2.6.1. Trao đổi chất với nguồn carbon là acetate
Acetate là nguồn carbon được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu về quá trình EBPR. Trong E. coli acetate được vận chuyển qua kênh đồng vận chuyển acetate xuyên màng (ActP) (Gimenez et al., 2003). Gen actP đã được xác định hiện diện trong bộ gen của Accumulibacter. Acetate được chuyển xuyên màng thông qua kênh ActP cùng với sự chênh lệch gradient nồng độ H+ hoặc Na+. Tương tự như ActP của E. coli, sự hấp thu acetate của vi khuẩn Accumulibacter bị ức chế bởi thể vận chuyển proton carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP).
Vài dạng trao đổi chất được nghiên cứu để mô tả sự biến đổi sinh hóa các nguồn carbon trong quá trình trao đổi chất. Khi nghiên cứu với acetate như là nguồn carbon duy nhất, quá trình trao đổi chất được trình bày trong hình 4.
Hình 4. Mô tả các đặc điểm sinh hóa chính trong quá trình EBPR. Sự chuyển đổi kiểu trao đổi chất xảy ra dưới điều kiện kỵ khí và hiếu khí.
Quá trình EBPR được biết đến như sự biến đổi theo chu trình của các chất tích lũy nội bào như poly-P, PHAs và glycogen. Trong điều kiện kỵ khí, poly-P nội bào bị thủy phân tạo năng lượng ATP cho quá trình hấp thu các chất hữu cơ như các axid béo mạch ngắn và thông qua quá trình đó phosphate phóng thích ra môi trường. VFAs được chuyển hóa thành PHAs. Ngược lại, dưới điều kiện hiếu khí, PHAs bị oxy hóa và P được hấp thu vào trong tế bào trở lại và đồng hóa thành poly-P. Song song với quá trình này thì glycogen được tái tổng hợp và tế bào sẽ tăng trưởng và phát triển (Hình 4).
2.6.2. Trao đổi chất với nguồn carbon khác
Dạng trao đổi chất trên được nghiên cứu chủ yếu dựa trên các hệ thống bùn hoạt tính nhân tạo với acetate là nguồn carbon duy nhất. Tuy nhiên, trong hệ thống bùn hoạt tính trong tự nhiên, bên cạnh acetate thì còn có nhiều hợp chất carbon mạch ngắn khác. Sự trao đổi chất kết hợp giữa các nguồn carbon khác nhau thì chưa được nghiên cứu nhiều. Có báo cáo cho rằng, khi thí nghiệm với glucose là nguồn carbon duy nhất thì quá trình EBPR sẽ thất bại. Tuy nhiên, dạng trao đổi sinh hóa cho quá trình EBPR với glucose cũng được báo cáo và cho rằng khi bổ sung glucose sẽ có tác dụng hỗ trợ cho sự ổn định quá trình EBPR. Đầu tiên glucose sẽ được chuyển hóa thành acid lactic bởi vi khuẩn lên men lactic. Chúng có vai trò đồng hóa glucose dưới điều kiện kỵ khí và tạo ra acid lactic và cuối cùng là tồn trữ glycogen. Một số giống có khả năng sử dụng amino acid như là nguồn hoạt chất.
Các dạng trao đổi chất sinh hóa hiện nay vẫn chưa giải thích hết các thông tin nhận được từ các sự quan sát cho quá trình EBPR như sự đồng hóa hoạt chất dưới điều kiện kỵ khí cùng với sự thủy phân poly-P và sự chuyển hóa glycogen tới PHA, EBPR cũng có thể hoạt động với nguồn carbon là glucose nhưng không có sự tích lũy PHAs. Điều này thể hiện thiếu các cơ sở để giải thích một cách hoàn toàn và đầy đủ về quá trình EBPR, cũng như thiếu các nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của quần thể vi khuẩn này. Có lẽ các dạng trao đổi chất này chỉ có thể giải thích một cách thích đáng khi nghiên cứu quá trình trao đổi chất dưới điều kiện nuôi cấy thuần các dòng vi khuẩn phân lập được với các dạng khác nhau của PAOs để xác định lại các quá trình trao đổi chất được tìm thấy trong các hệ thống có sự tăng cường loại bỏ phosphate.
2.6.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ giữa hàm lượng carbon và phosphate trên khả năng đồng hóa và dị hóa poly-P hóa và dị hóa poly-P
Tính hữu dụng của nguồn carbon là yếu tố cơ bản cho quá trình EBPR bởi vì vi khuẩn tích lũy poly-P sử dụng nguồn carbon đặc biệt (như acetate) cho quá trình sinh tổng hợp. Tỉ lệ COD (biểu thị qua hàm lượng carbon) và P (mg/mg) trên 40 thì thích hợp để xử lý phosphate hòa tan và quá trình EBPR được duy trì ổn định (Randall et al., 1992). Dạng hợp chất carbon cũng là yếu tố quan trọng, tỉ lệ các hợp chất hữu cơ mạch ngắn (như acetate, propionate, succinate,…) phải chiếm tỉ lệ cao trong hàm lượng COD, hoặc hàm lượng COD có thể dễ dàng bị phân hủy nhanh chóng thành VFAs bởi các vi khuẩn khác. Tỉ lệ VFAs và P khoảng 14 hoặc COD dễ phân hủy và P là 16 trong nước
thải được xem là thành phần lý tưởng cho vi khuẩn tích lũy poly-P hoạt động và nhận được hàm lượng thấp phosphate hòa tan (Barnard và Abraham, 2006). Bên cạnh đó, một vài nghiên cứu cho rằng tỉ lệ COD và P cao sẽ mang lại các điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn tích lũy glycogen, vì vậy dẫn đến quá trình EBPR không hiệu quả (Liu et al., 1997). Để hạn chế sự phát triển của GAOs, Schuler và Jenkins (2003) đề nghị tỉ lệ COD (acetate) và P khoảng 10 sẽ hạn chế sự giới hạn về nguồn carbon và P cho quá trình hoạt động của vi khuẩn và nhận được hàm lượng thấp phosphate hòa tan sau khi xử lý.
Panswad et al., (2007) nghiên cứu tỉ lệ giữa P và COD và đánh giá hàm lượng P nội bào trong vi khuẩn tích lũy poly-P, cho rằng khi tỉ lệ giữa P và COD tăng từ 0.02, 0.04 và 0.16 thì hàm lượng P trong bùn hoạt tính ở điều kiện hiếu khí tăng từ 0.053 tới 0.084 và 0.205 mg P/mg VSS).
Soejima et al., (2008) nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng acetate trên quá trình xử lý đồng thời P và N. Ở thời gian đầu của quá trình xử lý hiếu khí, sự bổ sung acetate (COD) sẽ ngăn cản quá trình hấp thu phosphate bởi PAOs. Tốc độ hấp thu phosphate có liên quan trực tiếp đến sự hiện diện và hàm lượng carbon ngoại bào. Tốc độ hấp thu phosphate giảm đột ngột khi hàm lượng COD dao động 0 – 20 mg/l và giải phóng phosphate ra khỏi tế bào khi hàm lượng COD cao hơn 40 mg/l. Điểm cân bằng giữa hấp thu và giải phóng phosphate khi hàm lượng COD là 10 mg/l (Hình 5).
Hình 5. Mối tương quan giữa tốc độ hấp thu phosphate và hàm lượng COD ngoại bào.
Trong quá trình đồng xử lý P và N, sự bổ sung nguồn carbon nhằm hạn chế sự hấp thu nhanh chóng phosphate của vi khuẩn tích lũy polyphosate trong môi trường, để cung
cấp phosphate cho hoạt động của vi khuẩn vừa có khả năng loại bỏ N và P, và vì vậy có thể xử lý đồng thời chúng. Hàm lượng COD từ 50 – 100 mg/l ở thời điểm đầu của quá trình hiếu khí sẽ hạn chế sự hấp thu phosphate và có thể nhận được sự loại bỏ đồng thời P và N khi xử lý bằng vi khuẩn DPAOs.
Nghiên cứu này cũng phù hợp với You et al. (2004) khi nghiên cứu ảnh hưởng của hàm COD trên khả năng hấp thu và giải phóng phosphate trong điều kiện hiếu khí và thiếu oxy của vi khuẩn DPAOs và PAOs cho thấy rằng khi hàm lượng COD cao chúng sẽ phóng thích phosphate ra khỏi tế bào.
2.6.4. Ảnh hưởng pH đến quá trình đồng hóa và dị hóa poly-P và acetate
Năng lượng cho quá trình hấp thu hoạt chất đã được xem như là yếu tố điều hòa cơ bản cho quá trình hấp thu nguồn carbon bởi vi khuẩn PAOs và GAOs (Liu et al., 1997; Smolders et al.,1994). Nghiên cứu cho thấy rằng, trong điều kiện môi trường kiềm, vi khuẩn cần nhiều năng lượng hơn để hấp thu hoạt chất. Chính vì vậy, sự gia tăng pH sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho PAOs hơn GAOs. Các nghiên cứu cho thấy rằng điều kiện pH cao ức chế sự phát triển của GAOs hơn là ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của PAOs. Liu et al. (1996) nghiên cứu ảnh hưởng của pH lên quá trình chuyển hóa acetate cho thấy rằng, khi pH ban đầu trong môi trường khoảng 5 – 6,5 sự hấp thu acetate và phóng thích phosphate sẽ tăng cùng với sự gia tăng pH theo, khi pH trong khoảng 6,5 - 8 sự hấp thu acetate cân bằng nhưng tốc độ giải phóng phosphate vẫn tăng. Khi pH trên 8,0 thì hấp thu acetate và giải phóng phosphate bắt đầu giảm. Filipe et al., (2001) chứng minh rằng sự tăng trưởng và phát triển của PAOs, quá trình loại bỏ phosphate, phân hủy PHAs trong điều kiện hiếu khí chịu ảnh hưởng bởi pH. Khi pH thấp ảnh hưởng lên quá trình trao đổi chất của PAOs, tốc độ hấp thu phosphate chỉ khoảng 37% ở pH 7,5, bên cạnh đó tốc độ phân hủy PHAs và sự tăng trưởng của PAOs giảm đáng kể. pH giảm xuống 6,5 khả năng loại bỏ phosphate trong môi trường giảm theo. Khi pH tăng trên 7 sẽ không có ảnh hưởng bất lợi lên PAOs, chính vì thế mang lại sự ổn định trong quá trình EBPR. Trong điều kiện kỵ khí, sự gia tăng pH không ảnh hưởng tới khả năng hấp thu acetate của tế bào là do PAOs có thêm nguồn năng lượng dự trữ dưới dạng poly- P, sự thủy phân poly-P cung cấp thêm nguồn năng lượng ATP cần thiết khi pH trong môi trường gia tăng.
2.7. Các nghiên cứu liên quan
Từ năm 2008 đến nay, có nhiều báo cáo luận văn thạc sĩ phân lập và nhận diện vi khuẩn chuyển hóa nitơ được nghiên cứu và lưu trữ ở Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Cần Thơ. Có khoảng 278 dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ được phân lập từ các nguồn chất thải khác nhau như chất thải chăn nuôi heo (Nguyễn Thành Nhân, 2008); ao cá tra (Phạm Mỹ Cẩm, 2008); ao tôm (Huỳnh Thị Cẩm Tú, 2009), Dương Thị Bích (2009). Trong đó có 226 dòng là P. stutzeri. Các nghiên cứu này chủ yếu là nhận diện vi khuẩn và kiểm tra khả năng nổi trội của chúng khi nuôi trên môi trường nghèo dinh dưỡng với sự hiện diện của NH4+, NO3-, NO2-. 7 dòng vi khuẩn khử được phân lập từ: Nguyễn Thành Nhân (dòng 6Rc, 7Ra), Phạm Mỹ Cẩm (D3b, D7a), Dương Thị Bích (TN5, TN7), Huỳnh Thị Cẩm Tú (VT_B1b) được xem là những dòng có khả năng tuyển chọn để ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi heo. Dòng 6Rc và 7Ra phân lập từ chất thải chăn nuôi heo ở huyện Châu Thành – Tiền Giang; dòng D3b, D7a phân lập từ ao nuôi cá tra ở huyện Cái Bè – Tiền Giang; dòng TN5, TN7 phân lập từ ao nuôi tôm sú ở huyện Kiên Lương – Kiên Giang ; dòng VT_B1b phân lập từ ao tôm thị xã Bạc Liêu.
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm 3.1.1 Thời gian nghiên cứu 3.1.1 Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 8 năm 2013 đến tháng 12 năm 2013.
3.1.2 Địa điểm nghiên cứu
Phòng Vi sinh vật đất và Vi sinh vật môi trường - Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học - Trường Đại học Cần Thơ.
3.2. Phương tiện thí nghiệm 3.2.1. Vật liệu 3.2.1. Vật liệu
Nước rỉ rác lấy từ bãi rác Tân Long, huyện Phụng Hiệp, tỉnh Hậu Giang; nước thải chăn nuôi heo lấy từ trại chăn nuôi heo xã Đông Thành, huyện Bình Minh, tỉnh Vĩnh Long.
Vi khuẩn chuyển hóa nitơ Pseudomonas stutzeri dòng D3b và vi khuẩn tích lũy polyphosphate Bacillus subtilis dòng TGT.013L (Bộ sưu tập vi khuẩn - Phòng Vi sinh vật Môi trường, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học – Đại học Cần Thơ). Giá thể là các sợi polypropylene (xuất xứ từ Hồng Kông) được kết nối với nhau thành hệ thống với diện tích tiếp xúc là 45 m2/m3 làm tăng bề mặt tiếp xúc với môi trường nước.
3.2.2. Dụng cụ, trang thiết bị
- Bình tam giác 1 lít - Bình nhựa 10 lít - Xô nhựa 120 lít
- Máy sục khí Resun 390W (Trung Quốc) - Máy lắc mẫu GFL 3005 (Đức)
- Bộ micropipet Gibson P10, P20, P50, P200, P1000 (Đức) - Cân điện tử Sartorius (Đức)
- pH kế Orion 420A (Mỹ)
- Nồi khử trùng nhiệt ướt Pbinternational (Đức), Tuttnauer 3870 MLV (Đức) - Tủ ủ vi sinh vật Incucell 55 (Đức)
- Tủ cấy vi sinh vật Flow Cabinet 125B-81804 (Pháp) - Tủ sấy EHRET (Đức)
- Máy vortex
- Tủ lạnh trữ mẫu Hitachi (Nhật)
- Tủ lạnh trữ mẫu -20oC Sanyo (Nhật Bản) - Máy ly tâm Eppendorf (Đức)
- Máy đo OD Bekman Coulter DU 640B (Đức) - Máy vi tính phân tích và lưu trữ số liệu
- Một số dụng cụ khác: đĩa petri, ống nghiệm, que cấy, ống eppendorf, bình tam giác, đèn cồn, đầu cone (xanh, vàng, trắng), găng tay, bọc nylon,…
3.2.3. Hóa chất
- Glucose
- Acid acetic glacical - Sodium succinate - Sodium acetate - Yeast extract
- KH2PO4, K2HPO4, NaHCO3,MgSO4.7H2O, NaCl, NaNO3, NH4Cl - Agar
- Pepton
- Các hóa chất dùng đo đạm, lân và một số chất vi lượng.
