3.3.3.1. Xác định mật số vi khuẩn (Phương pháp đếm gián tiếp) [Đếm sống
nhỏ giọt (Drop Plate count)].
Dùng thủ thuật vô trùng cho khoảng 25 ml môi trường Minimal agar lỏng ở nhiệt độ khoảng 450C vào đĩa petri. Để môi trường nguội dần trước khi sử dụng hay trữ trong tủ lạnh.
Pha loãng 1/10, 1/100, 1/1000 .... dung dịch chứa vi sinh vật bằng cách chuyển 1 ml của ống này sang ống kia chứa 9 ml nước cất đã khử trùng. Sau mỗi lần chuyển phải lắc đều trước khi chuyển lần thứ hai, vi sinh vật phân phối đều trong ống.
Lắc đều các ống pha loãng, dùng pipet hút 10 µl và chuyển vào môi trường đặc trong đĩa petri.
Mang đĩa vào cất trong tủ ủ. Quan sát kết quả sau 48 giờ hoặc 72 giờ ủ ở 300C. Đếm số khuẩn lạc trung bình (skltb) ở mỗi độ pha loãng:
Số vi khuẩn trong 1 ml mẫu = skltb * độ pha loãng * 102.
Hình 6. Phương pháp đếm sống
3.3.3.1 Đo đạm NH4
Quy trình thực hiện đo đạm: Dựa vào phương pháp Indophenol Blue [65] bằng cách đo hàm lượng NH4+ trong môi trường để đánh giá khả năng khử đạm của chủng vi khuẩn.
Trong phương pháp Indophenol Blue, phenol và hypochlorite phản ứng trong môi trường kiềm hình thành phenylquinone - monoimine, rồi trở lại phản ứng với ammonia tạo thành indophenol có màu xanh. Cường độ màu tùy thuộc vào nồng độ hiện diện của ammonium; và sodium nitroprusside được thêm vào để làm tăng cường độ hiện màu trong dung dịch.
NH4+ + Phenol Indophenol (có màu xanh)
Hóa chất dùng để đo đạm
Dung dịch phenol sodium nitroprusside: 10 g phenol (C6H5OH) + 0,05 g sodium nitroprusside (Na2(Fe(CN)5NO(.2H2O)), thêm nước khử khoáng cho đủ 100 mL dung dịch. Hóa chất trữ trong chai thủy tinh màu tối ở nhiệt độ lạnh (4oC).
Hypochloride ion (môi trường kiềm)
Dung dịch sodium hypochoride: 4,98 g Na2HPO4 + 1,48 g NaOH + 10 mL NaOCl 5,25%, thêm nước khử khoáng cho đủ 100 mL dung dịch. Hóa chất trữ trong chai thủy tinh màu tối ở nhiệt độ phòng.
Dung dịch NH4+ chuẩn (1 mg/L).
Dung dịch EDTA: 6 g EDTA và nước khử khoáng vừa đủ 100 mL dung dịch. Trong nước thiên nhiên thường chứa các ion Ca2+, Mg2+ (nước cứng), trong môi trường bazơ mạnh các ion này sẽ tạo thành các hydroxide ở dạng keo, làm cho dung dịch bị vẩn đục cản trở quá trình so màu. Để khắc phục hiện tượng trên, phải dùng muối Seignett (KNaC4H4O6), hay EDTA (Ethylenediamine Tetraacid acetic) cho vào mẫu nước phân tích, để các muối này kết hợp với các ion Ca2+ và Mg2+ hình thành các hợp chất hòa tan, không màu trong dung dịch.
M2+ + KNaC4H4O6 = K+ + Na+ + MCH4O6
M2+ + Na2H2I = Na2MI + 2H+
Bước 1: Xây dựng đường chuẩn NH4+
Dựng dãy đường chuẩn (gồm 6 ống nghiệm 20 mL): hút lần lượt 5; 4; 3; 2; 1; 0 mL nước cho vào 6 ống nghiệm được đánh số từ 0 đến 5. Cho lần lượt 0; 1; 2; 3; 4; 5 mL dung dịch đạm chuẩn có hàm lượng 1 mg/L NH4+. Thêm 1 mL dung dịch EDTA, 5 mL dung dịch phenol sodium nitroprusside và 5 mL dung dịch sodium hypochloride vào mỗi ống, trộn đều dung dịch trên máy Vortex. Ống đầu tiên là mẫu blank. Khi đó ta được đường chuẩn với hàm lượng các ống theo thứ tự tăng dần là 0 – 1 – 2 – 3 – 4 – 5 mg/L NH4+.
Bảng 3.3: Thành phần hóa chất trong dãy đường chuẩn đo đạm NH4+
Hóa chất Ống 0 Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống 5
Dung dịch NH4+ chuẩn 0 mL 1 mL 2 mL 3 mL 4 mL 5 mL
Nước khử khoáng 5 mL 4 mL 3 mL 2 mL 1 mL 0 mL
Dung dịch EDTA 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL
Phenol Sodium Nitroprusside 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL
Sodium Hypochloride 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL
Hàm lượng NH4+/ ống 0 mg/L 1 mg/L 2 mg/L 3 mg/L 4 mg/L 5 mg/L
Bước 2: Tiến hành phản ứng tạo màu xanh ở các mẫu nước ao đã qua xử lý: mẫu cần phân tích được ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút. Cho vào mỗi ống nghiệm 1000
µL mẫu (phần trong sau khi ly tâm), 4 mL nước khử khoáng, 1 mL dung dịch EDTA, 5 mL phenol sodium nitroprusside, 5 mL sodium hypochloride. Trộn đều dung dịch trong ống nghiệm trên máy vortex và để khoảng 20 phút ở nhiệt độ phòng.
Bước 3: Đo NH4+
Bật máy quang phổ khoảng 30 phút trước khi đo, hàm lượng NH4+ được xác định bằng cách đo cường độ hấp thu màu (OD) ở bước sóng 640 nm.
Đo giá trị OD ở 6 ống nghiệm đã biết hàm lượng NH4+ trước, sau đó đo OD các nghiệm thức. Sử dụng giá trị OD của ống số 0 (không có NH4+, không có màu xanh) làm mẫu blank đưa giá trị OD về 0, tiến hành đo OD 5 ống nghiệm còn lại. Năm ống nghiệm 1, 2, 3, 4, 5 lần lượt có giá trị NH4+ là 1, 2, 3, 4, 5 mg/L có màu xanh đậm dần sẽ tương ứng với 5 giá trị OD tăng dần.
Từ giá trị OD tương ứng với hàm lượng đạm đã biết, dùng chương trình vẽ đồ thị trong Excel xác định phương trình đường chuẩn của NH4+.
Bảng 3.4: Phương trình đường chuẩn NH4+
Hàm lượng NH4+ (x mg/L) 1 2 3 4 5
OD (y) y1 y2 y3 y4 y5
Phương trình đường chuẩn NH4+ Y = ax + b
3.3.3.2 Đo lân hòa tan PO43-
Xác định nồng độ P2O5 bằng phương pháp so màu trên máy quang phổ kế Spectrophotometer tại bước sóng 880 nm (phương pháp so màu) dựa trên phương pháp xác định PO43- của Watanabe and Olsen [66].
Hóa chất đo lân:
Dung dịch A: 12 g Ammonium Molybdate Antimony Potassium Tartrate
((NH4)6Mo7024) + 0,2908 g Potassium Antimony Tartrate (K(SbO)C4H4O6) + 140 mL dung dịch H2SO4 đậm đặc, thêm nước khử khoáng cho đủ 2 lít dung dịch A.
Hóa chất trữ trong chai thủy tinh màu tối ở nhiệt độ phòng.
Dung dịch B: 1,056 g Acid Ascorbic 200 mL dung dịch A, được pha và sử dụng
ngay trong quá trình đo lân.
Xây dựng đường chuẩn P2O5
Chuẩn bị 6 ống nghiệm được đánh số từ 0 – 5, lần lượt thêm vào mỗi ống các thành phần.
Bảng 3.5: Thành phần hóa chất trong dãy đường chuẩn đo lân PO43- Hóa chất Ống 0 Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống 5 Dung dịch P2O5 chuẩn (10 mg/L) 0 mL 0,5 mL 1 mL 1,5 mL 2 ml 2,5 mL Nước khử khoáng 8,5 mL 8 mL 7,5 mL 7 mL 6,5 mL 6 mL Dung dịch B 4 mL 4 mL 4 mL 4 mL 4 mL 4 mL Hàm lượng P2O5/ống 0 mg/L 10 mg/L 20 mg/L 30 mg/L 40 mg/L 5mg/L
Mẫu nước cần được lọc qua giấy lọc trước khi xác định lượng lân hòa tan: Hút 0,5 mL dung dịch mẫu nước cộng thêm 8 mL nước cất. Thêm 4 mL dung dịch B vào mỗi ống, trộn đều trên máy Vortex.
