionate, succinate,…) phải chiếm tỉ lệ cao trong hàm lượng COD, hoặc hàm lượng COD có thể dễ dàng bị phân hủy nhanh chóng thành VFAs bởi các vi khuẩn khác Tỉ lệ VFAs và P khoảng 14 hoặc COD dễ phân hủy và P là 16 trong nước

thải được xem là thành phần lý tưởng cho vi khuẩn tích lũy poly-P hoạt động và nhận được hàm lượng thấp phosphate hòa tan (Barnard và Abraham, 2006) Bên cạnh đó, một vài nghiên cứu cho rằng tỉ lệ COD và P cao sẽ mang lại các điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn tích lũy glycogen, vì vậy dẫn đến quá trình EBPR không hiệu quả (Liu et al., 1997) Để hạn chế sự phát triển của GAOs, Schuler và Jenkins (2003) đề nghị tỉ lệ COD (acetate) và P khoảng 10 sẽ hạn chế sự giới hạn về nguồn carbon và P cho quá trình hoạt động của vi khuẩn và nhận được hàm lượng thấp phosphate hòa tan sau khi xử lý Panswad et al., (2007) nghiên cứu tỉ lệ giữa P và COD và đánh giá hàm lượng P nội bào trong vi khuẩn tích lũy poly-P, cho rằng khi tỉ lệ giữa P và COD tăng từ 0.02, 0.04 và 0.16 thì hàm lượng P trong bùn hoạt tính ở điều kiện hiếu khí tăng từ 0.053 tới 0.084 và 0.205 mg P/mg VSS)

Soejima et al., (2008) nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng acetate trên quá trình

xử lý đồng thời P và N Ở thời gian đầu của quá trình xử lý hiếu khí, sự bổ sung acetate (COD) sẽ ngăn cản quá trình hấp thu phosphate bởi PAOs Tốc độ hấp thu phosphate có liên quan trực tiếp đến sự hiện diện và hàm lượng carbon ngoại bào Tốc độ hấp thu phosphate giảm đột ngột khi hàm lượng COD dao động 0 – 20 mg/l và giải phóng phosphate ra khỏi tế bào khi hàm lượng COD cao hơn 40 mg/l Điểm cân bằng giữa hấp thu và giải phóng phosphate khi hàm lượng COD là 10 mg/l (Hình 5)

Hình 5 Mối tương quan giữa tốc độ hấp thu phosphate và hàm

lượng COD ngoại bào

Trong quá trình đồng xử lý P và N, sự bổ sung nguồn carbon nhằm hạn chế sự hấp thu nhanh chóng phosphate của vi khuẩn tích lũy polyphosate trong môi trường, để cung

cấp phosphate cho hoạt động của vi khuẩn vừa có khả năng loại bỏ N và P, và vì vậy có thể xử lý đồng thời chúng Hàm lượng COD từ 50 – 100 mg/l ở thời điểm đầu của quá trình hiếu khí sẽ hạn chế sự hấp thu phosphate và có thể nhận được sự loại bỏ đồng thời

P và N khi xử lý bằng vi khuẩn DPAOs

Nghiên cứu này cũng phù hợp với You et al (2004) khi nghiên cứu ảnh hưởng của hàm COD trên khả năng hấp thu và giải phóng phosphate trong điều kiện hiếu khí và thiếu oxy của vi khuẩn DPAOs và PAOs cho thấy rằng khi hàm lượng COD cao chúng

sẽ phóng thích phosphate ra khỏi tế bào

2.6.4 Ảnh hưởng pH đến quá trình đồng hóa và dị hóa poly-P và acetate

Năng lượng cho quá trình hấp thu hoạt chất đã được xem như là yếu tố điều hòa

cơ bản cho quá trình hấp thu nguồn carbon bởi vi khuẩn PAOs và GAOs (Liu et al., 1997; Smolders et al.,1994) Nghiên cứu cho thấy rằng, trong điều kiện môi trường kiềm, vi khuẩn cần nhiều năng lượng hơn để hấp thu hoạt chất Chính vì vậy, sự gia tăng

