Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác MẪU PHÂN Mục tiêu • Hướng dẫn lâm sàng hay thực hay lấy mẫu phân làm xét nghiệm vi sinh lâm sàng phát tác nhân vi khuẩn gây bệnh nhờ biết cách lấy chuyên chở mẫu phân. • thực qui trình vi sinh lâm sàng mẫu phân cách xác thích hợp nhờ biết qui trình thực hiện. • Lựa chọn phương tiện thích hợp cho cấy phân bệnh viện nhờ biết phương tiện thích hợp để thực xét nghiệm vi sinh lâm sàng mẫu phân. Chỉ đònh cấy phân Chỉ đònh cấy phân bệnh nhân bò tiêu chảy hay bò rối loạn tiêu hoá nghi bò nhiễm trùng tiêu hóa. Đứng trước bệnh nhân có triệu chứng sau đây, nên cho đònh cấy phân: tiêu chảy, lỵ với phân có mủ, nhầy hay máu, bò đau bụng. Thời điểm lấy phân Nên lấy vào giai đoạn sớm, sớm tốt bệnh. Lấy phân khảo sát trước bệnh nhân dùng kháng sinh. Cách lấy mẫu phân Có thể lấy phân tươi, tốt vùng nhầy máu, cho vào lọ sạch; rộng miệng; nắp vặn chặt có gắn mái chèo (dùng lọ lấy mẫu phân không F2M), gửi đến phòng thí nghiệm. Phân tươi phải cấy vòng không sau lấy mẫu. Có thể dùng tăm nhúng vào phân, vùng nhầy máu, cho vào môi trường chuyên chở Cary-Blair (dùng cặp tube đũa tăm vô trùng/tube đũa Cary-Blair) gửi đến phòng thí nghiệm. Môi trường chuyên chở Cary-Blair giữ mẫu phân 48 giờ. Tuy 33 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác nhiên, phải tiến hành cấy sớm tốt. Trong trường hợp nghi bệnh nhân bò thổ tả (do vi khuẩn tả), cho tăm lấy phân vào ống môi trường peptone kiềm để vừa tăng sinh, vừa chuyên chở đến phòng thí nghiệm. Có thể lấy mẫu phân tăm quệt hậu môn cho vào môi trường chuyên chở (dùng cặp tube đũa tăm vô trùng/tube đũa Cary-Blair) để gửi đến phòng thí nghiệm. Có thể không dùng môi trường chuyên chở tăm lấy phân (dùng tăm vô trùng lấy mẫu) nuôi cấy vòng 30 phút sau lấy mẫu. Khảo sát đại thể Quan sát mẫu phân ghi nhận: Lỏng hay đặc? Có nhầy, có máu không? Màu: trắng, vàng, nâu đen? Có giun sán không? Khảo sát vi thể Chỉ khảo sát vi thể trường hợp sau: Làm phết soi tươi trường hợp nghi tả. Làm phết nhuộm Gram trường hợp nghi tả nghi Campylobacter jejuni. Nuôi cấy Có thể cấy phong phú vào môi trường - GN broth dể phong phú Salmonella lẫn Shigella. - Peptone kiềm để phong phú Vibrio. - Campy-thio để phong phú C. jejuni. Cấy phân, hay cấy từ môi trường phong phú cấy phân vào hộp thạch phân lập: - Tối thiểu MC (hay EMB) SS (hay XLD hay HE). - Nếu có yêu cầu tìm Vibrio, cấy thêm lên MEA hay TCBS. - Nếu có yêu cầu tìm C. jejuni cấy thêm Campy-CAP. - Nếu nghi nấm, cấy thêm thạch Sabouraud. 34 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Các hộp thạch phân lập phải ủ 35-37oC tủ ấm. Riêng hộp Campy-CAP ủ vi hiếu khí nhiệt độ 42oC. Quan sát hộp thạch sau ủ qua đêm, chọn khúm vi khuẩn nghi ngờ để tiến hành đònh danh làm kháng sinh đồ. Đối với khúm vi khuẩn nghi ngờ Salmonella hay Shigella làm phản ứng tụ với kháng huyết đặc hiệu để đònh nhóm hay đònh type. Các vi khuẩn tác nhân gây bệnh tìm thấy mẫu phân Các vi khuẩn chắn gây bệnh: Salmonella, Shigella, E. coli gây bệnh (ETEC, EPEC, EIEC, VETEC), S. aureus (có enterotoxin), V. cholerae Vibrio khác, Campylobacter jejuni Campylobacter khác, Yersinia enterocolitica Yersinia khác, Clostridium difficile (có toxin). Các vi khuẩn gây bệnh: Plesiomonas, Aeromonas. Các vi khuẩn khác gây bệnh chiếm đa số bò loạn khuẩn. Câu hỏi ôn tập 1. Cho biết đònh để cấy phân. 2. Hãy cho biết cách lấy mẫu phân nào? 3. Hãy cho biết phương tiện để lấy chuyên chở mẫu phân thích hợp cho bệnh viện nay, phân tích ưu khuyết điểm phương tiện này. 4. Hãy cho biết qui trình xét nghiệm vi sinh lâm sàng thực phòng thí nghiệm bệnh phẩm phân. 5. Hãy cho biết vi khuẩn gây bệnh gặp cấy phân. 35 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác CẤY PHÂN – Các câu hỏi thường gặp Phương tiện thích hợp để lấy chuyên chở mẫu phân? Nếu lấy mẫu phân tươi tốt dùng lọ có mái chèo gắn nắp để lấy mẫu. Cũng dùng tăm vô trùng để quệt lấy mẫu phân. Mẫu phân tươi phải gửi đến phòng thí nghiệm để làm xét nghiệm chậm trễ làm giảm hội phát vi khuẩn gây bệnh. Trong điều kiện nay, tốt dùng cặp tube đũa tăm vô trùng/tube đũa CaryBlair để lấy mẫu phân. Lý với phương tiện này, phòng thí nghiệm để dồn mẫu lại để cấy vào cuối ngày hay vào thời điểm thích hợp ngày mà không cần phải cấy nhận mẫu. Tránh dùng lọ penicillin rửa sạch, tube nắp gòn với tăm tự quấn hay lọ nhựa, hủ thuỷ tinh để lấy mẫu phân không an toàn khâu gửi mẫu hay thao tác xét nghiệm. Tại đa số trường hợp tiêu chảy xét nghiệm phân thường âm tính? Có thể bệnh bò tiêu chảy vi khuẩn mà nguyên nhân khác virus, thẩm thấu, đau bao tử, hay rối loạn tiêu hoá khác. Một tác nhân virus thường gây tiêu chảy Rota virus, phòng thí nghiệm vi sinh lâm sàng phát tác nhân có phương tiện sinh học phân tử (PCR, hay cần ly trích RNA toàn phần điện di để phát 11 vạch RNA đặc hiệu virus) hay miễn dòch (tụ latex hay điện di miễn dòch đối lưu để phát kháng nguyên đặc hiệu virus phân). Có thể bệnh nhân bò tiêu chảy tác nhân vi khuẩn khả phát phòng thí nghiệm thiếu phương tiện, hay phòng thí nghiệm kinh nghiệm để phát E. coli (EPEC, ETEC, EIEC, EHEC, VETEC), S. aureus tiết enterotoxin, mà muốn phát xác phải có thêm phương tiện miễn dòch hay sinh học phân tử; hay Campylobacter jejuni, Clostridium difficille, Y. enterocolitica, mà muốn phát phải có phương tiện nuôi cấy thích hợp; Vibrio cholerae, Aeromonas, Plesiomonas mà muốn phát phải có kinh nghiệm hay phải có quan tâm trước. Cũng không dùng phương tiện để lấy chuyên chở bệnh phẩm, kéo theo hậu vi khuẩn gây bệnh không nhiều bệnh phẩm, hay phòng thí nghiệm 36 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác chậm trễ làm xét nghiệm mẫu phân tươi không lấy vào môi trường chuyên chở. Ngoài nguyên phòng thí nghiệm phương tiện vi sinh tối thiểu để phân lập vi khuẩn gây bệnh mẫu phân đònh danh vi khuẩn gây bệnh có mẫu phân. Cuối cùng, bệnh nhân dùng kháng sinh trước lấy mẫu nên cấy vi khuẩn gây bệnh có phân, Với qui trình xét nghiệm vi sinh lâm sàng mẫu phân