Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác MẪU SINH DỤC Mục tiêu • Thực lấy bệnh phẩm đường sinh dục biết cách lấy loại bệnh phẩm đường sinh dục đối tượng bệnh nhân khác nhau. • Thực đầy đủ bước phân tích kết để không bỏ sót hội phát tác nhân vi khuẩn gây bệnh biết qui trình thực vi sinh lâm sàng mẫu lấy từ đường sinh dục. • Phát tác nhân thường gây nhiễm trùng lây truyền đường sinh dục dù khó mọc biết phương tiện cần thiết thích hợp để thực xét nghiệm vi sinh lâm sàng mẫu lấy từ đường sinh dục. Chỉ đònh Khi nghi ngờ nhiễm trùng bệnh lây truyền đường sinh dục (đàn ông, đàn bà) hay bò huyết trắng nghi nhiễm trùng (đàn bà). Thời điểm Càng sớm tốt, giai đoạn đầu bệnh. Trước dùng kháng sinh. Cách lấy bệnh phẩm 1. Ở đàn ông √ Tụt da qui đầu sau, dùng cồn 70% lau da qui đầu, chờ khô. √ Bệnh nhân vút nhẹ dương vật dọc theo ống đái để cho giọt mủ thấm giọt mủ lên que tăm vô trùng, phần lại quệt lam kính. Que tăm cho vào môi trường chuyên chở Stuart-Amies (thích hợp dùng cặp tube đũa tăm vô trùng/tube đũa Stuart Amies). Gửi đến phòng thí nghiệm để khảo sát sớm tốt. 97 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác √ Nếu bệnh nhân không vút mủ, dùng que gòn mãnh luồn vào ống đái sâu khoảng 3-4 cm vừa xoay nhẹ vừa rút cho vào môi trường chuyên chở Stuart-Amies (dùng cặp tube đũa tăm mãnh vô trùng/tube đũa Stuart Amies). √ Nếu cần cấy phân lập N. gonorrhoeae tốt cấy thạch phân lập CATM sau lấy bệnh phẩm, cách lấy dùng vòng cấy nhựa hay vòng cấy kim loại que gòn mãnh (dùng tube đũa tăm mãnh vô trùng) luồn vào ống đái sâu khoảng 3-4 cm vừa xoay nhẹ vừa rút ra. Ngay sau vạch hộp thạch CATM gửi đến phòng thí nghiệm để ủ theo dõi. √ Các loại bệnh phẩm khác lấy để khảo sát quệt hậu môn, quệt họng, quệt mủ lấy nội soi trực tràng người đồng tính luyến ái. 2. Ở đàn bà √ Bệnh nhân nằm bàn khám phụ khoa, rửa phận sinh dục nước, thấm khô, sau cho cho mỏ vòt vào. Mỏ vòt vô trùng hấp ướt hay sấy khô hóa chất. √ Dùng tăm quệt lấy huyết trắng thành sau âm đạo để khảo sát T. vaginalis nấm (dùng tăm vô trùng lấy mẫu, hay tăm dài vô trùng lấy mẫu). Tăm nầy cho vào lọ có dung dòch bảo quản F2M (lọ có F2M để lấy mẫu) gửi đến phòng thí nghiệm để soi tươi. Nếu muốn cấy vi sinh hay nấm lấy quệt huyết trắng que tăm cho vào môi trường chuyên chở Stuart-Amies (dùng cặp tube đũa tăm mãnh vô trùng/tube đũa Stuart Amies). √ Đối với người bò nghi nhiễm lậu, lấy bệnh phẩm từ lòng cổ tử cung cách dùng gòn vô trùng lau huyết trắng dùng tăm mãnh đưa vào lòng cổ tử cung xoay nhẹ 10 giây trước rút ra. Lấy mẫu que tăm bông, que quệt lên lam kính, que lại cho vào môi trường chuyên chở Stuart-Amies gửi đến phòng thí nghiệm để khảo sát (dùng cặp tube đũa tăm mãnh vô trùng/tube đũa Stuart Amies). 3. Ở trẻ √ Có thể lấy mủ mắt nghi bò viêm mủ kết mạc mắt lậu. √ Cũng lấy mủ từ âm đạo bé gái (trường hợp bò hiếp dâm) 98 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác 4. Các trường hợp đặc biệt √ Tìm Chlamydia trachomatis kỹ thuật nhuộm kháng thể huỳnh quang trực tiếp: lấy bệnh phẩm từ lòng cổ tử cung trường hợp tìm vi khuẩn lậu. Quệt tăm nầy lên lame lổ chuyên dùng, để khô tự nhiên nhỏ lên giọt acetone hay methanol, chờ khô. Bọc lame tờ giấy nhôm gửi đến phòng thí nghiệm. Trường hợp chưa gửi đến phòng thí nghiệm được, bảo quản lame tủ lạnh 4oC tối đa không tuần. √ Các vết loét: lau gòn vô trùng nặn chất dòch vào tăm vô trùng, phần lại quệt lam kính. Que tăm cho vào tube nắp chặt vô trùng hay vào môi trường chuyên chở Stuart-Amies (dùng cặp tube đũa tăm vô trùng/tube đũa Stuart Amies), gửi đến phòng thí nghiệm để khảo sát sớm tốt. Khảo sát trực tiếp 1. Bệnh phẩm lấy đàn ông hay trẻ √ Làm phết nhuộm Gram, khảo sát kính hiển vi độ phóng đại lớn (vật kính dầu): Nếu có 4-10 bạch cầu quang trường song cầu Gram [-] nội tế bào nhiều khả bệnh nhân bò viêm niệu đạo lậu. Nếu có 10 bạch cầu quang trường và/hay phát có song cầu Gram [-] nội tế bào, 98% bệnh nhân bò lậu. √ Không làm phết nhuộm Gram quệt họng hay quệt hậu môn. Tuy nhiên quệt mủ lấy từ nội soi trực tràng có giá trò để khảo sát Gram. 2. Bệnh phẩm lấy đàn bà √ Soi tươi cần thiết để phát Trichomonas vaginalis nấm men. √ Làm phết nhuộm Gram quệt bệnh phẩm lame kính quan sát kính hiển vi, vật kính dầu. Với quệt âm đạo: (1) Nếu có bạch cầu quang trường có trực khuẩn Gram [+] (thường Lactobacillus), quệt âm đạo bình thường. (2) Nếu có bạch cầu quang trường, trực khuẩn Gram [+] (Lactobacillus), có nhiều trực khuẩn Gram [-] nhỏ quanh tế bào kèm vi khuẩn khác cầu trực khuẩn Gram [-], trực khuẩn Gram 99 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác [-], trực khuẩn Gram [-] cong, có nhiều khả bệnh nhân bò viêm âm đạo Gardnerella vaginalis. (3) Nếu có 10 bạch cầu quang trường, có khả bệnh nhân bò nhiễm C. trachomatis. Với quệt cổ tử cung: Cố phát song cầu Gram [-] nội tế bào. Tuy nhiên kết Gram bệnh nhân bò lậu độ đặc hiệu đạt 50-90%, độ nhạy 50-70%. 3. Trường hợp bệnh phẩm nước tiểu Lấy mẫu nước tiểu phương pháp vô trùng đề cập phần cấy nước tiểu lấy dòng mà tốt lấy đầu dòng hay cuối dòng. Nước tiểu gửi đến phòng thí nghiệm phải tiến hành xét nghiệm cách ly tâm tốc độ cao máy ly tâm bàn, sau lấy cặn để vừa làm phết nhuộm Gram, vừa cấy môi trường phân lập. Nếu quan sát nhuộm Gram có song cầu Gram [-] đặc trưng nội tế bào, trả lời kết sơ cho bác só nghi ngờ lậu cầu. 4. Trường hợp loét hạ cam Soi tươi kính hiển vi đen hay đảo phase tìm xoắn khuẩn giang mai. 5. Trường hợp tìm C. trachomatis Nhuộm kháng thể huỳnh quang đọc kính hiển vi huỳnh quang. Nuôi cấy, phân lập Trên thạch nâu Thayer Martin (CATM) để cấy phân lập vi khuẩn N. gonorrhoeae (vi khuẩn lậu), thêm thạch BANg (có thể thay BA BANg) MC