khảo sát sự ảnh hưởng của các loại môi trường lên sự phát triển của nấm nomuraea rileyi (farlow) samson và hiệu lực của các loại nấm ký sinh trên sâu ăn tạp (spodoptera litura fabricius)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG NGUYỄN THÀNH CÔNG KHẢO SÁT SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG LÊN SỰ PHÁT TRIỂN CỦA NẤM Nomuraea rileyi Farlow Samson VÀ H

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

NGUYỄN THÀNH CÔNG

KHẢO SÁT SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG LÊN SỰ PHÁT TRIỂN CỦA NẤM

Nomuraea rileyi (Farlow) Samson VÀ HIỆU LỰC CỦA

CÁC LOẠI NẤM KÝ SINH TRÊN SÂU ĂN TẠP

(Spodoptera litura Fabricius)

Luận văn tốt nghiệp Ngành: BẢO VỆ THỰC VẬT

Cần Thơ, 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp Ngành: BẢO VỆ THỰC VẬT

Tên đề tài:

KHẢO SÁT SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC LOẠI MÔI

TRƯỜNG LÊN SỰ PHÁT TRIỂN CỦA NẤM

Nomuraea rileyi (Farlow) Samson VÀ HIỆU LỰC CỦA

CÁC LOẠI NẤM KÝ SINH TRÊN SÂU ĂN TẠP

(Spodoptera litura Fabricius)

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

PGs.TS Trần Văn Hai Nguyễn Thành Công

Lớp: TT1073A1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN BẢO VỆ THỰC VẬT

-o0o -Luận văn tốt nghiệp Kỹ sư Bảo Vệ Thực Vật với đề tài:

KHẢO SÁT SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG LÊN SỰ

PHÁT TRIỂN CỦA NẤM Nomuraea rileyi (Farlow) Samson VÀ HIỆU LỰC CỦA CÁC LOẠI NẤM KÝ SINH TRÊN SÂU ĂN TẠP (Spodoptera litura

Fabricius)

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thành Công

Kính trình lên Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp

Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2014

Cán bộ hướng dẫn

PGs TS Trần Văn Hai

Ks Nguyễn Thị Diệu Hương

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN BẢO VỆ THỰC VẬT

-o0o -Hội đồng chấm tốt nghiệp luận văn đã chấp nhận luận văn tốt nghiệp Kỹ sư Bảo Vệ Thực Vật với đề tài: KHẢO SÁT SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG LÊN SỰ PHÁT TRIỂN CỦA NẤM Nomuraea rileyi (Farlow) Samson VÀ HIỆU LỰC CỦA CÁC LOẠI NẤM KÝ SINH TRÊN SÂU ĂN TẠP (Spodoptera litura Fabricius) Do sinh viên Nguyễn Thành Công thực hiện Ý kiến của hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp

Luận văn tốt nghiệp hội đồng đánh giá ở mức

Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2014

BCN khoa Nông Nghiệp & SHƯD

LƯỢC SỬ CÁ NHÂN

Họ tên sinh viên: Nguyễn Thành Công

Giới tính: Nam

Ngày sinh: 16/04/1992

Con ông: Nguyễn Anh Chiến và bà: Nguyễn Thị Bạch Tuyết

Quê quán: ấp Hòa Phú 4, thị trấn An Châu, huyện Châu Thành, tỉnh An Giang

Sơ lược quá trình học tập:

Từ năm 1998 –2003: học tại trường Tiểu học Lê Văn Nhung, thành phố Long Xuyên, tỉnh An Giang

Từ năm 2003 – 2007: học tại trường Trung học cơ sở Lý Thường Kiệt, thành phố Long Xuyên, tỉnh An Giang

Từ năm 2007 – 2010: học tại trường Trung học phổ thông chuyên Thoại Ngọc Hầu, thành phố Long Xuyên, tỉnh An Giang

Từ năm 2010 – 2014: học tại trường Đại Học Cần Thơ Tốt nghiệp Kỹ sư ngành Bảo vệ thực vật năm 2014

LỜI CAM ĐOAN

Chúng tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình luận văn nào trước đây

Tác giả luận văn

Nguyễn Thành Công

LỜI CẢM TẠ

Kính dâng!

Cha, mẹ suốt đời tận tụy vì sự nghiệp và tương lai chúng con

Tỏ lòng biết ơn sâu sắc

Thầy Trần Văn Hai và cô Nguyễn Thị Diệu Hương đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu giúp em hoàn thành đề tài tốt nghiệp này

Chân thành cảm ơn

Thầy cố vấn học tập Lê Văn Vàng cùng toàn thể thầy cô khoa Nông Nhiệp

và Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ đã truyền đạt những kiến thức và tâm huyết vô cùng quý báu cho em trong suốt thời gian học tập tại trường Đặc biệt

là quý thầy cô thuộc bộ môn Bảo Vệ Thực Vật đã tận tình chỉ bảo và tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành luận văn này

Xin chân thành cám ơn các bạn lớp Bảo Vệ Thực Vật khóa 36, các anh chị phòng thí nghiệm Phòng trừ sinh học 2, các em lớp Bảo Vệ Thực Vật khóa 37, khóa

38, khóa 38 LT đã tận tình giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình làm đề tài

Thân gửi về

Các bạn lớp Bảo Vệ Thực Vật khóa 36, chúc các bạn luôn thành công và hạnh phúc trong tương lai

Trân trọng!