Để ổn định 15 – 20 phút ở nhiệt độ phòng. Tiến hành đo lân trong mẫu. Dựa vào phương trình đường chuẩn ta có: A = a*C + b
Trong đó: C là hàm lượng lân hòa tan của mẫu được quy về nồng độ P2O5 (mg/L). A là độ hấp thụ quang.
Dựa vào độ hấp thụ quang của mẫu cần phân tích để tính hàm lượng PO43- có trong mẫu nước thải theo công thức:
4 2 5 3 4 . PO P O C M PO M
Trong đó: C là hàm lượng Lân có trong mẫu tương ứng với hàm lượng P2O5
(MP2O5 = 142; MPO4 = 95)
Sử dụng phần mềm Excel để thiết lập phương trình đường chuẩn P2O5 tinh khiết.
3.3.3.3. Đo pH
Hiệu chỉnh pH về giá trị trung tính (pH = 7) bằng các dung dịch pH chuẩn.
Mỗi nghiệm thức lấy khoảng 5mL bằng cách rót mẫu vào ly nhựa (tránh làm nhiễm các mẫu với nhau).
Đặt điện cực của điện kế vào mẫu cần đo, ghi lại kết quả. Sau mỗi lần đo phải rửa điện cực thật sạch bằng nước cất rồi lau khô bằng giấy mềm.
3.3.3.4. Thu sinh khối vi khuẩn:
Đếm tất cả số sợi có trên 1 giá thể, xác định trọng lượng của 1 sợi.
Sau thí nghiệm thu ngẫu nhiên 20 sợi trên giá thể từng nghiệm thức, sấy khô ở 750C trong 24 giờ.
Cân và xác định trọng lượng. Lượng sinh khối thu được bằng khối lượng giá thể sau khi sấy trừ khối lượng giá thể ban đầu.
3.3.3.5. Đánh giá chất lượng nước rỉ rác và nước thải chăn nuôi heo
Để đánh giá sơ bộ mức độ ô nhiễm của nguồn nước thải, nghiên cứu dựa vào các quy định trong QCVN 40:2011/BTNMT (Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về nước thải công nghiệp do Bộ Tài nguyên và Môi trường quy định) và Quyết định số16/2008/QĐ- BTNMT ngày 31 tháng 12 năm 2008 của Bộ trưởng Bộ Tài nguyên và Môi trường ban hành về Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về chất lượng nước mặt.
Bảng 3.6: Giá trị giới hạn các thông số và nồng độ chất ô nhiễm theo QCVN 40:2011/BTNMT
STT Thông số
Đơn vị Giá trị giới hạn
A B 1 BOD5 mg/L 30 50 2 COD mg/L 75 150 3 Phốt-pho tổng mg/L 4 6 4 Nitơ tổng mg/L 20 40 5 TSS mg/L 50 100
6 Amoni (tính theo Nitơ) mg/L 5 10
7 Coliform MNP/100mL 3000 5000
Bảng 3.7: Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về chất lượng nước mặt. Quyết định số16/2008/QĐ-BTNMT do Bộ trưởng Bộ Tài nguyên và Môi trường ban
hành ngày 31 tháng 12 năm 2008.
TT Thông số cho phép Ký hiệu/ công thức Đơn vị Giới hạn A2
1 Amoni NH4+ mg/L < 0,2
2 Phosphat PO43- mg/L < 0,2
3 Nitrate NO3- mg/L < 5
4 Nitrite NO2- mg/L ≤ 0,02
5 Chất rắn lơ lửng TSS mg/L < 30
6 Oxy sinh hoá BOD5 mg/L < 6
7 Oxy hoà tan DO mg/L ≥ 5
8 pH pH - 6-8,5
9 E. Coli - MPN/100mL 50
10 Coliform - MPN/100mL 5000
3.3.5. Phân tích mẫu và xử lý số liệu
- Mẫu đem xác định các chỉ tiêu gồm: pH, NH4+, P043-. Các chỉ tiêu pH, NH4+, P043- được tiến hành đo tại Phòng thí nghiệm Vi sinh vật đất – Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Cần Thơ.
- Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphic, phân tích phương sai (ANOVA), vẽ đồ thị.
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN