hiệu quả kháng thể kháng virus viêm gan vịt type 1 được tạo từ lòng đỏ trứng gà trong điều kiện in vitro

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN THÚ Y TRẦN NGUYỄN TUẤN PHƯƠNG HIỆU QUẢ KHÁNG THỂ KHÁNG VIRUS VIÊM GAN VỊT TYPE ĐƯỢC TẠO TỪ LÒNG ĐỎ TRỨNG GÀ TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGÀNH THÚ Y Cần Thơ, 2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN THÚ Y LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP HIỆU QUẢ KHÁNG THỂ KHÁNG VIRUS VIÊM GAN VỊT TYPE ĐƯỢC TẠO TỪ LÒNG ĐỎ TRỨNG GÀ TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS.TS HỒ THỊ VIỆT THU TRẦN NGUYỄN TUẤN PHƯƠNG Cần Thơ, 2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN THÚ Y Đề tài: “Thử nghiệm hiệu bảo nguyên bào sợi vịt kháng thể kháng virus viêm gan vịt type tạo từ lòng đỏ trứng gà điều kiện In vitro’’ sinh viên Trần Nguyễn Tuấn Phương thực phòng thí nghiệm virus học, Bộ môn Thú y, Khoa Nông nghiệp Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ, từ tháng 08 năm 2014 đến tháng 12 năm 2014. Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2014 Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2014 Duyệt môn Duyệt giáo viên hướng dẫn PGS.TS. HỒ THỊ VIỆT THU Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2014 Duyệt Khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu thân. Các số liệu, kết trình bày luận văn trung thực chưa công bố luận văn trước đây. Cần Thơ, ngày tháng năm 2014 Tác giả luận văn Trần Nguyễn Tuấn Phương ii LỜI CẢM TẠ Con xin kính gửi lòng biết ơn sâu sắc kính trọng đến Cha Mẹ đấng sinh thành nuôi dưỡng, dạy dỗ, động viên khuyến khích suốt trình học tập làm người. Qua thời gian học tập rèn luyện trường Đại Học Cần Thơ, suốt trình thực đề tài luận văn tốt nghiệp đại học, quý Thầy Cô tận tình hướng dẫn truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báo chuyên ngành Thú Y mà theo học. Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến - Cô Hồ Thị Việt Thu tận tình hướng dẫn giúp đỡ hoàn thành luận văn này. - Quý Thầy Cô Bộ môn Thú Y Chăn Nuôi tận tâm giảng dạy truyền đạt cho nhiều kiến thức chuyên ngành quý báu. - Anh Lê Trần Hoài Khanh hết lòng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian làm việc phòng thí nghiệm. - Chị Nguyễn Thị Anh Thư Chị Huỳnh Thể Vân giúp đỡ làm đề tài phòng thí nghiệm virus học. iii TÓM LƯỢC Đề tài “Hiệu kháng thể kháng virus viêm gan vịt type tạo từ lòng đỏ trứng gà điều kiện in vitro”. Được tiến hành phòng thí nghiệm virus học, Bộ Môn Thú Y, Khoa Nông nghiệp Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ thời gian từ tháng 8/2014 đến tháng 12/2014. Nghiên cứu thực nhằm khảo sát độc tính tế bào khả bảo vệ lớp nguyên bào sợi vịt (Duck Embryo Fibroblast (DEF)) dich kháng thể tạo từ lòng đỏ trứng gà (IgY) virus viêm gan vịt type (Duck hepatitis virus type (DHV-1)). Hiệu bảo vệ nguyên bào sợi vịt IgY xác định qua thời điểm khác nhau. Qua đó, độ pha loãng IgY theo bậc 10 đưa vào tế bào trước 12 giờ, 24 sau 12 giờ, 24 gây nhiễm tế bào với DHV-1 liều 500 TCID50. Các số liệu hình ảnh ghi nhận phân tích qua hai phương pháp khảo sát thay đổi hình thái lớp nguyên bào sợi vịt kính hiển vi soi ngược so sánh giá trị từ phương pháp đo mật độ quang. Kết thử nghiệm cho thấy dịch IgY không gây độc cho tế bào DEF liều thấp 1,688 mg/ml. Hiệu bảo vệ tế bào DEF IgY biến thiên theo phương thức phụ thuộc liều thử nghiệm nằm khoảng hàm lượng IgY từ 1,688 mg/ml đến 1,688.10-1 mg/ml. Ngoài ra, dịch IgY cho hiệu bảo vệ tế bào DEF in vitro tốt đưa IgY vào môi trường tế bào trước 12 gây nhiễm với DHV-1. Kết đề tài cung cấp số liệu thử nghiệm để làm sở cho nghiên cứu kháng thể IgY điều kiện in vitro. iv MỤC LỤC Trang TRANG DUYỆT LUẬN VĂN . i LỜI CAM ĐOAN . ii LỜI CẢM TẠ . iii TÓM LƯỢC . iv MỤC LỤC v DANH SÁCH BẢNG . vii DANH SÁCH HÌNH viii DANH SÁCH SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ . ix DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT . x Chương 1. ĐẶT VẤN ĐỀ . Chương 2. CƠ SỞ LÝ LUẬN 2.1. Virus viêm gan vịt . 