trình bày, có phải phát số tất vi khuẩn gây bệnh? Qui trình trình bày cho phép phát hầu hết vi khuẩn gây bệnh kể C. jejuni Vibrio spp. Chỉ có C. difficille, S. aureus sinh Enterotoxin Y. enterocolitica phát cần phải có thêm phương tiện nuôi cấy thích hợp, nhiên tác nhân không thường gặp. Với C. jejuni, vi khuẩn thường gặp, bệnh viện nên quan tâm để trang bò cho phòng thí nghiệm phương tiện nuôi cấy phát tác nhân (xem phần kỹ thuật phân lập C. jejuni). Với vi khuẩn E. coli gây bệnh, để phát EPEC, phòng thí nghiệm phải trang bò thêm kháng huyết phát (có thể mua từ Biorad). Với E. coli khác ETEC, EIEC, EHEC, VETEC muốn phát xác cần phải có thêm phương tiện miễn dòch hay sinh học phân tử (PCR). Với S. aureus sinh enterotoxin, để phát xác cần phải có thêm thuốc thử ELISA phát độc tố hay phương tiện sinh học phân tử phát enterotoxin gene kỹ thuật PCR. Với phòng thí nghiệm trang bò thêm phương tiện phát xác E. coli, không phát tác nhân vi khuẩn gây bệnh khác mà hộp thạch phân lập vi khuẩn E. coli lại chiếm đa số nên làm kháng sinh đồ vi khuẩn để trả lời kết cho lâm sàng. Các vi khuẩn không gây bệnh đường ruột Proteus, Klebsiella, Pseudomonas . tác nhân gây tiêu chảy trường hợp loạn khuẩn nên làm kháng sinh đồ trả lời kết cho lâm sàng chiếm đa số hộp thạch phân lập vi khuẩn gây bệnh khác. 37 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Hình 6: Lọ lấy phân tươi có trang bò mái chèo gắn nắp thuận tiện cho bệnh nhân lấy phân nắp vặn chặt tránh nguy rỉ phân miệng lọ Hình 7: Lọ lấy phân khảo sát ký sinh trùng có túi F2M sẵn sàng để dùng bảo quản phân khảo sát ký sinh trùng. Với lọ lưu mẫu tuần. Hình 8: Cặp tube đũa tăm vô trùng/môi trường chyên chở Cary-Blair giúp lưu mẫu phân 48 38 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Sơ đồ 3: QUI TRÌNH VI SINH LÂM SÀNG KHẢO SÁT MẪU PHÂN Phân tươi Cấy Cary-Blair D0 MT tăng sinh GN broth (peptone kiềm cho Vibrio, hay Campy-thio cho C. jejuni; có yêu cầu ) Có thể chờ đến chiều Ủ 37oC/6-8h Môi trường phân lập 1. MC/EMB 2. SS/HE/XLD 3. (nếu có yêu cầu : TCBS, MEA cho Vibrio; Campy-BAP cho C. jejuni) Ủ 37oC/qua đêm. (Đối với Campy-BAP ủ vi hiếu khí 42oC tiếp tục qui trình cho C. jejuni ) D1 Chọn khúm VK nghi ngờ • không lên men lactose • khúm E. coli • khúm ưu Cấy tăng sinh lên BA/NA Ủ 37oC/từ sáng đến chiều Kháng sinh đồ Đònh type, group Đònh danh KQ sơ bộ: type group VK gây bệnh D2 KQ chung Đònh danh 39 KSĐ Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Kỹ thuật phân lập Campylobacter jejuni Lấy mẫu Mẫu lấy tươi gửi đến phòng thí nghiệm để làm xét nghiệm ngay. Nếu để chậm trễ mẫu phải lấy vào môi trường chuyên chở/tăng sinh Campy-thio. Phân lập Campylobacter jejuni Có thể cấy phân lập ngay, hay giữ tăng sinh mẫu Campy - thio tủ ấm 42oC – cấy phân lập. Có hai cách: Phân lập trực tiếp: Cấy bệnh phẩm phương pháp chiều môi trường Campy – BAP, ủ hộp thạch bình ủ kỵ khí (Genbox-anaer bio-Mérieux) dùng bao sinh vi hiếu khí (Microanaer bio-Mérieux). Giữ bình tủ ấm 42oC 24 đến 48 giờ. Phân lập qua lọc: Dùng lọc cellulose acetate 0.65µm vô trùng đặt mặt hộp thạch Campy – BAP kháng sinh. Dùng pipette Pasteur vô trùng hút bệnh phẩm hay dung dòch tăng sinh bệnh phẩm, nhỏ – 15 giọt lên tâm giấy lọc. Ủ ngữa hộp thạch tủ ấm 37oC hay 42oC giờ. Sau lấy tờ giấy lọc khỏi mặt thạch, tránh không cho bệnh phẩm nhỏ trực tiếp lên mặt thạch. Ủ hộp thạch nầy điều kiện vi hiếu khí trên. Đònh danh Campylobacter jejuni Sau ủ, quan sát mặt thạch. C. jejuni cho khuẩn lạc tiêu biểu: màu xám nhạt hay xám vàng nhạt, nhầy, có đuôi theo đường cấy (hình 10). Kích thước lớn: 1.5 – mm. Nhuộm Gram, vi khuẩn ăn màu Gram [-], nhỏ, hình cong, thấy dạng dặc trưng hình cánh chim hải âu. Đôi có hình dấu ngã (hình 9). Soi tươi qua kính hiển vi đảo phase hay đen, thấy vi khuẩn di động tên bắn. Thử nghiệm oxidase [+], catalase [+] Hội đủ yếu tố đònh danh Campylobacter jejuni. 40 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Môi trường cần thiết để phân lập C. jejuni Dung dòch kháng sinh 100X Công thức Vancomycin 100mg Trimethoprim 50mg Polymyxin B 25000UI Amphotericin B 20mg Cephalothin 150mg Nước cất 100ml Vô trùng qua lọc milipore. Phân phối vào chai, chai 2ml để chế 200 ml môi trường. Giữ chai tủ đông –70oC Môi trường chuyên chở/tăng sinh Campy-thio Công thức Thioglycolate media 30gr Bacto agar 1.6gr Nước cất 1000ml Đun tan môi trường agar, để nguội, chỉnh pH đến 7.2. Phân vào chai Duran loại 250ml nắp vặn chặt, chai cho vào xác 200ml môi trường. Hấp khử trùng 121oC/15 phút. Để nguội, thêm vào chai 2ml dung dòch kháng sinh 100X trên. Có thể để nguyên chai tủ lạnh 4oC, hay phân phối vô trùng 5ml Campy-thio vào tube 15 x 125mm vô trùng nắp vặn chặt giữ tủ lạnh 4oC (không tháng). Môi trường phân lập Campy-BAP Công thức Brucella agar base 43gr Nước cất 1000ml Đun tan môi trường agar, để nguội, chỉnh pH đến 7.2. Phân vào chai Duran 250ml nắp vặn chặt, chai 200ml môi trường. Khử trùng hấp ướt 121oC/15 phút. Để nguội đến 45oC, thêm vào chai 10ml máu cừu fibrin 41 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác 2ml dung dòch kháng sinh 100X trên. Lắc nhẹ để trộn đều, tránh bọt. Đổ vào hộp petrie vô trùng loại 90 mm, hộp đổ 18 – 20 ml môi trường. Chờ đặc lại hoàn toàn. Giữ hộp thạch tủ lạnh (không tháng). Hình 9: Hình ảnh Gram vi khuẩn Campylobacter jejuni Hình 10: Hình ảnh khúm vi khuẩn Campylobacter jejuni thạch Campy-BAP 42 . SÁT MẪU PHÂN Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau 40 Kỹ thuật phân lập Campylobacter jejuni Lấy mẫu Mẫu có thể lấy tươi gửi đến phòng thí nghiệm để làm xét nghiệm. Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau 33 MẪU PHÂN Mục tiêu • Hướng dẫn được lâm sàng hay thực hiện hay lấy đúng mẫu phân làm xét nghiệm vi sinh lâm sàng. biết qui trình xét nghiệm vi sinh lâm sàng thực hiện tại phòng thí nghiệm đối với bệnh phẩm phân. 5. Hãy cho biết các vi khuẩn gây bệnh có thể gặp được trong cấy phân. Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh