Mục tiêu: Xác định tác động của dịch IgY lên khả năng sống của tế bào DEF và qua đó chọn nồng thích hợp sử dụng cho các thí nghiệm sau.
Cơ chế nhuộm MTT: MTT là loại thuốc nhuộm được dùng trong xác định độc tố tế bào của một tác nhân nghiên cứu hoặc đánh giá sự phát triển của tế bào nuôi cấy (Mosmann. 1983). Khi cho vào môi trường tế bào, MTT có màu vàng sẽ chuyển thành tinh thể formazan đỏ tía dưới tác dụng của enzyme dehydrogenase của ty thể trong tế bào sống. Do đó, lượng tinh thể sinh ra sẽ phụ thuộc mật độ tế bào sống có trong môi trường. Tinh thể muối này không hòa tan được trong dung dịch có nước và được giữ lại trong tế bào. Những tinh thể có thể hòa tan được trong isopropanol có tính acid hoặc Dimethyl sulfoxide (DMSO) cho dung dịch đỏ tía mà sau đó được đánh giá bằng phương pháp đo bước sóng. Giá trị OD thu được tỷ lệ thuận với lượng tinh thể hình thành trong tế bào sống, qua đó đánh giá được mức tăng trưởng của tế bào cũng như tác động gây chết tế bào của tác nhân nghiên cứu.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hành trên đĩa 96 giếng với 10 nồng độ dịch IgY được pha loãng theo bậc 2, nồng độ ban dầu tương ứng27/2 mg/ml. Mỗi nồng độlặp lại 8 lần. Đối chứng tế bào là môi trường tế bào DEF không cho dịch IgY chỉ cho MTDT. Tính độc của dịch IgY tỷ lệ nghịch với khả năng sống của tế bào, được xác định qua phương pháp nhuộm MTT và đo OD620 kết hợp việc quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi soi ngược.
Chỉ tiêu theo dõi
- Hình thái thảm tế bào DEF khi quan sát dưới kính hiển vi soi ngược: có hay không CPE và mức độ CPE nếu có.
- Giá trị OD620 đo được ở mỗi giếng. - Tỷ lệ tế bào sống trung bình.
Tiến hành: Việc xác định liều an toàn của dịch IgY đối với tế bào DEF được tiến hành theo phương pháp của Meager (2002) như sơ đồ sau
Sơ đồ 3.4 Qui trình xác định liều an toàn của dịch IgY đối với tế bào DEF
Tác động gây độc của sinh phẩm thể hiện qua việc làm chết tế bào nuôi cấy, biểu hiện CPE, được đánh giá bằng phương pháp nhuộm MTT và mật độ quang OD620. Giá trị OD620 sẽ tỷ lệ thuận với số lượng tế bào sống. Do vậy, sinh phẩm càng ít độc thì mật độ tế bào sống càng nhiều giá trị OD620 đo được càng cao và ngược lại.
Tỷ lệ sống trung bình ở độ pha loãng X của IgY= (OD620X /OD620ĐC)x100 (a)
OD620X: Giá trị OD620 trung bình đo được ở các giếng thử nghiệm với độ pha loãng X
OD620ĐC: Giá trị OD620 trung bình đo được ở các giếng đối chứng tế bào Tính độc tế bào của dịch IgY được đánh giá qua chỉ số CC50 (50% cytotoxic concentration) là nồng độ dịch IgY làm giảm 50% khả năng sống của tế bào. Chỉ số này được xác định khi so sánh với giá trị OD620 đo được làm giảm 50% khả năng sống của tế bào DEF và được tính theo công thức (b).
Giá trị OD620 làm giảm 50% khả năng sống của tế bào = OD620ĐC/2 (b) OD620ĐC: Giá trị OD620 trung bình đo được ở các giếng đối chứng
Liều an toàn cho tế bào của dịch IgY là hàm lượng IgY không gây độc cho tế bào DEF, thể hiện qua giá trị OD620 không khác biệt so với đối chứng.
Pha loãng dịch IgY /MTDT đến nồng độ thích hợp, phân phối vào các tube nhỏ Đĩa với các giếng đã có lớp đơn tế bào DEF
Hút bỏ MTTT, rửa 1 lần với đệm DPBS
Cho 100 µl mỗi nồng độ dịch kháng thể IgY vào các giếng thí nghiệm, 100 µl MTDT vào các giếng đối chứng
Hút cạn giếng, rửa 1 lần với đệm DPBS. Cho 50 µl MTT (5 mg/ml) vào từng giếng
Loại MTT, cho 100 µl isopropanol vào các giếng. Lắc máy 30 phút, 600 vòng/ phút rồi đọc OD620
72 giờ ủ 370C, 5% CO2
Xác địnhnồng độ gây độc 50% tế bào DEF 4 giờ ủ 370C, 5% CO2, tránh sáng