2.1.1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc phân loại virus 2.1.2. Sức đề kháng virus viêm gan vịt . 2.1.3. Cơ chế sinh bệnh virus viêm gan vịt type 2.1.4. Đặc tính nuôi cấy virus viêm gan vịt type . 2.1.5. Nuôi cấy tế bào xơ phôi vịt 2.2. Kháng thể IgY gà 2.2.1. Sơ lược IgY . 2.2.2. Cấu trúc chức . 2.2.3. Đặc tính IgY 2.3. Vai trò kháng thể . 2.3.1. Liên kết với kháng nguyên . 2.3.2. Hoạt hóa tế bào miễn dịch . Chương 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian địa điểm thực . 3.1.1. Thời gian . 3.1.2. Địa điểm 3.2. Vật liệu hóa chất . 3.2.1. Đối tượng thí nghiệm . 3.2.2. Các dụng cụ thiết bị thí nghiệm . v 3.2.3. Các hóa chất môi trường 3.3. Nội dung nghiên cứu . 3.4. Phương pháp nghiên cứu . 3.4.1. Chuẩn bị lớp đơn tế bào DEF . 3.4.2. Chuẩn độ xác định liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy 10 3.4.3. Xác định liều an toàn dịch IgY tế bào DEF 12 3.4.4. Khảo sát hoạt tính bảo vệ nguyên bào sợi vịt IgY qua thời điểm bổ sung sinh phẩm khác . 14 3.5. Phương pháp xử lý số liệu . 15 Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 16 4.1. Chuẩn độ virus, xác định liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy virus gây bệnh viêm gan vịt type 16 4.2. Kết xác định liều an toàn dịch kháng thể IgY tế bào DEF 17 4.3. Hoạt tính bảo vệ tế bào DEF kháng thể IgY kháng DHV-1 điều kiện in vitro 20 4.3.1. Kết xác định hoạt tính bảo vệ tế bào DEF dịch kháng thể IgY đưa sinh phẩm vào lúc 12 sau gây nhiễm DHV-1 21 4.3.2. Kết xác định hoạt tính bảo vệ tế bào DEF dịch kháng thể IgY đưa sinh phẩm vào lúc 24 sau gây nhiễm DHV-1 23 4.3.3. Kết xác định hoạt tính bảo vệ tế bào DEF dịch kháng thể IgY đưa sinh phẩm vào lúc 12 trước gây nhiễm DHV-1 . 25 4.3.4. Kết xác định hoạt tính bảo vệ tế bào DEF dịch kháng thể IgY đưa sinh phẩm vào lúc 24 trước gây nhiễm DHV-1 . 27 Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 29 5.1. Kết luận . 29 5.2. Đề nghị 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 30 PHỤ LỤC CHUẨN BỊ HÓA CHẤT VÀ MÔI TRƯỜNG . 33 PHỤ LỤC CÁC KỸ THUẬT PHÒNG THÍ NGHIỆM . 34 PHỤ LỤC SỐ LIỆU VÀ XỬ LÝ THỐNG KÊ . 35 vi DANH SÁCH BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 4.1 Tỷ lệ xuất CPE DHC-1 gây theo nồng độ virus lớp đơn tế bào DEF 16 Bảng 4.2 Giá trị OD620 tỷ lệ tế bào sống trung bình thí nghiệm xác định liều an toàn dịch IgY 19 Bảng 4.3 Giá trị OD620 tỷ lệ tế bào sống trung bình đưa kháng thể IgY vào tế bào DEF sau 12 gây nhiễm với DHV-1 21 Bảng 4.4 Giá trị OD620 tỷ lệ tế bào sống trung bình đưa kháng thể IgY vào tế bào DEF sau 24 gây nhiễm với DHV-1 23 Bảng 4.5 Giá trị OD620 tỷ lệ tế bào sống trung bình đưa kháng thể IgY vào tế bào DEF trước 12 gây nhiễm với DHV-1 25 Bảng 4.6 Giá trị OD620 tỷ lệ tế bào sống trung bình đưa kháng thể IgY vào tế bào DEF trước 24 gây nhiễm với DHV-1 27 vii DANH SÁCH HÌNH Hình Tên hình Trang Hình 3.1 Bố trí thí nghiệm xác định liều TCID50/ 0,1 ml 10 Hình 4.1 Hình ảnh tế bào DEF tác động gây độc IgY nồng độ khác 18 Hình 4.2 Hình ảnh tế bào DEF tác dụng bảo vệ IgY nồng độ khác virus DHV-1 gây nhiễm 12 trước sử dụng IgY (100X) 22 Hình 4.3 Hình ảnh tế bào DEF tác dụng bảo vệ IgY nồng độ khác virus DHV-1 gây nhiễm 24 trước sử dụng IgY (100X) 24 Hình 4.4 Hình ảnh tế bào DEF tác dụng bảo vệ IgY nồng độ khác bổ sung thời điểm 12 trước gây nhiễm virus DHV-1 (100X) 26 Hình 4.5 Mật độ quang đĩa nuôi cấy sau nhuộm MTT, kháng thể IgY đưa vào môi tường tế bào DEF trước 24 gây nhiễm DHV-1 28 viii TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Hồ Thị Việt Thu Nguyễn Đức Hiền, 2012. Giáo trình bệnh truyền nhiễm gia súc gia cầm. NXB Đại Học Cần Thơ, tr. 283-288. 2. Nguyễn Bá Hiên Nguyễn Minh Tâm, 2007. Giáo trình vi sinh vật bệnh truyền nhiễm vật nuôi. NXB Hà Nội, tr. 290-296. 3. Nguyễn Đức Hiền, 2012. Bệnh truyền nhiễm gia cầm. NXB Đại Học Cần Thơ, Tr. 75-84. 4. Nguyễn Đức Lưu Vũ Như Quán, 2002. Bệnh viêm gan virus vịt. Khoa Học kỹ thuật Thú y. Hội Thú y Việt Nam, tr. 87-90. 5. Nguyễn Xuận Bình, 2002. Bệnh vịt biện pháp phòng trị.NXB Nông Nghiệp Hà Nội, tr. 56-59. 6. Phạm Sỹ Lăng, Tô Long Thành, Cù Hữu Phú Nguyễn Hoài Nam, 2005. Bệnh gia cầm biện pháp phòng trị. NXB Nông Nghiệp, tr. 100-106. 7. Trần Ngọc Bích Hồ Thị Việt Thu, 2012. Giáo trình miễn dịch học đại cương. trường Đại Học Cần Thơ, Khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng, Bộ Môn Thú Y, tr.39-41. 30 Tiếng Anh 1. Chang H. M., Ou-Yang Chen Y. T., and Chen C.C., 1999. Productivity and some properties of immunoglobulin specific again Streptococcus mutant serotype C in chicken egg yolk (IgY). J. Agric. Food Chem. 47, pp. 61-66 2. Davis D., 1987. Temerture and pH stability of duck hepatitis virus. Avian Pathology, 16 (1): 21-30. 3. Doyle A. and Griffiths J. B., 1998. Cell and tissue culture: laboratory procedures in biotechnology, Wiley, 57-61. 4. Estaban M. and Patino C., 2000. Identification by electron microscopy of the maturation steps in vaccinia virus morphogenesis inhibited by the interferon-induced enzymes, protein kinase (PKR), 2-5A synthetase and nitric oxide synthase (iNOS). Journal of interferon and cytokine research, 20: 867877. 5. Finter, N. B., 1969. Dye Uptake Methods for Assesing Viral Cytopathogenicity and their Application to Interferon Assays. In: j. gen. Virol 5, pp. 419-427. 6. Fitzgerald, J. E., Hanson, L. E., and Wingard, M., 1963.Cytopathic effects of Duck Hepatitis in Duck Embryo Kidney Cell Cultrures. Biol Med114(3), pp.814-816. 7. Hatta, Crowley H. A., and Scoble B., 1993. Production and some properties of egg yolj antibody (IgY) againt human rotavirus compared with rabbit IgG. Biosci. Biotechnol.Biochem. 57, pp. 450-454. 8. Hussain I. Rasool M. H., 2005. Adaption of an indigenous very virulent Infectous Bursal Disease Virus on Vero cell line. Pakistan Veterinary Journal, 25 (3), pp. 103-106. 9. Hwang J., 1966. Duck Hepatitic Virus in Duck Embryo Fibriblast Culture. Avian Diseases 10(4), pp. 508-512. 10. Leslie G. A., and Martin L. N., 1973. Studies on the secretory immunologic system of fowl. 3. Serum and secretory IgA of the chicken. J. Immunol., 110 (1), 1-9. 11. Levine P. P. Fabricant J., 1950. A hitherto – undescribed virus diseases of duck in North America. Cornell Vet 40, pp. 71-78. 12. Maiboroda A. D., 1972. Formation of duck hepatitis virus in culture cells. Vetrinaria 8, pp. 50-52. 13. Meager A., 2002. Biological assays for interferons. Journal of Immunological Methods, 261 (1): 21–36. 14. Mosmann T., 1983. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods, 65: 55–63. 15. Polson A., M.B. Von Wechmar & M.H.V.V. Regenmortel. 1980. Isolation of viral IgY antibodies from yolk of immunized hens. Immunol. Commun., 9, 475-493. 31 16. Reed L. J., and Muench H., 1938. A simple method for estimating fifty percent endpoints, American Joural of Hygien, 27, pp 493-496. 17. Renault, T., Torchy, C. and de Kinkelin, P., 1991. Spectro photomectric method for titration of trout interferon, and its application to rainbout fry experimentally infected with viral hearrhagic septicaemia virus. In: Dis.aquat.org,10, pp. 23-29 18. Reuss, U., 1959. Versuche zur aktiven und passiven Immumisierung bei der Virus hepatitis der Entenkuken. Zentrabl Veterinaermed 6, pp. 808-815. 19. Shimizu, M., R. Fitzsimmons and S. Nakai. 1988, Anti-Ecoli immunoglobulin Y isolated from egg yolk of immunized chicken as a potential food ingredient. J.Food Sci. 53, pp. 2360-1366. 20. Woolcock, 1989. Duck virus hepatitis. A laboratory manual for the isolation and indentification of avian pathogens, the American association of avian pathologists, pp.152-155. 21. Woolcock P.R. and Fabricant J., 1997. Duck hepatitis. Diseases of poultry (Calnek B. W., Barnes H. J., Beard C. W., McDougald L. R). Saif Y.M., Iowa State Universiry Press, Ames, Iowa, USA, pp. 661-670. 