IgY ĐỐI VỚI TẾ BÀO DEF
Dịch kháng thể IgY dùng thử nghiệm với hàm lượng ban đầu là 27 mg/ml được pha loãng theo bậc 2 thành 10 nồng độ, đưa vào môi trường DEF đã phủ 90% bề mặt đáy giếng. Sau khi ủ 72 giờ, kiểm tra hình thái lớp tế bào đồng thời tiến hành nhuộm MTT và đo OD620, ghi nhận kết quả.
Dưới kính hiển vi soi ngược, các giếng tế bào ủ với nồng độ IgY ban đầu, độ pha loãng 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 và 1/32 xuất hiện rõ các biểu hiện gây độc của IgY đối với tế bào DEF. Cụ thể, ở nồng độ đầu tiên (27/2 mg/ml) đã làm chết tế bào ngay sau 1 ngày, tế bào co tròn và có xu hướng bong khỏi bề mặt đĩa, tiếp tủ ủ đến ngày thứ 3, tế bào bong tróc khỏi đáy giếng. Nồng độ 27/2 mg/ml tế bào chết nhiều, đa số tế bào co tròn và kết thành cụm và chết. Nồng độ 27/32 mg/ml tế bào chết ít, sau đó phục hồi và phát triển với khuynh hướng hình thành các cụm tế bào, hoặc phát triển thành từng mảng tế bào. Tế bào xử lý với dịch kháng IgY ở những độ pha loãng cao hơn, tuy vẫn có tế bào chết lơ lửng nhưng lớp đơn tế bào vẫn phát triển bình thường như tế bào DEF ở các giếng đối chứng.
Sau khi khảo sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi, đĩa thí nghiệm xác định liều an toàn cho tế bào của dịch IgY được nhuộm MTT và đo mật độ quang (bước sóng 620 nm) kết quả thể hiện qua hình 4.2 và bảng 4.2.
50 - 75 75 - 33,33
Hình 4.1 Hình ảnh tế bào DEF dưới tác động gây độc của IgY ở những nồng độ khác nhau
A: ĐC (-) B: IgY, HL 27/2 mg/ml
C: IgY, HL 27/4 mg/ml D: IgY, HL 27/8 mg/ml
Bảng 4.2 Giá trị OD620 và tỷ lệ tế bào sống trung bình trong thí nghiệm xác định liều an toàn của dịch IgY
Những số trong cùng một cột có chữ mũ khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05)
ĐC (-): Đối chứng (tế bào DEF không cho dịch IgY)
X : Giá trị OD620 trung bình, SEM: trung bình sai số chuẩn
0 20 40 60 80 100 120 Bậc pha loãng Tỷ lệ tế bào sống (%)
Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ tế bào sống trung bình của tế bào DEF với các nồng độ kháng thể IgY khác nhau
Bậc pha loãng Giá trị OD620 (X ± SEM) Tỷ lệ tế bào sống trung bình (%) 1/2 0,088d ± 0,002 36,82 1/4 0,107c ± 0,004 44,77 1/8 0,109c ± 0,004 45,61 1/16 0,108c ± 0,004 45,19 1/32 0,154b ± 0,006 66,96 1/64 0,214a ± 0,004 89,54 1/128 0,234a ± 0,006 97,91 1/256 0,234a ± 0,005 97,91 1/512 0,236a ± 0,007 98,75 1/1024 0,238a ± 0,004 99,58 ĐC (-) 0,239a ± 0,004 100,00 100,00 36,82 44,77 45,61 45,19 66,96 89,54 97,91 97,91 98,75 99,58
Theo bảng 4.2 và biểu đồ 4.1 cho thấy giá trị OD620 đo được phù hợp với kết quả ghi nhận hình ảnh dưới kính hiển vi lúc 72 giờ. Tế bào DEF xử lý với IgY với nồng độ ban đầu, độ pha loãng 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 có giá trị OD620 (và tỷ lệ tế bào sống trung bình) lần lượt là 36,82 %, 44,77%, 45,61% và 45,19%) đều khác biệt có ý nghĩa so với giá trị OD620 ở các giếng đối chứng (không có dịch IgY) (P < 0,05). Trong đó, giá trị OD620 thấp nhất là ở nồng độ IgY ban đầu (27/2 mg/ml), thể hiện qua màu tím nhạt hơn ở tất cả các giếng ở các độ pha loãng còn lại chứng tỏ số lượng tế bào sống bám trên đáy giếng ít và IgY ở nồng độ ban đầu có tính gây độc cao cho tế bào DEF. Tương tự, màu tím nhạt và giá trị OD620 thấp ở các độ pha loãng tiếp 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 thấy sinh phẩm vẫn còn biểu hiện gây độc tế bào. Dịch IgY từ độ pha loãng 1/32 trở đi không còn gây độc cho tế bào DEF, thể hiện qua các giá trị OD620 khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với giá trị OD620 đối chứng (P > 0,05). Giá trị OD620 làm giảm 50% khả năng sống của tế bào là 0,120 (công thức b), giá trị nằm giữa hai giá trị OD620 của hai độ pha loãng 1/16 và 1/32. Như vậy hàm lượng dịch IgY làm giảm 50% khả năng sống của tế bào trong khoảng 27/16 mg/ml đến 27/32 mg/ml, hàm lượng dịch IgY ở khoảng độ pha loãng 1/32 trở đi được xác định là liều an toàn không gây độc tế bào DEF.
Nhìn chung, dựa trên giá trị OD620 kết hợp với quan sát CPE trên thảm tế bào DEF, dịch IgY đã có biểu hiện gây độc đối với tế bào DEF, tính độc này xảy ra ở độ pha loãng có hàm lượng IgY cao 27 mg/ml đến 27/16 mg/ml. Dịch IgY từ nồng độ thấp hơn 27/16 mg/ml sẽ được sử dụng trong thí nghiệm xác định hoạt tính virus.