pH sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho PAOs hơn GAOs Các nghiên cứu cho thấy rằng điều kiện pH cao ức chế sự phát triển của GAOs hơn là ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của PAOs Liu et al (1996) nghiên cứu ảnh hưởng của pH lên quá trình chuyển hóa acetate cho thấy rằng, khi pH ban đầu trong môi trường khoảng 5 – 6,5 sự hấp thu acetate

và phóng thích phosphate sẽ tăng cùng với sự gia tăng pH theo, khi pH trong khoảng 6,5 - 8 sự hấp thu acetate cân bằng nhưng tốc độ giải phóng phosphate vẫn tăng Khi pH trên 8,0 thì hấp thu acetate và giải phóng phosphate bắt đầu giảm Filipe et al., (2001) chứng minh rằng sự tăng trưởng và phát triển của PAOs, quá trình loại bỏ phosphate, phân hủy PHAs trong điều kiện hiếu khí chịu ảnh hưởng bởi pH Khi pH thấp ảnh hưởng lên quá trình trao đổi chất của PAOs, tốc độ hấp thu phosphate chỉ khoảng 37% ở pH 7,5, bên cạnh đó tốc độ phân hủy PHAs và sự tăng trưởng của PAOs giảm đáng kể pH giảm xuống 6,5 khả năng loại bỏ phosphate trong môi trường giảm theo Khi pH tăng trên 7 sẽ không có ảnh hưởng bất lợi lên PAOs, chính vì thế mang lại sự ổn định trong quá trình EBPR Trong điều kiện kỵ khí, sự gia tăng pH không ảnh hưởng tới khả năng hấp thu acetate của tế bào là do PAOs có thêm nguồn năng lượng dự trữ dưới dạng poly-

P, sự thủy phân poly-P cung cấp thêm nguồn năng lượng ATP cần thiết khi pH trong môi trường gia tăng

2.7 Các nghiên cứu liên quan

Từ năm 2008 đến nay, có nhiều báo cáo luận văn thạc sĩ phân lập và nhận diện vi khuẩn chuyển hóa nitơ được nghiên cứu và lưu trữ ở Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Cần Thơ Có khoảng 278 dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ được phân lập từ các nguồn chất thải khác nhau như chất thải chăn nuôi heo (Nguyễn Thành Nhân, 2008); ao cá tra (Phạm Mỹ Cẩm, 2008); ao tôm (Huỳnh Thị Cẩm

Tú, 2009), Dương Thị Bích (2009) Trong đó có 226 dòng là P stutzeri Các nghiên cứu

này chủ yếu là nhận diện vi khuẩn và kiểm tra khả năng nổi trội của chúng khi nuôi trên môi trường nghèo dinh dưỡng với sự hiện diện của NH4+, NO3-, NO2- 7 dòng vi khuẩn khử được phân lập từ: Nguyễn Thành Nhân (dòng 6Rc, 7Ra), Phạm Mỹ Cẩm (D3b, D7a), Dương Thị Bích (TN5, TN7), Huỳnh Thị Cẩm Tú (VT_B1b) được xem là những dòng có khả năng tuyển chọn để ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi heo Dòng 6Rc và 7Ra phân lập từ chất thải chăn nuôi heo ở huyện Châu Thành – Tiền Giang; dòng D3b, D7a phân lập từ ao nuôi cá tra ở huyện Cái Bè – Tiền Giang; dòng TN5, TN7 phân lập từ ao nuôi tôm sú ở huyện Kiên Lương – Kiên Giang ; dòng VT_B1b phân lập từ ao tôm thị xã Bạc Liêu

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm

3.1.1 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 8 năm 2013 đến tháng 12 năm 2013

3.1.2 Địa điểm nghiên cứu

Phòng Vi sinh vật đất và Vi sinh vật môi trường - Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học - Trường Đại học Cần Thơ

3.2 Phương tiện thí nghiệm

3.2.1 Vật liệu

Nước rỉ rác lấy từ bãi rác Tân Long, huyện Phụng Hiệp, tỉnh Hậu Giang; nước thải chăn nuôi heo lấy từ trại chăn nuôi heo xã Đông Thành, huyện Bình Minh, tỉnh Vĩnh Long

Vi khuẩn chuyển hóa nitơ Pseudomonas stutzeri dòng D3b và vi khuẩn tích lũy polyphosphate Bacillus subtilis dòng TGT.013L (Bộ sưu tập vi khuẩn - Phòng Vi sinh

vật Môi trường, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học – Đại học Cần Thơ) Giá thể là các sợi polypropylene (xuất xứ từ Hồng Kông) được kết nối với nhau thành hệ thống với diện tích tiếp xúc là 45 m2/m3 làm tăng bề mặt tiếp xúc với môi trường nước

- Máy vortex

- Tủ lạnh trữ mẫu Hitachi (Nhật)

- Tủ lạnh trữ mẫu -20oC Sanyo (Nhật Bản)

- Máy ly tâm Eppendorf (Đức)

- Máy đo OD Bekman Coulter DU 640B (Đức)

- Máy vi tính phân tích và lưu trữ số liệu

- Một số dụng cụ khác: đĩa petri, ống nghiệm, que cấy, ống eppendorf, bình tam giác, đèn cồn, đầu cone (xanh, vàng, trắng), găng tay, bọc nylon,…

- Các hóa chất dùng đo đạm, lân và một số chất vi lượng

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn

 Hóa chất pha môi trường nhân sinh khối vi khuẩn vi khuẩn chuyển hóa nitơ (môi trường Minimal):

- SW (nước muối nhân tạo) 100 mL/L

(SW gồm: NaHCO3 0,11 g/L; MgSO4.7H2O 10,5 g/L, NaCl 24 g/L)

Chỉnh pH bằng KOH đến 6,8 sau đó cho 20 gam agar vào đối với môi trường thạch

 Hóa chất pha môi trường nhân sinh khối vi khuẩn tích lũy polyphosphate, có

bổ sung pepton và yeast extract và khoáng vi lượng:

 Dung dịch khoáng vi lượng bao gồm:

 Phương pháp nhân giống vi khuẩn:

 Nuôi cấy làm đồng đều giống: Dùng que cấy chuyển khuẩn lạc đã làm ròng từ

ống nghiệm thạch nghiêng đang được lưu trữ trong tủ lạnh, cấy ria sang ống nghiệm mới Để ống nghiệm trong tủ ấm, nuôi ủ ở 30oC trong 2 ngày

 Nhân giống cấp 1: Hút 1 mL nước cất vô trùng cho vào ống nghiệm chứa vi

khuẩn, lắc đều Hút 100 L dịch huyền phù vi khuẩn cho vào bình tam giác 250

mL chứa 100 mL môi trường nuôi cấy, tạo giống cấp 1

 Nhân giống cấp 2: Xác định mật số trong giống cấp 1 theo thời gian Ở thời

điểm mật số vi khuẩn trong giống cấp 1 ở giai đoạn quân bình, tiến hành cấy chuyển tiếp sang môi trường mới, tạo giống cấp 2

Các bình nuôi cấy vi khuẩn được đặt trên máy lắc, lắc 150 vòng/phút, ở nhiệt độ

30oC Khi nhân giống với khối lượng lớn hơn thì dùng thùng lớn được vệ sinh sạch và

dùng máy sục khí với tốc độ vừa phải để thay cho máy lắc Kiểm tra mật số vi khuẩn đạt 9 log10 cfu/mL thì sử dụng được

3.3.2 Tiến hành thí nghiệm

 3.3.2.1 Thí nghiệm 1: Hiệu quả đường glucose, acid actic đến khả năng tăng sinh của vi khuẩn chuyển hóa nitơ và tích lũy phosphate trong nước rỉ rác và nước thải chăn nuôi heo

- Nội dung thí nghiệm: Theo dõi quá trình tăng sinh của vi khuẩn chuyển hóa nitơ

Pseudomonas stutzeri dòng D3b và vi khuẩn tích lũy polyphosphate Bacillus subtilis

dòng TGT.013L với nguồn carbon là glucose và acid acetic trong nước rỉ rác và nước thải chăn nuôi heo trên mô hình 0,5 lít

 Nước rỉ rác:

- Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo 6 nghiệm thức

Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm trên mô hình 0,5 lít với nguồn carbon là glucose

và acetate với hàm lượng vi khuẩn là 5%

vị thí nghiệm) của 6 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần Các đơn vị thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên trong bình tam giác 1 lít Hai dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ và tích lũy phosphate được nuôi trong môi trường tăng sinh, theo dõi mật số vi khuẩn đến khi đạt khoảng 109 cfu/mLthì chủng vào các nghiệm thức với hàm

lượng là 5% (25mL/L vi khuẩn Pseudomonas stutzeri dòng D3b + 25mL/L vi khuẩn tích lũy polyphosphate Bacillus subtilis dòng TGT.013L); bổ sung nguồn carbon:

glucose 5g/L và acid acetic 1mL/L theo tỉ lệ glucose/acetate từng nghiệm thức (nghiệm

thức đối chứng không bổ sung) và lắc đều trên máy lắc 140 vòng/phút Định kỳ mỗi 24 giờ lấy mẫu để phân tích

Xác định giá trị pH của từng nghiệm thức

Xác định mật số vi khuẩn chuyển hóa nitơ và vi khuẩn tích lũy phosphate trong từng nghiệm thức định kỳ mỗi 24 giờ

Dùng phương pháp thống kê để so sánh sự khác biệt giá trị trung bình các chỉ tiêu của 6 nghiệm thức

 Nước thải chăn nuôi heo:

- Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo 6 nghiệm thức

Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm trên mô hình 0,5 lít với nguồn carbon là glucose

và acetate với hàm lượng vi khuẩn là 5%

5% (25mL/L vi khuẩn Pseudomonas stutzeri dòng D3b + 25mL/L vi khuẩn tích lũy polyphosphate Bacillus subtilis dòng TGT.013L); bổ sung nguồn carbon: glucose 5g/L

và acetate 1mL/L theo tỉ lệ glucose/acid acetic từng nghiệm thức (nghiệm thức đối chứng không bổ sung) và lắc đều trên máy lắc 140 vòng/phút Định kỳ mỗi 24 giờ lấy mẫu để phân tích

Xác định giá trị pH của từng nghiệm thức

Xác định mật số vi khuẩn chuyển khử đạm và vi khuẩn tích lũy phosphate trong từng nghiệm thức định kỳ mỗi 24 giờ

Dùng phương pháp thống kê để so sánh sự khác biệt giá trị trung bình các chỉ tiêu

- Nội dung thí nghiệm: Từ thí nghiệm 1, chọn ra 3 nghiệm thức có khả năng tăng sinh

tốt nhất của vi khuẩn chuyển hóa nitơ Pseudomonas stutzeri dòng D3b và vi khuẩn tích lũy polyphosphate Bacillus subtilis dòng TGT.013L Bố trí thí nghiệm với 3 nghiệm

thức trên để xử lý đạm, lân nước rỉ rác và nước thải chăn nuôi heo sau biogas trên mô hình bình 1 lít với giá thể polypropylene

 Nước rỉ rác:

- Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo 3 nghiệm thức đã chọn

Nước rỉ rác trong thí nghiệm được lấy một lần bằng thùng 20 lít từ bãi rác Tân Long (xã Tân Long, huyện Phụng Hiệp, tỉnh Hậu Giang Lượng nước rỉ rác sử dụng cho mỗi thí nghiệm là 9 lít, được bố trí vào 9 đơn vị thí nghiệm (1 lít/đơn vị thí nghiệm) của

3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần Các đơn vị thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên trong keo nhựa dung tích 1,5 lít (để đảm bảo quá trình sục khí không làm tràn nước ra khỏi keo) Hai dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ và tích lũy phosphate được nuôi trong môi trường tăng sinh, theo dõi mật số vi khuẩn đến khi đạt khoảng 109 cfu/mLthì chủng vào các nghiệm thức với hàm lượng là 5% (25mL/L vi

khuẩn Pseudomonas stutzeri dòng D3b + 25mL/L vi khuẩn tích lũy polyphosphate Bacillus subtilis dòng TGT.013L); bổ sung nguồn carbon: glucose 5g/L và acetate

1mL/L) theo tỉ lệ glucose/acid acetic từng nghiệm thức; bố trí giá thể polypropylene và sục khí liên tục Định kỳ sau mỗi 24 giờ lấy mẫu để phân tích

Xác định các chỉ số TN, TP, pH của mẫu nước sau xử lý ở các nghiệm thức Xác định khối lượng sinh khối khô của từng nghiệm thức

Dùng phương pháp thống kê để so sánh sự khác biệt giá trị trung bình các chỉ tiêu của 5 nghiệm thức