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn
Hóa chất pha môi trường nhân sinh khối vi khuẩnvi khuẩn chuyển hóa nitơ
(môi trường Minimal): - Sodium succinate 8,1 g/L - KH2PO4 340 mg/L - K2HPO4 435 mg/L - Vi lượng 1 mL/L - NaNO3 10 mL/L - NH4Cl 10 mL/L
- SW (nước muối nhân tạo) 100 mL/L
(SW gồm: NaHCO3 0,11 g/L; MgSO4.7H2O 10,5 g/L, NaCl 24 g/L)
Hóa chất pha môi trường nhân sinh khối vi khuẩn tích lũy polyphosphate, có bổ sung pepton và yeast extract và khoáng vi lượng:
- Sodium acetate 5 g/L - MgSO4.7H2O 0,5 g/L - NH4Cl 0,02 g/L - KNO3 0,18 g/L - KH2PO4 0,054 g/L - Pepton 0,5 g/L - Yeast extract 0,5 g/L
- Dung dịch khoáng vi lượng 0,5 mL/L
Dung dịch khoáng vi lượngbao gồm:
- FeCl3.6H2O 1,5 g/L - H3BO3 0,15 g/L - CuSO4.5H2O 0,03 g/L - KI 0,18 g/L - MnCl2.4H2O 0,12 g/L - Na2MoO4.2H2O 0,06 g/L - ZnSO4.7H2O 0,12 g/L - CoCl2.6H2O 0,15 g/L - EDTA 10 g/L
Phương pháp nhân giống vi khuẩn:
Nuôi cấy làm đồng đều giống: Dùng que cấy chuyển khuẩn lạc đã làm ròng từ
ống nghiệm thạch nghiêng đang được lưu trữ trong tủ lạnh, cấy ria sang ống nghiệm mới. Để ống nghiệm trong tủ ấm, nuôi ủ ở 30oC trong 2 ngày.
Nhân giống cấp 1: Hút 1 mL nước cất vô trùng cho vào ống nghiệm chứa vi
khuẩn, lắc đều. Hút 100 L dịch huyền phù vi khuẩn cho vào bình tam giác 250 mL chứa 100 mL môi trường nuôi cấy, tạo giống cấp 1.
Nhân giống cấp 2: Xác định mật số trong giống cấp 1 theo thời gian. Ở thời
điểm mật số vi khuẩn trong giống cấp 1 ở giai đoạn quân bình, tiến hành cấy chuyển tiếp sang môi trường mới, tạo giống cấp 2.
Các bình nuôi cấy vi khuẩn được đặt trên máy lắc, lắc 150 vòng/phút, ở nhiệt độ 30oC. Khi nhân giống với khối lượng lớn hơn thì dùng thùng lớn được vệ sinh sạch và
dùng máy sục khí với tốc độ vừa phải để thay cho máy lắc. Kiểm tra mật số vi khuẩn đạt 9 log10 cfu/mL thì sử dụng được.
3.3.2 Tiến hành thí nghiệm
3.3.2.1 Thí nghiệm 1: Hiệu quả đường glucose, acid actic đến khả năng tăng
sinh của vi khuẩn chuyển hóa nitơ và tích lũy phosphate trong nước rỉ rác và nước thải chăn nuôi heo.
- Nội dung thí nghiệm: Theo dõi quá trình tăng sinh của vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Pseudomonas stutzeri dòng D3b và vi khuẩn tích lũy polyphosphate Bacillus subtilis
dòng TGT.013L với nguồn carbon là glucose và acid acetic trong nước rỉ rác và nước thải chăn nuôi heo trên mô hình 0,5 lít.
Nước rỉ rác:
- Bố trí thí nghiệm:Thí nghiệm được bố trí theo 6 nghiệm thức.
Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm trên mô hình 0,5 lít với nguồn carbon là glucose và acetate với hàm lượng vi khuẩn là 5%
Nghiệm thức Glucose (%) Acid acetic (%) Glucose (g/L) Acid acetate (mL/L) NT 1 0 0 0 0 NT 2 0 100 0 1 NT 3 25 75 1,25 0,75 NT 4 50 50 2,50 0,50 NT 5 75 25 3,75 0,25 NT6 100 0 5 0
Nước rỉ rác trong thí nghiệm được lấy một lần bằng thùng 20 lít từ bãi rác Tân Long (xã Tân Long, huyện Phụng Hiệp, tỉnh Hậu Giang). Lượng nước rỉ rác sử dụng cho bước chuẩn bị thí nghiệm là 9 lít, được bố trí vào 18 đơn vị thí nghiệm (0,5 lít/đơn