3.2.1. Vật liệu
Nước rỉ rác lấy từ bãi rác Tân Long, huyện Phụng Hiệp, tỉnh Hậu Giang; nước thải chăn nuôi heo lấy từ trại chăn nuôi heo xã Đông Thành, huyện Bình Minh, tỉnh Vĩnh Long.
Vi khuẩn chuyển hóa nitơ Pseudomonas stutzeri dòng D3b và vi khuẩn tích lũy polyphosphate Bacillus subtilis dòng TGT.013L (Bộ sưu tập vi khuẩn - Phòng Vi sinh vật Môi trường, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học – Đại học Cần Thơ). Giá thể là các sợi polypropylene (xuất xứ từ Hồng Kông) được kết nối với nhau thành hệ thống với diện tích tiếp xúc là 45 m2/m3 làm tăng bề mặt tiếp xúc với môi trường nước.
3.2.2. Dụng cụ, trang thiết bị
- Bình tam giác 1 lít - Bình nhựa 10 lít - Xô nhựa 120 lít
- Máy sục khí Resun 390W (Trung Quốc) - Máy lắc mẫu GFL 3005 (Đức)
- Bộ micropipet Gibson P10, P20, P50, P200, P1000 (Đức) - Cân điện tử Sartorius (Đức)
- pH kế Orion 420A (Mỹ)
- Nồi khử trùng nhiệt ướt Pbinternational (Đức), Tuttnauer 3870 MLV (Đức) - Tủ ủ vi sinh vật Incucell 55 (Đức)
- Tủ cấy vi sinh vật Flow Cabinet 125B-81804 (Pháp) - Tủ sấy EHRET (Đức)
- Máy vortex
- Tủ lạnh trữ mẫu Hitachi (Nhật)
- Tủ lạnh trữ mẫu -20oC Sanyo (Nhật Bản) - Máy ly tâm Eppendorf (Đức)
- Máy đo OD Bekman Coulter DU 640B (Đức) - Máy vi tính phân tích và lưu trữ số liệu
- Một số dụng cụ khác: đĩa petri, ống nghiệm, que cấy, ống eppendorf, bình tam giác, đèn cồn, đầu cone (xanh, vàng, trắng), găng tay, bọc nylon,…
3.2.3. Hóa chất
- Glucose
- Acid acetic glacical - Sodium succinate - Sodium acetate - Yeast extract
- KH2PO4, K2HPO4, NaHCO3,MgSO4.7H2O, NaCl, NaNO3, NH4Cl - Agar
- Pepton
- Các hóa chất dùng đo đạm, lân và một số chất vi lượng.
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn
Hóa chất pha môi trường nhân sinh khối vi khuẩnvi khuẩn chuyển hóa nitơ
(môi trường Minimal): - Sodium succinate 8,1 g/L - KH2PO4 340 mg/L - K2HPO4 435 mg/L - Vi lượng 1 mL/L - NaNO3 10 mL/L - NH4Cl 10 mL/L
- SW (nước muối nhân tạo) 100 mL/L
(SW gồm: NaHCO3 0,11 g/L; MgSO4.7H2O 10,5 g/L, NaCl 24 g/L)
Hóa chất pha môi trường nhân sinh khối vi khuẩn tích lũy polyphosphate, có bổ sung pepton và yeast extract và khoáng vi lượng:
- Sodium acetate 5 g/L - MgSO4.7H2O 0,5 g/L - NH4Cl 0,02 g/L - KNO3 0,18 g/L - KH2PO4 0,054 g/L - Pepton 0,5 g/L - Yeast extract 0,5 g/L
- Dung dịch khoáng vi lượng 0,5 mL/L
Dung dịch khoáng vi lượngbao gồm:
- FeCl3.6H2O 1,5 g/L - H3BO3 0,15 g/L - CuSO4.5H2O 0,03 g/L - KI 0,18 g/L - MnCl2.4H2O 0,12 g/L - Na2MoO4.2H2O 0,06 g/L - ZnSO4.7H2O 0,12 g/L - CoCl2.6H2O 0,15 g/L - EDTA 10 g/L
Phương pháp nhân giống vi khuẩn:
Nuôi cấy làm đồng đều giống: Dùng que cấy chuyển khuẩn lạc đã làm ròng từ
ống nghiệm thạch nghiêng đang được lưu trữ trong tủ lạnh, cấy ria sang ống nghiệm mới. Để ống nghiệm trong tủ ấm, nuôi ủ ở 30oC trong 2 ngày.
Nhân giống cấp 1: Hút 1 mL nước cất vô trùng cho vào ống nghiệm chứa vi
khuẩn, lắc đều. Hút 100 L dịch huyền phù vi khuẩn cho vào bình tam giác 250 mL chứa 100 mL môi trường nuôi cấy, tạo giống cấp 1.
Nhân giống cấp 2: Xác định mật số trong giống cấp 1 theo thời gian. Ở thời
điểm mật số vi khuẩn trong giống cấp 1 ở giai đoạn quân bình, tiến hành cấy chuyển tiếp sang môi trường mới, tạo giống cấp 2.
Các bình nuôi cấy vi khuẩn được đặt trên máy lắc, lắc 150 vòng/phút, ở nhiệt độ 30oC. Khi nhân giống với khối lượng lớn hơn thì dùng thùng lớn được vệ sinh sạch và
dùng máy sục khí với tốc độ vừa phải để thay cho máy lắc. Kiểm tra mật số vi khuẩn đạt 9 log10 cfu/mL thì sử dụng được.
3.3.2 Tiến hành thí nghiệm
3.3.2.1 Thí nghiệm 1: Hiệu quả đường glucose, acid actic đến khả năng tăng
sinh của vi khuẩn chuyển hóa nitơ và tích lũy phosphate trong nước rỉ rác và nước thải chăn nuôi heo.
- Nội dung thí nghiệm: Theo dõi quá trình tăng sinh của vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Pseudomonas stutzeri dòng D3b và vi khuẩn tích lũy polyphosphate Bacillus subtilis
dòng TGT.013L với nguồn carbon là glucose và acid acetic trong nước rỉ rác và nước thải chăn nuôi heo trên mô hình 0,5 lít.
Nước rỉ rác:
- Bố trí thí nghiệm:Thí nghiệm được bố trí theo 6 nghiệm thức.
Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm trên mô hình 0,5 lít với nguồn carbon là glucose và acetate với hàm lượng vi khuẩn là 5%
Nghiệm thức Glucose (%) Acid acetic (%) Glucose (g/L) Acid acetate (mL/L) NT 1 0 0 0 0 NT 2 0 100 0 1 NT 3 25 75 1,25 0,75 NT 4 50 50 2,50 0,50 NT 5 75 25 3,75 0,25 NT6 100 0 5 0
Nước rỉ rác trong thí nghiệm được lấy một lần bằng thùng 20 lít từ bãi rác Tân Long (xã Tân Long, huyện Phụng Hiệp, tỉnh Hậu Giang). Lượng nước rỉ rác sử dụng cho bước chuẩn bị thí nghiệm là 9 lít, được bố trí vào 18 đơn vị thí nghiệm (0,5 lít/đơn vị thí nghiệm) của 6 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Các đơn vị thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên trong bình tam giác 1 lít. Hai dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ và tích lũy phosphate được nuôi trong môi trường tăng sinh, theo dõi mật số vi khuẩn đến khi đạt khoảng 109 cfu/mLthì chủng vào các nghiệm thức với hàm lượng là 5% (25mL/L vi khuẩn Pseudomonas stutzeri dòng D3b + 25mL/L vi khuẩn tích lũy polyphosphate Bacillus subtilis dòng TGT.013L); bổ sung nguồn carbon: glucose 5g/L và acid acetic 1mL/L theo tỉ lệ glucose/acetate từng nghiệm thức (nghiệm
thức đối chứng không bổ sung) và lắc đều trên máy lắc 140 vòng/phút. Định kỳ mỗi 24 giờ lấy mẫu để phân tích.
Xác định giá trị pH của từng nghiệm thức.
Xác định mật số vi khuẩn chuyển hóa nitơ và vi khuẩn tích lũy phosphate trong từng nghiệm thức định kỳ mỗi 24 giờ.
Dùng phương pháp thống kê để so sánh sự khác biệt giá trị trung bình các chỉ tiêu của 6 nghiệm thức.
Nước thải chăn nuôi heo:
- Bố trí thí nghiệm:Thí nghiệm được bố trí theo 6 nghiệm thức.
Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm trên mô hình 0,5 lít với nguồn carbon là glucose và acetate với hàm lượng vi khuẩn là 5%
Nghiệm thức Glucose (%) Acid acetic (%) Glucose (5g/L) Acid acetic (1mL/L) NT 1 0 0 0 0 NT 2 0 100 0 1 NT 3 25 75 1,25 0,75 NT 4 50 50 2,50 0,50 NT 5 75 25 3,75 0.25 NT6 100 0 5 0
Nước thải chăn nuôi heo trong thí nghiệm được lấy một lần bằng thùng 20 lít từ trại chăn nuôi heo xã Đông Thành, huyện Bình Minh. Lượng nước thải sử dụng cho bước chuẩn bị thí nghiệm là 9 lít, được bố trí vào 18 đơn vị thí nghiệm (0,5 lít/đơn vị thí nghiệm) của 6 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Các đơn vị thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên trong bình tam giác 1 lít. Hai dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ và tích lũy phosphate được nuôi trong môi trường tăng sinh, theo dõi mật số vi khuẩn đến khi đạt khoảng 109 cfu/mLthì chủng vào các nghiệm thức với hàm lượng là 5% (25mL/L vi khuẩn Pseudomonas stutzeri dòng D3b + 25mL/L vi khuẩn tích lũy polyphosphate Bacillus subtilis dòng TGT.013L); bổ sung nguồn carbon: glucose 5g/L và acetate 1mL/L theo tỉ lệ glucose/acid acetic từng nghiệm thức (nghiệm thức đối chứng không bổ sung) và lắc đều trên máy lắc 140 vòng/phút. Định kỳ mỗi 24 giờ lấy mẫu để phân tích.
Xác định mật số vi khuẩn chuyển khử đạm và vi khuẩn tích lũy phosphate trong từng nghiệm thức định kỳ mỗi 24 giờ.
Dùng phương pháp thống kê để so sánh sự khác biệt giá trị trung bình các chỉ tiêu của 6 nghiệm thức.
3.3.2.2 Thí nghiệm 2: Hiệu quả xử lý nitơ, phospho nước rỉ rác và nước thải
chăn nuôi heo với vi khuẩn chuyển hóa nitơ Pseudomonas stutzeri dòng D3b, vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus subtilis dòng TGT.013L, nguồn carbon và giá thể trên mô hình bình 1 lít.
- Nội dung thí nghiệm: Từ thí nghiệm 1, chọn ra 3 nghiệm thức có khả năng tăng sinh
tốt nhất của vi khuẩn chuyển hóa nitơ Pseudomonas stutzeri dòng D3b và vi khuẩn tích lũy polyphosphate Bacillus subtilis dòng TGT.013L. Bố trí thí nghiệm với 3 nghiệm thức trên để xử lý đạm, lân nước rỉ rác và nước thải chăn nuôi heo sau biogas trên mô hình bình 1 lít với giá thể polypropylene.
Nước rỉ rác:
- Bố trí thí nghiệm:Thí nghiệm được bố trí theo 3 nghiệm thức đã chọn.
Nước rỉ rác trong thí nghiệm được lấy một lần bằng thùng 20 lít từ bãi rác Tân Long (xã Tân Long, huyện Phụng Hiệp, tỉnh Hậu Giang. Lượng nước rỉ rác sử dụng cho mỗi thí nghiệm là 9 lít, được bố trí vào 9 đơn vị thí nghiệm (1 lít/đơn vị thí nghiệm) của 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Các đơn vị thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên trong keo nhựa dung tích 1,5 lít (để đảm bảo quá trình sục khí không làm tràn nước ra khỏi keo). Hai dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ và tích lũy phosphate được nuôi trong môi trường tăng sinh, theo dõi mật số vi khuẩn đến khi đạt khoảng 109 cfu/mLthì chủng vào các nghiệm thức với hàm lượng là 5% (25mL/L vi khuẩn Pseudomonas stutzeri dòng D3b + 25mL/L vi khuẩn tích lũy polyphosphate
Bacillus subtilis dòng TGT.013L); bổ sung nguồn carbon: glucose 5g/L và acetate
1mL/L) theo tỉ lệ glucose/acid acetic từng nghiệm thức; bố trí giá thể polypropylene và sục khí liên tục. Định kỳ sau mỗi 24 giờ lấy mẫu để phân tích.
Xác định các chỉ số TN, TP, pH của mẫu nước sau xử lý ở các nghiệm thức. Xác định khối lượng sinh khối khô của từng nghiệm thức.
Dùng phương pháp thống kê để so sánh sự khác biệt giá trị trung bình các chỉ tiêu của 5 nghiệm thức.
Nước thải chăn nuôi heo:
- Bố trí thí nghiệm:Thí nghiệm được bố trí theo 3 nghiệm thức đã chọn.
Nước thải chăn nuôi heo trong thí nghiệm được lấy một lần bằng thùng 20 lít từ trại chăn nuôi heo xã Đông Thành, huyện Bình Minh. Lượng nước thải sử dụng cho mỗi thí nghiệm là 9 lít, được bố trí vào 9 đơn vị thí nghiệm (1 lít/đơn vị thí nghiệm) của 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Các đơn vị thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên trong keo nhựa dung tích 1,5 lít (để đảm bảo quá trình sục khí không làm tràn nước ra khỏi keo). Hai dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ và tích lũy phosphate được nuôi trong môi trường tăng sinh, theo dõi mật số vi khuẩn đến khi đạt khoảng 109 cfu/mLthì chủng vào các nghiệm thức với hàm lượng là 5% (25mL/L vi khuẩn Pseudomonas stutzeri dòng D3b + 25mL/L vi khuẩn tích lũy polyphosphate
Bacillus subtilis dòng TGT.013L); bổ sung nguồn carbon: glucose 5g/L và acid acetic
1mL/L) theo tỉ lệ glucose/acid acetic từng nghiệm thức; bố trí giá thể polypropylene và sục khí liên tục. Định kỳ sau mỗi 24 giờ lấy mẫu để phân tích.
Xác định các chỉ số TN, TP, pH của mẫu nước sau xử lý ở các nghiệm thức. Xác định khối lượng sinh khối khô của từng nghiệm thức.
Dùng phương pháp thống kê để so sánh sự khác biệt giá trị trung bình các chỉ tiêu của 5 nghiệm thức.
3.3.2.3 Thí nghiệm 3: Hiệu quả xử lý nitơ, phospho nước rỉ rác và nước thải
chăn nuôi heo với vi khuẩn chuyển hóa nitơ Pseudomonas stutzeri dòng D3b, vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus subtilis dòng TGT.013L, nguồn carbon và giá thể trên mô hình bình 8 lít.
- Nội dung và bố trí thí nghiệm: Tương tự thí nghiệm 2
Nước rỉ rác:
Nước rỉ rác trong thí nghiệm được lấy một lần bằng 3 thùng 30 lít từ bãi rác Tân Long (xã Tân Long, huyện Phụng Hiệp, tỉnh Hậu Giang. Lượng nước rỉ rác sử dụng mỗi thí nghiệm là 72 lít mỗi loại, được bố trí vào 9 đơn vị thí nghiệm (8 lít/đơn vị thí nghiệm) của 6 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Các đơn vị thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên trong keo nhựa dung tích 10 lít (để đảm bảo quá trình sục khí không làm tràn nước ra khỏi keo). Hai dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ và tích lũy phosphate được nuôi trong môi trường tăng sinh, theo dõi mật số vi khuẩn đến khi đạt khoảng 109 cfu/mLthì chủng vào các nghiệm thức với hàm lượng là 5% (25mL/L vi
khuẩn Pseudomonas stutzeri dòng D3b + 25mL/L vi khuẩn tích lũy polyphosphate
Bacillus subtilis dòng TGT.013L); bổ sung nguồn carbon: glucose 5g/L và acetate
1mL/L) theo tỉ lệ glucose/acid acetic từng nghiệm thức; bố trí giá thể polypropylene và sục khí luân phiên 14h sục-10 giờ ngưng sục. Định kỳ sau mỗi 24 giờ lấy mẫu để phân tích.
Xác định các chỉ số TN, TP, pH của mẫu nước sau xử lý ở các nghiệm thức. Xác định khối lượng sinh khối khô của từng nghiệm thức.
Dùng phương pháp thống kê để so sánh sự khác biệt giá trị trung bình các chỉ tiêu của 5 nghiệm thức.
Nước thải chăn nuôi heo:
Nước thải chăn nuôi heo trong thí nghiệm được lấy một lần bằng 3 thùng 30 lít từ trại chăn nuôi heo xã Đông Thành, huyện Bình Minh. Lượng nước thải chăn nuôi heo sử dụng mỗi thí nghiệm là 72 lít, được bố trí vào 9 đơn vị thí nghiệm (8 lít/đơn vị thí nghiệm) của 6 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Các đơn vị thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên trong keo nhựa dung tích 10 lít (để đảm bảo quá trình sục khí không làm tràn nước ra khỏi keo). Hai dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ và vi khuẩn tích lũy phosphate được nuôi trong môi trường tăng sinh, theo dõi mật số vi khuẩn đến khi đạt khoảng 109 cfu/mLthì chủng vào các nghiệm thức với hàm lượng là 5% (25mL/L vi khuẩn Pseudomonas stutzeri dòng D3b + 25mL/L vi khuẩn tích lũy polyphosphate Bacillus subtilis dòng TGT.013L); bổ sung nguồn carbon: glucose 5g/L và acetate 1mL/L) theo tỉ lệ glucose/acid acetic từng nghiệm thức; bố trí giá thể polypropylene và sục khí liên tục. Định kỳ sau mỗi 24 giờ lấy mẫu để phân tích.
Xác định các chỉ số TN, TP, pH của mẫu nước sau xử lý ở các nghiệm thức. Xác định khối lượng sinh khối khô của từng nghiệm thức.
Dùng phương pháp thống kê để so sánh sự khác biệt giá trị trung bình các chỉ tiêu của 5 nghiệm thức.
3.3.3 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu hóa lý
3.3.3.1. Xác định mật số vi khuẩn (Phương pháp đếm gián tiếp) [Đếm sống
nhỏ giọt (Drop Plate count)].
Dùng thủ thuật vô trùng cho khoảng 25 ml môi trường Minimal agar lỏng ở nhiệt độ khoảng 450C vào đĩa petri. Để môi trường nguội dần trước khi sử dụng hay trữ trong tủ lạnh.
Pha loãng 1/10, 1/100, 1/1000 .... dung dịch chứa vi sinh vật bằng cách chuyển 1 ml của ống này sang ống kia chứa 9 ml nước cất đã khử trùng. Sau mỗi lần chuyển phải lắc đều trước khi chuyển lần thứ hai, vi sinh vật phân phối đều trong ống.
Lắc đều các ống pha loãng, dùng pipet hút 10 µl và chuyển vào môi trường đặc trong đĩa petri.
Mang đĩa vào cất trong tủ ủ. Quan sát kết quả sau 48 giờ hoặc 72 giờ ủ ở 300C. Đếm số khuẩn lạc trung bình (skltb) ở mỗi độ pha loãng:
Số vi khuẩn trong 1 ml mẫu = skltb * độ pha loãng * 102.
Hình 6. Phương pháp đếm sống
3.3.3.1 Đo đạm NH4
Quy trình thực hiện đo đạm: Dựa vào phương pháp Indophenol Blue [65] bằng cách đo hàm lượng NH4+ trong môi trường để đánh giá khả năng khử đạm của chủng vi