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH SÁCH BẢNG iii

DANH SÁCH HÌNH iv

DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT v

TÓM LƯỢC vi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

1.1.NẤM Nomuraea rileyi 2

1.1.1 Nguồn gốc và lịch sử nghiên cứu 2

1.1.2 Phân loại 2

1.1.3 Đặc điểm sinh học và hình thái 3

1.1.4 Cách thức lây nhiễm 3

1.1.5 Khả năng sinh độc tố diệt côn trùng 4

1.1.5.1 Độc chất 4

1.1.5.2 Enzyme 5

1.2 NẤM Nomuraea atypicola 5

1.3 NẤM Paecilomyces sp 6

1.4 NẤM Verticillium sp 7

1.5 Sâu ăn tạp 7

1.5.1 Ký chủ 7

1.5.2 Phân loại 8

1.5.3 Đặc điểm hình thái và sinh học 8

1.5.4 Tập tính sinh sống và cách gây hại 9

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 11

2.1.1 Thời gian và địa điểm 11

2.1.2 Vật liệu và dụng cụ 11

2.1.3 Các môi trường nuôi cấy nấm Nr 11

2.2 PHƯƠNG PHÁP 13

2.2.1 Thí nghiệm trong phòng thí nghiệm 13

2.2.1.1 Thí nghiệm về các điều kiện ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của nấm Nomuraea rileyi 13

2.2.1.2 Thí nghiệm hiệu lực nấm 15

2.2.2 Thí nghiệm trong nhà lưới 17

2.2.2.1 Các bước chuẩn bị 17

2.2.2.2 Bố trí thí nghiệm 17

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19

3.1 KHẢ NĂNG SINH BÀO TỬ VÀ KHUẨN LẠC CỦA NẤM Nomuraea rileyi TRÊN 4 LOẠI MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 19

3.1.1 Khả năng sinh trưởng khuẩn lạc của nấm Nomuraea rileyi trên 4 loại môi trường thử nghiệm 19

3.1.2 Khả năng sinh bào tử của nấm Nomuraea rileyi trên 4 loại môi trường thử nghiệm 20

3.2 KHẢ NĂNG SINH BÀO TỬ VÀ KHUẨN LẠC CỦA NẤM Nomuraea rileyi Ở CÁC NHIỆT ĐỘ KHÁC NHAU TRÊN MÔI TRƯỜNG MAYP1 22 3.2.1 Khả năng sinh trưởng khuẩn lạc của nấm Nr ở các nhiệt độ khác nhau

3.2.2 Khả năng sinh bào tử của nấm Nr ở các nhiệt độ khác nhau trên môi

trường MAYP1 23

3.3 KHẢO SÁT HIỆU LỰC CÁC LOÀI NẤM TRÊN SÂU ĂN TẠP TRONG ĐIỀU KIỆN PHÒNG THÍ NGHIỆM 24

3.3.1 Độ hữu hiệu các loài nấm trên sâu ăn tạp trong điều kiện phòng thí nghiệm 24

3.3.2 Tỷ lệ sâu ăn tạp nhiễm nấm trong điều kiện phòng thí nghiệm 26

3.4 KHẢO SÁT HIỆU LỰC CÁC LOÀI NẤM TRÊN SÂU ĂN TẠP TRONG ĐIỀU KIỆN NHÀ LƯỚI 26

3.4.1 Độ hữu hiệu các loài nấm trên sâu ăn tạp trong điều kiện nhà lưới 26

3.4.2 Tỷ lệ sâu ăn tạp nhiễm nấm trong điều kiện nhà lưới 28

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35

4.1 KẾT LUẬN 35

4.2 ĐỀ NGHỊ 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO 37

DANH SÁCH BẢNG

3.1 Đường kính khuẩn lạc của nấm Nomuraea rileyi trên các môi trường

khác nhau ở 14, 21, 28, 35 ngày sau khi cấy

19

3.2 Số lượng bào tử nấm Nomuraea rileyi trên các môi trường khác nhau

ở 14, 21, 28, 35 ngày sau khi cấy

20

3.3 Đường kính khuẩn lạc của nấm Nomuraea rileyi ở các nhiệt độ khác

nhau trên môi trường MAYP1 tại 14, 21, 28, 35 ngày sau khi cấy

22

3.4 Số lượng bào tử của nấm Nomuraea rileyi ở các nhiệt độ khác nhau

trên môi trường MAYP1 tại 14, 21, 28, 35 ngày sau khi cấy

DANH SÁCH HÌNH

3.1 Biểu đồ biến động hiệu lực của các loài nấm lên sâu ăn tạp qua các

thời điểm khác nhau ở phòng thí nghiệm

25

3.2 Biểu đồ biến động hiệu lực của các loài nấm lên sâu ăn tạp qua các

thời điểm khác nhau ở nhà lưới

28

3.5 Nấm Nr trên môi trường MAYP1 ở nhiệt độ 250C và 200C ở 35

DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ

Nguyễn Thành Công, 2014 “Khảo sát sự ảnh hưởng của các loại môi trường lên

sự phát triển của nấm Nomuraea rileyi (Farlow) Samson và hiệu lực của các loại nấm ký sinh trên sâu ăn tạp (Spodoptera litura Fabricius)” Luận văn tốt

nghiệp Kỹ sư Bảo Vệ Thực Vật, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng Trường Đại học Cần Thơ

TÓM LƯỢC

Với mục đích khảo sát sự ảnh hưởng của các loại môi trường và nhiệt độ mà

nấm Nomuraea rileyi phát triển tốt nhất, làm tiền đề cho các thí nghiệm sau trong

phòng thí nghiệm, đồng thời đánh giá hiệu quả phòng trừ sinh học của các loại nấm

ký sinh trên sâu ăn tạp (Spodoptera litura Fabricius), vì vậy đề tài “Khảo sát sự ảnh hưởng của các loại môi trường lên sự phát triển của nấm Nomuraea rileyi (Farlow) Samson và hiệu lực của các loại nấm ký sinh trên sâu ăn tạp (Spodoptera

litura Fabricius)” được thực hiện Đề tài được thực hiện từ tháng 3/2013 đến tháng

3/2014 tại phòng thí nghiệm Phòng trừ sinh học 2 và nhà lưới bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ Kết quả thí nghiệm đạt được như sau:

Đối với thí nghiệm trên nấm Nomuraea rileyi trong điều kiện phòng:

- Thí nghiệm 1: MAYP1 là môi trường có ĐKKL là 38,50 mm và SLBT cao nhất là 2,47x108 bào tử/ đĩa ở 35 NSKC so với 3 loại môi trường MAY, MAYR, MAYP2

- Thí nghiệm 2: Nhiệt độ tốt nhất cho sự sinh trưởng của nấm trên môi trường

MAYP1 là 25oC với ĐKKL là 39,60 mm và SLBT là 3,60x108 bào tử/ đĩa ở

35 NSKC Nhiệt độ càng giảm sự phát triển của nấm càng kém

Đối với thí nghiệm hiệu lực của các loại nấm Nomuraea rileyi, Nomuraea

atypicola, Verticillium sp., Paecilomyces sp trên sâu ăn tạp trong điều kiện

phòng:

- Thí nghiệm 3: So sánh hiệu lực của các loại nấm trên sâu ăn tạp trong điều

kiện phòng thí nghiệm

Nấm Nomuraea rileyi có hiệu lực cao nhất là 92,50% tại thời điểm 12 NSKN

và cho tỷ lệ nhiễm nấm trở lại đạt 95,22% tại thời điểm 19 NSKN

Đối với thí nghiệm hiệu lực của các loại nấm Nomuraea rileyi, Nomuraea

atypicola, Verticillium sp., Paecilomyces sp trên sâu ăn tạp trong điều kiện nhà

lưới:

- Thí nghiệm 4: Nấm Nomuraea rileyi có hiệu lực cao nhất là 67,25% tại thời

điểm 12NSKP và cho tỷ lệ nhiễm nấm trở lại đạt 96,34% tại thời điểm 19 NSKP

MỞ ĐẦU

Trong sản xuất nông nghiệp, việc sử dụng thuốc hóa học quá nhiều ngày càng làm tăng tính kháng thuốc, giảm hiệu quả thuốc đối với côn trùng gây hại và đồng thời cũng triệt tiêu các sinh vật có lợi trong tự nhiên Bên cạnh đó việc canh tác này làm cho sức khỏe con người và sự cân bằng sinh thái trong tự nhiên bị ảnh hưởng nghiêm trọng

Do đó những năm gần đây, biện pháp sinh học trong quản lý dịch hại đang ngày càng được áp dụng rộng rãi Theo Nguyễn Văn Đĩnh (2004), quản lý dịch hại hiện đại phụ thuộc nhiều vào biện pháp sinh học bởi vì đó là biện pháp bền vững

và an toàn nhất

Hiện nay trên thế giới, có nhiều loài nấm ký sinh côn trùng khác nhau như

Verticillium sp., Beauveria bassiana… và trong đó thì nấm bột xanh Nomuraea rileyi là loài có tiềm năng được sử dụng như là một biện pháp phòng trừ sinh học

Tuy nhiên ở Việt Nam, việc ứng dụng loài nấm này vẫn chưa được nhân rộng Việc tìm hiểu các đặc điểm và điều kiện phát triển của loài nấm này trong điều kiện phòng thí nghiệm sẽ là tiền đề cho các thí nghiệm trong phòng trừ sinh học

Đối với Sâu ăn tạp Spodoptera litura (Fabricius), đây là một loài có phổ ký

chủ rộng và thích nghi với điều kiện khí hậu và thời tiết khác nhau, gây hại trên nhiều cây trồng như rau, cải, bắp, đậu, khoai… theo Nguyễn Văn Huỳnh (2011), sâu có thể cắn phá tất cả các bộ phận khác nhau của cây như lá, thân, cành, trái non nên có ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất của cây Việc dùng thuốc hóa học quá nhiều với liều lượng cao càng làm cho việc phòng trị loài này trở nên khó khăn do sâu ăn tạp là loài sâu có tính kháng thuốc mạnh Điều này đặt ra tầm quan trọng của việc áp dụng các biện pháp phòng trừ sinh học để quản lý và phòng trừ loài dịch hại này

Do đó đề tài “Khảo sát sự ảnh hưởng của các loại môi trường lên sự

phát triển của nấm Nomuraea rileyi (Farlow) Samson và hiệu lực của các loại nấm ký sinh trên sâu ăn tạp (Spodoptera litura Fabricius)” được thực hiên

CHƯƠNG 1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

1.1 NẤM Nomuraea rileyi

1.1.1 Nguồn gốc và lịch sử nghiên cứu

Năm 1709, sau những phát hiện đầu tiên của Balineri về nấm gây bệnh trên côn trùng và ngành khoa học nghiên cứu bệnh lý côn trùng đã ra đời (trích dẫn của Lương Thị Hoàng Dung, 2013)

Năm 1974, Samson là người đầu tiên miêu tả về loài nấm ký sinh côn trùng

Nomuraea rileyi (trích dẫn của Ignoffo et al., 1989) Vào năm 1975, Spenkel và

Brooks đã ghi nhận nấm N rileyi nhiễm hầu hết các loài côn trùng thuộc bộ

Lepidoptera gây hại chủ yếu trên cây họ đậu, nhất là đậu nành ở miền nam California (Mỹ) Đến 1976, nhóm nghiên cứu của Ignoffo đã tiến hành đánh giá hiệu quả của loài nấm này trên nhiều loài sâu hại thuộc bộ cánh vảy và ông kết

luận rằng nấm N rileyi là nấm ký sinh côn trùng quan trọng có khả năng kiểm soát

sinh học trên các loài ngài đêm thuộc bộ cánh vảy

Năm 1988 tại Philippin, Robach và Aguda đã điều tra xác định thành phần vi sinh vật hiện diện trong ruộng lúa, đây là công việc cần thiết để lựa chọn vi sinh

vật ký sinh phổ biến (trong đó có loài nấm bột xanh N rileyi) và mục đích để bảo

tồn và nhân rộng chúng vào công tác phòng trừ sâu hại cây trồng theo hướng sinh học (Phạm Thị Thùy, 2011)

1.1.2 Phân loại

Theo Phạm Thị Thùy (2004) xếp theo hệ thống phân loại nấm của

Anisworth, 1966, 1970, 1971 cho rằng nấm Nomuraea rileyi thuộc

Loài: Nomuraea rileyi

1.1.3 Đặc điểm sinh học và hình thái

Nấm Nomuraea rileyi còn gọi tên khác là nấm bột hay nấm bột xanh Nấm

thường gây bệnh trên ấu trùng bướm đêm và khi tấn công vào cơ thể ký chủ thì toàn thân ký chủ được bao phủ bởi lớp sợi nấm mỏng màu trắng, như hạt bụi, từ

đó phát sinh nhiều cuống bào tử đính và bào tử xuất hiện sẽ có màu xanh lá cây từ nhạt đến đậm dần (Humber, 2006)

Khuẩn lạc nấm N rileyi khi được nuôi cấy trên môi trường PMA, sợi nấm

phát triển chậm sau 4-5 ngày, ban đầu sợi nấm có màu trắng phát triển nhanh sau 20-25 ngày, ngừng phát triển sau 30 ngày (Theo Phạm Thị Thùy, 2011)

Dưới kính hiển vi sợi nấm N rileyi có vách ngăn, trong suốt và cuống bào

tử đính thẳng có vách ngăn Các thể bình được hình thành gần vách ngăn phát triển thành vòng xoắn xung quanh cuống bào tử đính như dạng buồng chuối Mỗi thể bình chứa 2-4 bào tử đơn dạng elip, bào tử có màu xanh lá cây (3-4 x 2-3 µm)

1.1.4 Cách thức lây nhiễm

Nấm ký sinh côn trùng cũng có lợi thế tốt hơn so với các tác nhân phòng trừ sinh học khác là chúng có khả năng tấn công tất cả các giai đoạn phát triển của côn trùng bao gồm cả giai đoạn nhộng

Theo Kumar et al., (1997) mô tả tiến trình ký sinh của loài nấm ký sinh côn trùng N rileyi trên ấu trùng tằm Bombyx mori (B mori) như sau: Sự xâm nhập của

bào tử nấm vào con côn trùng được bắt đầu bằng bào tử nẩy mầm trên da của ấu

trùng B mori trong vòng 24 giờ và xuyên qua lớp biểu bì trong vòng 36 giờ sau đó

khi được đặt ở nhiệt độ 240C và 80% ẩm độ Sự xâm nhập của bào tử và phát triển

sợi nấm trong toàn bộ cơ thể ấu trùng và sợi nấm xâm nhiễm cả vào trong khoang máu của ấu trùng sau 6 - 7 ngày, sợi nấm chiếm toàn bộ các cơ quan bên trong cơ thể ấu trùng, chúng tiếp tục mọc dài ra và bao phủ toàn bộ ấu trùng bởi một màu trắng sau 7-8 ngày Một đến hai ngày sau đó trên bề mặt ấu trùng được phủ bởi lớp bào tử màu xanh lá cây từ nhạt đến đậm dần Chu kỳ xâm nhiễm và ký sinh của

bào tử nấm N rileyi trên cơ thể ấu trùng tằm B mori hoàn thành trong 10-11 ngày

Tương tự, trên sâu ăn tạp quá trình nhiễm nấm N rileyi được bắt đầu với sự bám dính của bào tử trên lớp biểu bì của côn trùng và chu kỳ ký sinh của N rileyi trên sâu ăn tạp Spodoptera litura kéo dài khoảng 8-9 ngày (Srisukchayakul et al ,

2005; Padanad and Krishnaraj, 2009)

Theo Phạm Thị Thùy (2004) nguyên nhân gây bệnh chủ yếu ở các lo à i

nấ m ký s inh côn trùng là lây lan từ con bệnh sang con khỏe thông qua tiếp xúc trực tiếp với nhau Bên cạnh đó, bệnh vi nấm rất dễ lan truyền bằng va chạm đơn giản, mà ở một số bệnh vi sinh vật khác hầu như không xảy ra Nguồn nấm gây bệnh thường lây lan nhờ gió, mưa, chim, và tạo thành những ổ bệnh kéo dài theo chiều gió thổi, kết quả này cũng phù hợp với kết quả đã công bố của Garcia

and Ignoffo., (1977) cho rằng gió là yếu tố quan trọng giúp phát tán bào tử N

rileyi ký sinh trên sâu hại ở các ruộng đậu nành

1.1.5 Khả năng sinh độc tố diệt côn trùng

1.1.5.1 Độc chất

Pendland và Boucias (1985), đã phát hiện có sự hiện diện của hoạt chất

Hemagglutinin trong máu của loài sâu Anticarsia gemmatalis khi bị nhiễm nấm N

rileyi, chất này gây ra hiện tượng ngưng tụ máu và làm côn trùng chết

Theo Prompiboon et al., (2008), trong quá trình tìm kiếm các chất gây độc tế bào được sản xuất bởi nấm N rileyi, đã xác định hợp chất gây độc tố tế bào Sf9 là

ergosterol peroxit (5α, 8α-epidioxy-24(R)-methylcholesta-6, 22-dien-3β-ol Tương

tự, Sf21 được tìm thấy trên sâu bị nhiễm nấm N rileyi cũng có khả năng gây chết

tế bào côn trùng (Tseng et al., 2008)

1.1.5.2 Enzyme

Sự xâm nhiễm của các loài nấm ký sinh côn trùng bắt đầu với sự bám dính của bào tử nấm vào lớp da của côn trùng, sau đó tiếp tục xâm nhập vào lớp biểu bì của côn trùng Để thực hiện các hoạt động này thì nấm cần tiết ra các loại enzym

thủy phân bao gồm lipase, chitinases và protease Nấm N rileyi có khả năng sản

xuất các loại enzyme phân hủy lớp biểu bì như cellulase, chitinase, protease và

lipase (Mohamed et al., 1977, Boucias et al., 1982; Boucias, 1984)

Ngoài ra, Kamimura et al., (2012) đã xác định enzyme oxy hóa khử

ecdysteroid ở vị trí thứ 22 (E22O) được tiết ra từ loài nấm này có khả năng kiểm soát sự phát triển của côn trùng bằng cách ức chế lột xác và biến đổi trên cơ thể côn trùng Kết quả này phù hợp với nghiên cứu trước đó của Kiuchi et al.,(2003)

trên ấu trùng tằm B mori Nấm N rileyi có khả năng tiết ra các loại enzyme như

chitinase, protease và lipase để phân giải tinh bột, cellulose, chitin (Mohamed,

đặc, mỗi nhánh mang từ 2 đến 3 thể bình xung quanh Thể bình có kích thước 3.5 – 5 x 2 – 2.5µm, thường hình trụ, không có cuống hoặc cuống rất ngắn

Bào tử đính trong điều kiện khô hạn phân tán thành những chuỗi, hình trụ, hơi cong, vách nhẵn, màu trong suốt đến hơi tím, có kích thước 4 – 6 x 1.2 – 1.5µm Bào tử hữu tính màu tím xám, 20 – 30 x 2.7 – 3.5µm

Khuẩn lạc trên môi trường bột khuẩn mạch – agar phát triển nhanh, đạt kích thước 6cm trong vòng 4 tuần ở 25oC Đầu tiên có màu trắng, khi hình thành bào tử thì dần chuyển sang màu tím, càng già thì màu tím càng đậm Không có mùi và chất dịch

<http://www.bcrc.firdi.org.tw/fungi/fungal_detail.jsp?id=FU200802250030>

1.3 NẤM Paecilomyces sp

Xếp theo hệ thống phân loại nấm của Anisworth, 1966, 1970, 1971, Mccoy

và ctv (1988), Samson và ctv (1988) đã cho rằng nấm Paecilomyces sp thuộc

ngành phụ lớp nấm bất toàn Deuteromycetes, giống Paecilomyces

Nấm Paecilomyces sp phân lập trên côn trùng ngủ nghỉ trong đất Trên thế giới có rất nhiều loài, có phổ ký sinh côn trùng rộng Nấm Paecilomyces sp., tựa như nấm móc xanh (Penicillin) và nấm chổi (Gliocladium)

Khuẩn lạc của nấm Paecilomyces sp có thể có dạng thảm nhung, dạng bó

sợi, màu trắng, hồng nhạt hoặc tím đinh hương, nâu vàng và nâu xám, thỉnh thoảng có màu lục nhạt Cuống bào tử phân sinh phân nhánh, mức độ phân nhánh của nấm phình to, phía trên nhỏ và uốn cong Cuống bình thường sắp xếp dạng vòng hoặc không đồng đều Bào tử phân sinh đơn bào, không màu, mọc thành chuỗi, hình bầu dục, bề mặt nhẫn hoặc có gai ) (Trần Văn Mão, 2002, được trích dẫn bởi Nguyễn Thị Hồng Diễm 2009)

1.4 NẤM Verticillium sp

Xếp theo hệ thống phân loại nấm của G C Anisworth, 1966, 1970, 1971 (

Theo Phạm Thị Thùy, 2004), Mccoy và ctv (1988), Samson và ctv (1988) cho rằng nấm Verticillium sp thuộc ngành phụ nấm bất toàn (Deuteromycetes), giống

Verticillium

Nấm Verticillium sp đã được Stathers và các cộng sự của ông nghiên cứu

và nhận thấy rằng nấm phát triển tốt ở nhiệt độ 28oC (Phạm Thị Thùy, 2004) Ẩm

độ cao cũng là nhân tố quyết định đến sự hình thành bào tử, sự nẩy mầm và độc tố

của nấm Verticillium sp (Lacey và ctv., 1996)

Nấm Verticillium sp sản xuất ra độc tố được các nhà khoa học gọi là bassianolide, đây cũng là độc tố được sản xuất bởi nấm Beauveria bassiana (Kanaoka và ctv., 1978) Các nhà khoa học đã chứng minh được rằng chính độc tố

bassianolide trích từ nấm Ver là nhân tố quyết định hiệu quả phòng trừ đối với rầy mềm và rệp sáp trong điều kiện phòng thí nghiệm và cả ngoài đồng (Gindin và

và Lê Thị Sen, 2011)

1.5.3 Đặc điểm hình thái và sinh học

Giai đoạn trứng: Trứng có hình bán cầu, đường kính 0,4-0,5 mm Bề mặt

trứng có những đường khía dọc từ đỉnh trứng xuống đến đáy và bị cắt ngang bởi những đường khía ngang tạo thành những ô nhỏ Trứng mới đẻ có màu trắng vàng, sau chuyển thành màu tro, lúc sắp nở có màu tro đậm Ổ trứng có phủ lông

từ bụng bướm mẹ Thời gian ủ trứng từ 4-7 ngày

Giai đoạn ấu trùng: Sâu có 5-6 tuổi tùy điều kiện môi trường và phát triển

trong thời gian từ 20-25 ngày Sâu lớn đủ sức dài 35-53 mm, hình ống tròn Sâu tuổi nhỏ có màu xanh lục, càng lớn sâu chuyển dần thành màu nâu đậm

Toàn thân màu xanh ở tuổi nhỏ và màu nâu ở tuổi lớn với một sọc màu vàng sang ở hai bên hông chạy từ đốt thứ nhất đến đốt cuối của bụng Dọc theo đường ấy có những điểm hình bán nguyệt Từ đốt thứ nhất đến đốt thứ tám của bụng mỗi đốt có một chấm đen rõ, đây là điểm phân biệt của loài sâu này để phân biệt với các loài sâu khác cùng giống, trong số đó hai chấm đen của đốt thứ nhất to nhất và sâu càng lớn hai chấm này gần như giao nhau như một khoang đen trên lưng nên sau này còn có tên là “sâu khoang”

Giai đoạn nhộng: Nhộng sâu ăn tạp khi mới được hình thành có màu xanh

đọt chuối rất mềm, sau đó chuyển sang màu vàng xanh, cuối cùng có màu nâu đen,

ở các đốt của bụng có thể cử động được Nhộng dài 18-20 mm, màu nâu tươi hoặc màu nâu tối, cuối bụng có một đôi gai ngắn Thời gian nhộng là 7-10 ngày (Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2011)

Giai đoạn thành trùng: Bướm có chiều dài thân từ 20-25 mm, sải cách

rộng từ 35-45 mm Cánh trước có màu vàng, giữa cánh có vân trắng, cánh sau màu trắng óng ánh Bướm có đời sống trung bình từ 1-2 tuần tùy điều kiện thức ăn Trung bình một bướm cái có thể đẻ 300 trứng, nếu điều kiện thích hợp có thể đẻ từ 900-2000 trứng và thời gian đẻ trứng trung bình từ 5-7 ngày Ở đồng bằng sông Cửu Long khả năng đẻ trứng của một bướm cái khoảng 510 trứng/cặp nhưng có trường hợp đặc biệt lên đến 1440 trứng (Phạm Huỳnh Thanh Vân và Lê Thị Thùy

Minh, 2001)

1.5.4 Tập tính sinh sống và cách gây hại

Sâu ăn tạp là loài ưa điều kiện nóng ẩm, nhiệt độ thích hợp nhất cho sâu sinh trưởng phát dục là 29-30oC và độ ẩm không khí thích hợp là trên 90%

(Nguyễn Đức Khiêm, 2006)

Bướm thường vũ hóa vào buổi chiều và bay ra hoạt động vào lúc vừa tối Bướm hoạt động từ tối đến nửa đêm Bướm bay mạnh, có khi xa đến vài chục mét và cao đến 6-7 m Sau khi vũ hóa vài giờ bướm có thể bắt cặp và một ngày sau thì đẻ trứng

Sâu vừa nở ăn gặm vỏ trứng và sống tập trung, nếu bị động chúng có thể

bò phân tán ra chung quanh hoặc nhả tơ buông mình xuống đất Ở giai đoạn này sâu chỉ gặm mặt dưới lá, chừa biểu bì trên và gân Sang tuổi 2 sâu bắt đầu phân tán và ăn gặm lá nhiều hơn Từ tuổi 4 sâu bắt đầu có phản ứng rõ rệt đối với ánh sáng nên ban ngày sâu ẩn ở những nơi tối hoặc chui xuống kẻ đất nứt, ban đêm sâu leo lên cây

Trong những ngày trời râm mát hoặc mưa nhiều thì ban ngày sâu có thể bò hoạt động trên cây Ở tuổi lớn sâu có tập quán ăn thịt lẫn nhau và không những ăn phá lá cây mà còn ăn trụi cả thân cây, cành và trái non Khi sắp làm nhộng sâu

chui xuống đất làm thành một khoang và nằm yên trong đó hóa nhộng (Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2011)

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 PHƯƠNG TIỆN

2.1.1 Thời gian và địa điểm

- Thời gian thực hiện: Đề tài được thực hiện từ tháng 3/2013 đến tháng 3/2014

- Địa điểm: Thí nghiệm được thực hiện tại phòng Phòng Trừ Sinh Học 2, nhà lưới bộ môn Bảo Vệ Thực Vật  khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng  trường Đại Học Cần Thơ

2.1.2 Vật liệu và dụng cụ

- Nguồn nấm: Nomuraea rileyi có sẵn tại phòng thí nghiệm

- Nguồn sâu ăn tạp (Spodoptera litura Fabricius): thu sâu ăn tạp ngoài tự

nhiên sau đó nhân nuôi trên phòng thí nghiệm

- Cồn, nước cất, hóa chất dùng để nấu môi trường nuôi cấy nấm

- Tủ thanh trùng khô, tủ thanh trùng ướt, nồi nấu tan môi trường, tủ cấy

- Lam đếm Thoma, kính hiển vi, kính lúp sôi nổi

- Pipet, beaker, cốc thủy tinh 100ml, eppendorf, đĩa petri, đũa cấy, cọ lông, kéo, kẹp inox, bông gòn…

- Dụng cụ nuôi sâu, hộp nhựa 25 x 12 x 10cm, nhiệt ẩm kế

2.1.3 Các môi trường nuôi cấy nấm N rileyi

 Môi trường MAY

 Môi trường MAYP 1

2.2 PHƯƠNG PHÁP

2.2.1 Thí nghiệm trong phòng thí nghiệm

2.2.1.1 Thí nghiệm về các điều kiện ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của nấm Nomuraea rileyi

 Khảo sát khả năng sinh trưởng của khuẩn lạc và sự hình thành bào tử của

nấm Nomuraea rileyi

Thí nghiệm 1: Khảo sát sự sinh trưởng của khuẩn lạc và khả năng sinh bào

tử của nấm Nomuraea rileyi trên 4 loại môi trường MAY, MAYP1 , MAYP 2 , MAYR Kết quả được đánh giá bằng đường kính khuẩn lạc (ĐKKL) (mm) và số

lượng bào tử/ đĩa ghi nhận vào các ngày 14, 21, 28, 35 ngày sau khi cấy (NSKC), sau đó tìm ra môi trường mà nấm này phát triển tốt nhất

Thí nghiệm 2: Khảo sát sự sinh trưởng của khuẩn lạc và khả năng sinh bào

tử của nấm Nomuraea rileyi ở các nhiệt độ 25o C và 20 o C trên môi trường tốt nhất

được chọn ra từ 4 môi trường ở thí nghiệm 1 là MAYP 1 Kết quả được đánh giá

bằng ĐKKL (mm) và số lượng bào tử/ đĩa ghi nhận vào các ngày 14, 21, 28, 35 NSKC

 Chuẩn bị các khuẩn ty nấm Nomuraea rileyi

Sử dụng nấm Nomuraea rileyi đã được phân lập và tách ròng, cấy nguồn

nấm từ đĩa petri (có chứa 10 ml môi trường MAYP1) cho sợi nấm phát triển đầy trên đĩa, sau đó sử dụng dụng cụ đục lỗ với đường kính 10 mm, lấy từng khoanh khuẩn ty để chuẩn bị cho thí nghiệm

 Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm 1: Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên

với 4 nghiệm thức tương ứng với 4 loại môi trường MAY, MAYP1, MAYP2, MAYR và 4 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại tương ứng với 4 đĩa petri có chứa 10ml môi trường thí nghiệm

Thí nghiệm 2: Thí nghiệm

được bố trí theo thể thức hoàn toàn

ngẫu nhiên với 2 nghiệm thức

tương ứng với 2 nhiệt độ 25oC và

20oC (tại phòng thí nghiệm Phòng

trừ sinh học 2) Mỗi nghiệm thức có

4 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại tương

ứng với 4 đĩa petri có chứa 10ml

môi trường MAYP1

Ở mỗi đĩa cấy 1 khoanh

khuẩn ty nấm Nr có đường kính 10mm vào giữa đĩa

 Chỉ tiêu đánh giá

Lấy chỉ tiêu: đường kính phát triển của khuẩn lạc, số lượng bào từ nấm

- Đo đường kính khuẩn lạc: dùng thước chia vạch đo đường kính khuẩn lạc ở

mặt dưới của đĩa petri vào các ngày lấy chỉ tiêu

- Số lượng bào tử: Ở mỗi thời điểm lấy chỉ tiêu cho 4 ml nước cất thanh

trùng cho vào mỗi đĩa, sau đó dùng lame cạo nhẹ vào mặt môi trường để thu bào tử, lọc lấy huyền phù nấm, pha loãng huyền phù bằng nước cất thanh trùng ở 10-2 rồi đếm mật số bào tử trên lam đếm, xác định số lượng bào tử cho từng nghiệm thức

- Cách đếm: dùng micropipete hút lấy huyền phù có chứa bào tử nấm đã pha

loãng, nhỏ vào lame và đậy lamelle , đưa vào kính hiển vi để đếm bào tử ở

2.2.1.2 Thí nghiệm hiệu lực nấm

Thí nghiệm 3: Khảo sát hiệu lực các loại nấm trên sâu ăn tạp (SAT) trong

điều kiện phòng thí nghiệm

 Các bước chuẩn bị

- Bước 1: Chuẩn bị nguồn nấm: sử dụng nấm Nomuraea rileyi, Nomuraea

atypicola, Paecilomyces sp., Verticillium sp đã được phân lập và tách ròng

tại phòng thí nghiệm

- Bước 2: Chuẩn bị nguồn sâu sạch: Sâu ăn tạp được thu ngoài đồng nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm với thức ăn nhân tạo được nghiên cứu là tốt nhất cho sự phát triển của sâu (Trần Thị Thùy Dung, 2008) Sau đó lựa chọn những con đồng tuổi (tuổi 2) để làm thí nghiệm

- Bước 3: Tiến hành thí nghiệm

 Tính mật số bào tử nấm: tương tự như cách tính mật số bào tử của thí

nghiệm 1, 2

Sau khi tính mật số bào tử của dung dịch gốc thì tiến hành pha loãng các loại nấm ra nồng độ 108 bào tử/ ml và cho vào từng nghiệm thức chất bám dính Tween 20 (0.05%)

 Công thức pha loãng: C x V = C’ x V’

Trong đó: C: nồng độ dung dịch gốc

V: thể tích dung dịch gốc C’: nồng độ dung dịch cần pha V’: thể tích dung dịch cần pha

 Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 nghiệm thức tương ứng với 4 loại nấm và 1 nghiệm thức đối chứng Mỗi nghiệm thức có 4 lần lặp lại, mỗi lặp lại gồm 20 sâu ăn tạp tuổi 2, mỗi sâu ăn tạp được nuôi riêng trong hộp nhựa nhỏ có lót giấy thấm và bông gòn giữ ẩm (thêm 1 ml nước cất vào bông gòn) và cho sâu ăn bằng thức ăn nhân tạo (thay thức ăn mới 2 ngày/lần)

Nghiệm thức 1: Nomuraea rileyi

Nghiệm thức 2: Nomuraea atypicola

Nghiệm thức 3: Paecilomyces sp

Nghiệm thức 4: Verticillium sp

Nghiệm thức 5: Đối chứng (nước cất thanh trùng)

Pha dung dịch nấm cho vào 4 đĩa petri tương ứng với 4 nghiệm thức và 1 nghiệm thức đối chứng (mỗi đĩa 40 ml dung dịch) Sau đó nhúng SAT ở từng NT vào đĩa có chứa dung dịch tương ứng bằng dụng cụ dùng nhúng nấm, giữ trong 30 giây sau đó vớt ra Nghiệm thức đối chứng được tiến hành tương tự nhưng thay dung dịch nấm bằng nước cất

Sau đó chuyển SAT vào hộp nhỏ

 Cách lấy chỉ tiêu

- Ghi nhận số SAT chết sau 3, 5, 7, 9, 12 ngày sau khi xử lý nấm

- Ghi nhận nhiệt độ và ẩm độ tại thời điểm lấy chỉ tiêu

- Tính ĐHH bằng công thức Abbott, 1925 (trích dẫn bởi Trần Văn Hai, 2005)

- Tỷ lệ nhiễm nấm trở lại được tính bằng công thức:

+ Tween 20 (0.05%)