32 PHỤ LỤC CHUẨN BỊ HÓA CHẤT VÀ MÔI TRƯỜNG 1.1. ĐỆM DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Solution) - Cân xác 9,6 g DPBS cho vào 1000 ml nước cất, khuấy cho tan hết. - Hấp tiệt trùng 1210C, atm 15 phút. Hoặc lọc qua đầu lọc 0,45 µm. - Bảo quản nhiệt độ phòng mát 40C, tránh sáng. 1.2. CÁC MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TẾ BÀO 1.2.1. Môi trường tăng trưởng (MTTT), 10% huyết bào thai bê (FBS) Để có 100 ml MTTT, đong 90 ml môi trường DMEM (dung dịch) (Gibco, Invitrogen, NY, USA) vào chai duran 100 ml vô trùng, sau thêm 10 ml FBS (đã rã đông), trộn dung dịch. Đem lọc MTTT qua đầu lọc 0,45 μm, trữ mát – 80C đến sử dụng. 1.2.2. Môi trường trì (MTDT), 5% FBS. Đối với MTDT, cách pha tương tự MTTT thêm 5% FBS. 1.2.3. Môi trường pha loãng virus (MTPL) MTPL không bổ sung huyết bào thai bò. 33 PHỤ LỤC CÁC KỸ THUẬT PHÒNG THÍ NGHIỆM 2.1. CHỌN LỌC, ẤP TRỨNG VÀ THU NHẬN PHÔI 9-11 NGÀY TUỔI 2.1.1. Chọn lọc nguồn trứng Trứng gà chọn từ gà thả vườn khỏe mạnh, không tiêm vaccin phòng bệnh Newcastle Gumboro. Trứng có kích thước trọng lượng cân đối, không lớn nhỏ quá, phân biệt đầu lớn đầu nhỏ, tốt từ ổ trứng gà mái đẻ. Bề mặt vỏ trơn nhẵn, không xù xì hay méo mó. Sử dụng trứng (trứng đốm phấn canxi bề mặt vỏ), không nên ấp trứng tuần sau gà đẻ. Để kiểm tra diện kháng thể kháng virus gây bệnh Newcastle Gumboro trứng thí nghiệm, từ ổ trứng (5 – trứng) lấy trứng, thu dịch lòng đỏ để thực phản ứng HI (đối với bệnh Newcastle) phản ứng AGP (đối với bệnh Gumboro) (qui trình thực hai phản ứng HI AGP trình bày Phụ lục này, mục 5). Nếu kết thu từ hai phản ứng dương tính độ pha loãng dịch lòng đỏ loại ổ trứng đó, ngược lại âm tính trứng lại ổ đem ấp. Tất trứng vệ sinh sát trùng bên vỏ với cồn 70% trước đưa vào máy ấp. 2.1.2 Ấp trứng thí nghiệm Giai đoạn ấp trứng quan trọng, có ảnh hưởng đến hình thành phát triển phôi – nguồn vật liệu nuôi cấy tế bào sau này. Trứng đặt đứng khay, nghiêng góc 750, ngày đảo hai lần (sáng – chiều) để tránh tượng “sát phôi” – tượng phôi phát triển dính vào lớp màng vỏ lụa, ngăn cản hấp thu dưỡng chất từ lòng đỏ trở ngại tuần hoàn, dẫn đến chết phôi. Môi trường bên máy ấp điều chỉnh 370C, độ ẩm thích hợp (đặt khay nước đáy máy). Từ – ngày ấp, soi (candling) để kiểm tra trứng có phôi, từ loại trứng phôi phôi yếu. 2.1.3 Chọn phôi để nuôi cấy tế bào Trứng ấp đến – 11 ngày tiến hành thu hoạch phôi. Phôi sử dụng cho nuôi cấy tế bào phải đảm bảo yêu cầu: phôi sống, có tính di động mạnh, mạch máu xung quanh phôi thể rõ. Tuổi phôi không 12 ngày lâu phôi mọc lông, khó khăn trình xử lý tách mô phôi, gây tạp nhiễm tế bào. 34 PHỤ LỤC SỐ LIỆU VÀ XỬ LÝ THỐNG KÊ 3.1. SỐ LIỆU ĐỀ TÀI 3.1.1 Số liệu thử nghiệm: xác định liều an toàn dịch IgY tế bào xơ phôi vịt Bảng 3.1 Giá trị OD620 giếng thử nghiệm nồng độ dịch IgY thí nghiệm xác định liều an toàn cho tế bào xơ phôi vịt Bậc pha loãng Giá trị OD620 trung bình Giá trị OD620 1/2 0.09 0.081 0.08 0.106 0.081 0.088 0.079 0.095 0.0875 1/4 0.061 0.094 0.107 0.101 0.145 0.114 0.102 0.112 0.1045 1/8 0.103 0.097 0.103 0.098 0.158 0.111 0.103 0.115 0.111 1/16 0.106 0.092 0.127 0.075 0.132 0.102 0.131 0.114 0.109875 1/32 0.195 0.124 0.187 0.127 0.146 0.129 0.128 0.131 0.145875 1/64 0.227 0.234 0.228 0.219 0.219 0.232 0.224 0.219 0.22525 1/128 0.232 0.294 0.217 0.218 0.205 0.234 0.149 0.238 0.235875 1/256 0.231 0.209 0.295 0.231 0.237 0.242 0.237 0.207 0.236125 1/512 0.226 0.214 0.205 0.251 0.212 0.298 0.268 0.226 0.2375 1/1024 0.221 0.233 0.233 0.243 0.248 0.259 0.252 0.243 0.2415 0.234 0.217 0.254 0.225 0.312 0.223 0.291 0.213 0.246125 ĐC ĐC: đối chứng 35 Bậc pha loãng Giá trị OD620 trung bình Giá trị OD620 1/2 0.092 0.083 0.088 0.087 0.086 0.087 0.009 0.091 0.088 1/4 0.107 0.107 0.107 0.102 0.106 0.112 0.117 0.116 0.10925 1/8 0.105 0.100 0.096 0.106 0.101 0.116 0.112 0.114 0.10625 1/16 0.097 0.098 0.099 0.108 0.105 0.117 0.114 0.116 0.10675 1/32 0.170 0.145 0.169 0.172 0.161 0.153 0.171 0.162 0.162875 1/64 0.212 0.212 0.207 0.191 0.193 0.218 0.211 0.171 0.201875 1/128 0.232 0.228 0.219 0.226 0.263 0.213 0.171 0.201 0.231625 1/256 0.224 0.239 0.219 0.224 0.253 0.222 0.229 0.238 0.231 1/512 0.224 0.236 0.218 0.225 0.227 0.302 0.234 0.216 0.23525 1/1024 0.229 0.205 0.261 0.269 0.255 0.213 0.218 0.227 0.234625 0.205 0.291 0.234 0.216 0.221 0.249 0.218 0.214 0.2231 ĐC ĐC: đối chứng Bảng 3.3 Giá trị OD620 giếng thí nghiệm đưa độ pha loãng dịch IgY vào môi trường tế bào sau 12 gây nhiễm DHV-1 Bậc pha loãng x x/10 x/100 x/100 Giá trị OD620 0.139 0.128 0.141 0.097 0.101 0.107 0.088 0.088 0.141 0.114 0.133 0.096 0.12 0.1 0.097 0.098 0.139 0.133 0.135 0.097 0.104 0.104 0.097 0.095 0.134 0.185 0.133 0.097 0.094 0.103 0.1 0.101 0.131 0.127 0.132 0.096 0.092 0.092 0.086 0.09 0.136 0.12 0.163 0.094 0.092 0.103 0.105 0.102 0.133 0.119 0.155 0.101 0.095 0.186 0.123 0.148 0.134 0.117 0.167 0.104 0.207 0.191 0.144 0.101 0.165 0.125 0.156 0.155 0.096 0.176 0.163 0.136 X: Nồng độ dịch IgY với hàm lượng 1,688.100 mg/ml X/10: Nồng độ dịch IgY với hàm lượng 1,688.10-1 mg/ml X/100: Nồng độ dịch IgY với hàm lượng 1,688.10-2 mg/ml X/1000: Nồng độ dịch IgY với hàm lượng 1,688.10-3 mg/ml ĐC TB: môi trường tế bào sinh phẩm, virus. 36 0.125 0.122 0.121 0.145 0.091 0.103 0.102 0.101 ĐCV R ĐCT B 0.102 0.0.84 0.101 0.097 0.101 0.083 0.099 0.102 0.196 0.195 0.196 0.193 0.195 0.194 0.223 0.272 ĐCVR: môi trường tế bào sinh phẩm, gây nhiễm 500 TCID50 virus 37 Bảng 3.4 Giá trị OD620 giếng thí nghiệm đưa độ pha loãng dịch IgY vào môi trường tế bào sau 24 gây nhiễm DHV-1 Bậc pha loãng x x/10 x/100 x/100 ĐCV R Giá trị OD620 0.092 0.112 0.137 0.063 0.069 0.058 0.064 0.083 0.132 0.114 0.075 0.062 0.126 0.074 0.071 0.079 0.192 0.098 0.08 0.066 0.066 0.093 0.073 0.083 0.092 0.102 0.091 0.065 0.065 0.069 0.072 0.095 0.095 0.094 0.156 0.079 0.065 0.062 0.079 0.066 0.084 0.111 0.105 0.072 0.071 0.072 0.071 0.108 0.098 0.121 0.074 0.081 0.072 0.064 0.068 0.085 0.129 0.094 0.074 0.061 0.071 0.069 0.201 0.064 0.153 0.145 0.076 0.062 0.063 0.058 0.061 0.067 0.073 0.098 0.074 0.066 0.13 0.064 0.068 0.058 0.068 0.094 0.104 0.063 0.114 0.057 0.125 0.069 ĐCT B 0.169 0.27 0.267 0.181 0.174 0.163 0.162 0.184 X: Nồng độ dịch IgY với hàm lượng 1,688.100 mg/ml X/10: Nồng độ dịch IgY với hàm lượng 1,688.10-1 mg/ml X/100: Nồng độ dịch IgY với hàm lượng 1,688.10-2 mg/ml X/1000: Nồng độ dịch IgY với hàm lượng 1,688.10-3 mg/ml ĐC TB: môi trường tế bào sinh phẩm, virus. ĐCVR: môi trường tế bào sinh phẩm, gây nhiễm 500 TCID50 virus Bảng 3.5 Giá trị OD620 giếng thí nghiệm đưa độ pha loãng dịch IgY vào môi trường tế bào trước 12 gây nhiễm DHV-1 Bậc pha loãng X x/10 x/100 x/100 ĐCV R Giá trị OD620 0.165 0.137 0.111 0.109 0.114 0.122 0.094 0.089 0.173 0.173 0.128 0.115 0.146 0.113 0.094 0.086 0.171 0.122 0.113 0.242 0.107 0.111 0.087 0.075 0.174 0.119 0.114 0.113 0.158 0.108 0.089 0.08 0.165 0.14 0.124 0.123 0.124 0.118 0.082 0.094 0.167 0.129 0.124 0.18 0.109 0.115 0.098 0.097 0.178 0.113 0.131 0.168 0.109 0.11 0.101 0.098 0.183 0.137 0.121 0.103 0.109 0.116 0.088 0.09 X: Nồng độ dịch IgY với hàm lượng 1,688.100 mg/ml X/10: Nồng độ dịch IgY với hàm lượng 1,688.10-1 mg/ml X/100: Nồng độ dịch IgY với hàm lượng 1,688.10-2 mg/ml X/1000: Nồng độ dịch IgY với hàm lượng 1,688.10-3 mg/ml 38 0.181 0.13 0.114 0.106 0.106 0.109 0.086 0.087 0.16 0.145 0.105 0.097 0.122 0.105 0.08 0.089 0.112 0.1 0.109 0.09 0.089 0.105 0.109 0.102 ĐCT B 0.246 0.224 0.238 0.236 0.256 0.216 0.238 0.222 ĐC TB: môi trường tế bào sinh phẩm, virus. ĐCVR: môi trường tế bào sinh phẩm, gây nhiễm 500 TCID50 virus Bảng 3.6 Giá trị OD620 giếng thí nghiệm đưa độ pha loãng dịch IgY vào môi trường tế bào trước 24 gây nhiễm DHV-1 Bậc pha loãng x x/10 x/100 x/100 ĐCV R Giá trị OD620 0.297 0.122 0.129 0.128 0.129 0.122 0.125 0.122 0.146 0.158 0.128 0.127 0.132 0.123 0.107 0.112 0.223 0.127 0.133 0.128 0.13 0.127 0.124 0.128 0.209 0.164 0.139 0.124 0.126 0.124 0.122 0.112 0.265 0.124 0.129 0.126 0.131 0.115 0.102 0.122 0.237 0.128 0.135 0.128 0.121 0.131 0.105 0.112 0.194 0.123 0.143 0.13 0.124 0.136 0.111 0.142 0.144 0.145 0.196 0.17 0.125 0.234 0.108 0.106 0.14 0.121 0.131 0.133 0.134 0.13 0.122 0.12 0.125 0.123 0.13 0.124 0.124 0.155 0.1 0.134 0.136 0.128 0.127 0.132 0.139 0.138 0.135 0.14 X: Nồng độ dịch IgY với hàm lượng 1,688.100 mg/ml X/10: Nồng độ dịch IgY với hàm lượng 1,688.10-1 mg/ml X/100: Nồng độ dịch IgY với hàm lượng 1,688.10-2 mg/ml X/1000: Nồng độ dịch IgY với hàm lượng 1,688.10-3 mg/ml ĐC tế bào: môi trường tế bào sinh phẩm, virus. ĐC virus: môi trường tế bào sinh phẩm, gây nhiễm 100 TCID50 virus 39 ĐCT B 0.224 0.237 0.236 0.241 0.231 0.246 0.246 0.227 3.2 Xử lý thống kê 3.2.1 So sánh khả gây độc tế bào xơ phôi vịt độ pha loãng bậc dịch IgY theo giá trị OD620 Two-Sample T-Test and CI: 1/2, DC Two-sample T for 1/2 vs DC 1/2 DC N 16 16 Mean 0.08775 0.2386 StDev 0.00673 0.0325 SE Mean 0.0017 0.0081 Difference = mu (1/2) - mu (DC) Estimate for difference: -0.15081 95% CI for difference: (-0.16838, -0.13325) T-Test of difference = (vs not =): T-Value = -18.20 16 P-Value = 0.000 DF = P-Value = 0.000 DF = P-Value = 0.000 DF = Two-Sample T-Test and CI: 1/4, DC Two-sample T for 1/4 vs DC 1/4 DC N 16 16 Mean 0.1069 0.2386 StDev 0.0165 0.0325 SE Mean 0.0041 0.0081 Difference = mu (1/4) - mu (DC) Estimate for difference: -0.13169 95% CI for difference: (-0.15057, -0.11281) T-Test of difference = (vs not =): T-Value = -14.46 22 Two-Sample T-Test and CI: 1/8, DC Two-sample T for 1/8 vs DC 1/8 DC N 16 16 Mean 0.1086 0.2386 StDev 0.0147 0.0325 SE Mean 0.0037 0.0081 Difference = mu (1/8) - mu (DC) Estimate for difference: -0.12994 95% CI for difference: (-0.14851, -0.11136) T-Test of difference = (vs not =): T-Value = -14.59 20 Two-Sample T-Test and CI: 1/16, DC Two-sample T for 1/16 vs DC 1/16 DC N 16 16 Mean 0.1083 0.2386 StDev 0.0150 0.0325 SE Mean 0.0038 0.0081 Difference = mu (1/16) - mu (DC) Estimate for difference: -0.13025 95% CI for difference: (-0.14884, -0.11166) 40 T-Test of difference = (vs not =): T-Value = -14.57 21 P-Value = 0.000 DF = Two-Sample T-Test and CI: 1/32, DC Two-sample T for 1/32 vs DC 1/32 DC N 16 16 Mean 0.1544 0.2386 StDev 0.0225 0.0325 SE Mean 0.0056 0.0081 Difference = mu (1/32) - mu (DC) Estimate for difference: -0.08419 95% CI for difference: (-0.10447, -0.06390) T-Test of difference = (vs not =): T-Value = -8.53 26 P-Value = 0.000 DF = P-Value = 0.012 DF = P-Value = 0.642 DF = P-Value = 0.606 DF = Two-Sample T-Test and CI: 1/64, DC Two-sample T for 1/64 vs DC 1/64 DC N 16 16 Mean 0.2136 0.2386 StDev 0.0167 0.0325 SE Mean 0.0042 0.0081 Difference = mu (1/64) - mu (DC) Estimate for difference: -0.02500 95% CI for difference: (-0.04391, -0.00609) T-Test of difference = (vs not =): T-Value = -2.74 22 Two-Sample T-Test and CI: 1/128, DC Two-sample T for 1/128 vs DC 1/128 DC N 16 16 Mean 0.2338 0.2386 StDev 0.0249 0.0325 SE Mean 0.0062 0.0081 Difference = mu (1/128) - mu (DC) Estimate for difference: -0.0048 95% CI for difference: (-0.0258, 0.0161) T-Test of difference = (vs not =): T-Value = -0.47 28 Two-Sample T-Test and CI: 1/256, DC Two-sample T for 1/256 vs DC 1/256 DC N 16 16 Mean 0.2336 0.2386 StDev 0.0203 0.0325 SE Mean 0.0051 0.0081 Difference = mu (1/256) - mu (DC) Estimate for difference: -0.00500 95% CI for difference: (-0.02470, 0.01470) T-Test of difference = (vs not =): T-Value = -0.52 25 41 Two-Sample T-Test and CI: 1/512, DC Two-sample T for 1/512 vs DC 1/512 DC N 16 16 Mean 0.2364 0.2386 StDev 0.0291 0.0325 SE Mean 0.0073 0.0081 Difference = mu (1/512) - mu (DC) Estimate for difference: -0.0022 95% CI for difference: (-0.0245, 0.0201) T-Test of difference = (vs not =): T-Value = -0.20 29 P-Value = 0.842 DF = P-Value = 0.958 DF = Two-Sample T-Test and CI: 1/1024, DC Two-sample T for 1/1024 vs DC 1/1024 DC N 16 16 Mean 0.2381 0.2386 StDev 0.0187 0.0325 SE Mean 0.0047 0.0081 Difference = mu (1/1024) - mu (DC) Estimate for difference: -0.00050 95% CI for difference: (-0.01986, 0.01886) T-Test of difference = (vs not =): T-Value = -0.05 23 3.2.2. Hiệu bảo vệ tế bào IgY thời điểm cấp sinh phẩm khác Hiệu bảo vệ tế bào IgY sau 12 gây nhiễm với DHV-1 One-way ANOVA: X, X/10, X/100, X/1000, ĐCVR, ĐCTB Source Factor Error Total DF 90 95 S = 0.02595 Level X X/10 X/100 X/1000 ĐCVR ĐCTB N 20 20 20 20 8 SS 0.069622 0.060624 0.130246 MS 0.013924 0.000674 R-Sq = 53.45% Mean 0.13335 0.12590 0.11785 0.10825 0.09612 0.20800 StDev 0.01649 0.02607 0.03797 0.02217 0.00797 0.02769 F 20.67 P 0.000 R-Sq(adj) = 50.87% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+---------+---------+---------+-------(--*--) (-*--) (-*--) (--*--) (----*----) (----*----) -+---------+---------+---------+-------0.080 0.120 0.160 0.200 Pooled StDev = 0.02595 Grouping Information Using Tukey Method ĐCTB X N 20 Mean 0.20800 0.13335 Grouping A B 42 X/10 X/100 X/1000 ĐCVR 20 20 20 0.12590 0.11785 0.10825 0.09612 B C B C C C Means that not share a letter are significantly different. Hiệu bảo vệ tế bào IgY sau 24 gây nhiễm với DHV-1 One-way ANOVA: x, x/10, x/100, x/1000, ĐCVR, ĐCTB Source Factor Error Total DF 90 95 S = 0.02809 Level x x/10 x/100 x/1000 ĐCVR ĐCTB N 20 20 20 20 8 SS 0.104645 0.071039 0.175684 MS 0.020929 0.000789 R-Sq = 59.56% Mean 0.11145 0.08095 0.07405 0.08080 0.08675 0.19625 StDev 0.02779 0.02501 0.01987 0.03075 0.02583 0.04527 F 26.52 P 0.000 R-Sq(adj) = 57.32% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -----+---------+---------+---------+---(--*--) (--*--) (---*--) (--*--) (----*----) (----*----) -----+---------+---------+---------+---0.080 0.120 0.160 0.200 Pooled StDev = 0.02809 Grouping Information Using Tukey Method ĐCTB x ĐCVR x/10 x/1000 x/100 N 20 20 20 20 Mean 0.19625 0.11145 0.08675 0.08095 0.08080 0.07405 Grouping A B B C C C C Means that not share a letter are significantly different. Hiệu bảo vệ tế bào IgY trước 12 gây nhiễm với DHV-1 One-way ANOVA: x, x/10, x/100, x/1000, ĐCVR, ĐCTB Source Factor Error Total DF 90 95 S = 0.02047 Level x x/10 N 20 20 SS 0.141340 0.037699 0.179039 MS 0.028268 0.000419 R-Sq = 78.94% Mean 0.15310 0.12705 StDev 0.02291 0.03376 F 67.49 P 0.000 R-Sq(adj) = 77.77% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev ----+---------+---------+---------+----(-*) (*-) 43 x/100 x/1000 ĐCVR ĐCTB 20 20 8 0.11655 0.08920 0.10200 0.23450 0.01345 0.00680 0.00865 0.01326 (-*-) (-*-) (-*--) (--*--) ----+---------+---------+---------+----0.100 0.150 0.200 0.250 Pooled StDev = 0.02047 Grouping Information Using Tukey Method ĐCTB x x/10 x/100 ĐCVR x/1000 N 20 20 20 20 Mean 0.23450 0.15310 0.12705 0.11655 0.10200 0.08920 Grouping A B C C D D E E Means that not share a letter are significantly different. Hiệu bảo vệ tế bào IgY trước 24 gây nhiễm với DHV-1 One-way ANOVA: x, x/10, x/100, x/1000, ĐCVR, ĐCTB Source Factor Error Total DF 90 95 S = 0.02844 Level x x/10 x/100 x/1000 ĐCVR ĐCTB N 20 20 20 20 8 SS 0.096207 0.072776 0.168982 MS 0.019241 0.000809 R-Sq = 56.93% Mean 0.17290 0.13770 0.13445 0.12095 0.13438 0.23600 StDev 0.04918 0.01748 0.02212 0.01537 0.00493 0.00825 F 23.80 P 0.000 R-Sq(adj) = 54.54% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev ---+---------+---------+---------+-----(--*--) (--*---) (---*--) (--*--) (----*----) (----*----) ---+---------+---------+---------+-----0.120 0.160 0.200 0.240 Pooled StDev = 0.02844 Grouping Information Using Tukey Method ĐCTB x x/10 x/100 ĐCVR x/1000 N 20 20 20 20 Mean 0.23600 0.17290 0.13770 0.13445 0.13438 0.12095 Grouping A B C C C C Means that not share a letter are significantly different. 44 45 [...]... tài Hiệu quả kháng thể kháng virus viêm gan vịt type 1 được tạo từ lòng đỏ trứng gà trong điều kiện in vitro Mục tiêu đề tài Xác định được hiệu quả bảo vệ tế bào nguyên bào sợi vịt (DEF) của kháng thể IgY kháng virus viêm gan vịt type 1 tại các thời điểm bổ sung sinh phẩm khác nhau Thử nghiệm xác định hiệu quả bảo vệ tế bào DEF của kháng thể IgY làm cơ sở cho thử nghiệm xác định hiệu quả bảo vệ vịt. .. sợi vịt được tạo từ phôi vịt 9 -11 ngày tuổi (trứng được mua từ đàn vịt không tiêm vaccine viêm gan vịt và được xác định không chứa kháng thể kháng virus viêm gan vịt qua phản ứng trung hòa huyết thanh) Virus viêm gan vịt type 1 được phân lập tại Vĩnh Long (chủng virus này được giám định là type 1, subtype 3 –DHAV-3 tại Viện Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ) Kháng thể IgY kháng virus viêm gan. .. 27 /16 mg/ml sẽ được sử dụng trong thí nghiệm xác định hoạt tính virus 4.3 HOẠT TÍNH BẢO VỆ TẾ BÀO DEF CỦA KHÁNG THỂ IgY KHÁNG DHV -1 TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO Dịch kháng thể IgY với hàm lượng ban đầu là 1, 688 mg/ml được pha loãng theo bậc 10 thành 4 nồng độ 10 0, 10 -1, 10 -2, và 10 -3 tương ứng hàm lượng kháng thể IgY là 1, 688 .10 0mg/ml, 1, 688 .10 -1mg/ml, 1, 688 .10 -2mg/ml và 1, 688 .10 -3mg/ml được đưa vào môi... 4 .1 Bảng 4 .1 Tỷ lệ xuất hiện CPE do virus DHV -1 gây ra theo nồng độ virus trên lớp đơn tế bào DEF Nồng độ pha loãng virus Có CPE Số tổng hợp Không có CPE Có CPE Không có CPE Tỷ lệ giếng có CPE (%) 10 0 8 0 33 0 10 0,00 10 -1 8 0 25 0 10 0,00 10 -2 8 0 17 0 10 0,00 10 -3 5 3 9 3 75,00 10 -4 3 5 4 8 33,33 10 -5 1 7 1 15 6,25 10 -6 0 8 0 23 0 10 -7 0 8 0 31 0 10 -8 0 8 0 39 0 10 -9 0 8 0 47 0 10 -10 0 8 0 55 0 10 -11 ... vật đó Kháng thể sản xuất từ lòng đỏ sẽ thu được nhiều kháng thể hơn so với sản xuất kháng thể từ huyết thanh, vì gà có thể khai thác trong thời gian dài Động vật có vú không thể khai thác huyết thanh thường xuyên được Sản lượng trứng gà lại cao 300 trứng/ năm mà mỗi trứng cho hàm lượng IgY ít nhất là 10 0 mg/ trứng Xuất phát từ nhu cầu tìm một phương thức trị bệnh viêm gan vịt type 1 đem lại hiệu quả. .. kháng nguyên rõ ràng (Nguyễn Đức Hiền, 2 012 ) Virus viêm gan vịt type 3: là RNA virus, có đường kính 30nm, virus được phân loại là Piconavirus nhưng không liên quan đến type 1 vì không có kháng nguyên chung qua kiểm tra bằng kỹ thuật trung hòa virus và kháng thể quỳnh quang (Nguyễn Đức Hiền, 2 012 ) 2 .1. 2 Sức đề kháng của virus viêm gan vịt Virus viêm gan vịt có sức đề kháng cao, không bị bất hoạt khi xử lý... của sinh phẩm này đối với bệnh viêm gan vịt do virus 1 Chương 2 CƠ SỞ LÝ LUẬN 2 .1 VIRUS VIÊM GAN VỊT 2 .1. 1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại virus Bệnh viêm gan vịt do virus (Duck Virus Hepatitis - DHV) là bệnh truyền nhiễm cấp tính do một RNA virus rất nhỏ, xuyên qua được màng lọc Beckfeld và Seitz (Levine and Fabricant, 19 50) Theo Reuss (19 59) dưới kính hiển vi điện tử virus viêm gan vịt là... TCID50/0 ,1 ml được tính theo công thức của Reed & Muench (19 38) 10 -1 10-2 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6 -6 10 -7 10 -8 10 -9 10 -10 10 -11 ĐCTB Hình 3 .1 Bố trí thí nghiệm xác định liều TCID50/ 0 ,1 ml 10 Đĩa với các giếng đã có lớp tế bào DEF Pha loãng dịch virus với tỷ lệ 1: 10 MTPL, phân phối vào các tube nhỏ Đặt các tube này trên đá lạnh Hút cạn môi trường, rửa 1 lần với đệm DPBS Cho 10 0 µl mỗi nồng độ pha loãng virus. .. Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh viêm gan vịt do virus là bệnh truyền nhiễm cấp tính lây lan nhanh gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi vịt (Nguyễn Xuân Bình, 2002) Bệnh chủ yếu xảy ra ở vịt con 1- 3 tuần tuổi với tỷ lệ chết cao từ 50-90%, có khi tới 10 0% Bệnh cũng có thể gặp ở vịt mới nở hoặc vịt 5-6 tuần tuổi (Hồ Thị Việt Thu và ctv, 2 012 ) Virus viêm gan vịt hiện có 3 type: 1, 2 và 3 Trong đó, virus viêm gan vịt. .. của dịch IgY 1/ 2 0,088d ± 0,002 Tỷ lệ tế bào sống trung bình (%) 36,82 1/ 4 0 ,10 7c ± 0,004 44,77 Bậc pha loãng Giá trị OD620 ( X ± SEM) c 1/ 8 0 ,10 9 ± 0,004 45, 61 1 /16 0 ,10 8c ± 0,004 45 ,19 b 66,96 a 0 ,15 4 ± 0,006 1/ 32 1/ 64 0, 214 ± 0,004 89,54 1/ 128 0,234a ± 0,006 97, 91 a 1/ 256 0,234 ± 0,005 97, 91 1/ 512 0,236a ± 0,007 98,75 a 99,58 a 10 0,00 0,238 ± 0,004 1/ 1024 0,239 ± 0,004 ĐC (-) Những số trong cùng một . làm đề tài trong phòng thí nghiệm virus học. iv TÓM LƯỢC Đề tài Hiệu quả kháng thể kháng virus viêm gan vịt type 1 được tạo từ lòng đỏ trứng gà trong điều kiện in vitro . Được tiến hành. SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN THÚ Y Đề tài: “Thử nghiệm hiệu quả bảo nguyên bào sợi vịt của kháng thể kháng virus viêm gan vịt type 1 tạo từ lòng đỏ trứng gà trong điều kiện In vitro ’ do sinh. NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN THÚ Y TRẦN NGUYỄN TUẤN PHƯƠNG HIỆU QUẢ KHÁNG THỂ KHÁNG VIRUS VIÊM GAN VỊT TYPE 1 ĐƯỢC TẠO TỪ LÒNG ĐỎ TRỨNG GÀ TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO LUẬN