cho vi khuẩn dễ mọc khác. Có thể cấy thêm thạch nâu nghi nhiễm trùng vi khuẩn khó mọc khác. Có thể cấy thêm thạch Sabouraud có hay kháng sinh có yêu cầu tìm nấm men. Các hộp BA CA phải ủ 35-37oC bình nến. Các trường hợp khác, ủ khí trường bình thường. Theo dõi liên tục ngày. Trường hợp cấy vi khuẩn N. gonorrhoeae, mở bình sau 48 ủ. Nếu có vi khuẩn mọc, tiến hành đònh danh làm kháng sinh đồ. 100 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Các vi khuẩn gây bệnh tìm thấy đường sinh dục 1. Thường gặp √ N. gonorrhoeae, √ Treponema pallidum (soi tươi). 2. Ít gặp √ H. ducreyi, √ Gardnerella vaginalis (nhộm Gram), √ Candida albicans (nhuộm Gram), √ Trichomonas vaginalis (soi tươi). 3. Rất gặp √ Chlamydia trachomatis. Câu hỏi ôn tập 1. Cho biết cách lấy bệnh phẩm từ đường sinh dục đối tượng khác nhau. 2. Hãy cho biết phương pháp khảo sát trực tiếp cách đánh giá kết khảo sát trực tiếp bệnh phẩm lấy từ đường sinh dục. 3. Hãy mô tả qui trình nuôi cấy phân lập vi khuẩn gây bệnh từ bệnh phẩm lấy từ đường sinh dục, từ cho biết phương tiện cần thiết để thực qui trình này. 4. Hãy cho biết vi khuẩn gây bệnh tìm thấy từ đường sinh dục. 101 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác CẤY MẪU LẤY TỪ ĐƯỜNG SINH DỤC Các câu hỏi thường gặp Một người đàn ông thường hay cảm thấy ngứa rát đường tiểu lại không bò mủ niệu đạo mà hay chất nhầy trắng vào sàng sớm; họ có bò lậu không, làm tìm tác nhân gây bệnh trường hợp này? Triệu chứng lậu bệnh nhân điều trò không triệt để trước bạn tình (hoặc vợ) họ không điều trò triệt để. Tuy nhiên họ nhiễm tác nhân gây bệnh khác lậu Trichomonas vaginalis, Enterococcus faecalis, hay Streptococci nhóm B. Do vậy, trước hết phải hỏi kỹ bệnh sử bệnh nhân xem trước có triệu chứng lậu không, có điều trò không? điều trò nào? có điều trò cho bạn tình không? . Trong trường hợp cách lấy bệnh phẩm tốt dùng tăm mãnh hay vòng cấy nhựa nhỏ luồn vào niệu đạo qua đầu dương vật để ngoáy nhẹ lấy chất nhầy lấy lên hộp thạch CATM hộp thạch CA. Các hộp thạch phải chuyển đến phòng thí nghiệm để ủ tủ ấm bình nến hay tủ ấm CO2. Ngoài phải lấy thêm bệnh phẩm với cách để soi tươi làm phết nhuộm Gram để khảo sát trực tiếp nữa. Một số phòng thí nghiệm hay làm xét nghiệm khảo sát trực tiếp cặn lắng nước tiểu để tìm vi khuẩn lậu. Xét nghiệm có tin cậy không? Nếu muốn tìm vi khuẩn lậu nước tiểu thiết phải khảo sát cặn lắng nước tiểu với nước tiểu lấy đầu dòng hay cuối dòng vào sáng sớm. Tuy nhiên dựa vào phết nhuộm Gram thi khó kết luận xác lậu dù thấy hình ảnh điển hình song cầu Gram [-] nội tế bào, mà phải nuôi cấy cặn lắng môi trường CATM. Tuy nhiên vi khuẩn lậu nước tiểu khó nuôi cấy thành công, kỹ thuật xác nhạy cảm người ta tiến hành thử nghiệm PCR phát N. gonorrhoeae đồng thời với C. trachomatis cặn lắng nước tiểu. Hiện có thử nghiệm xét nghiệm nhanh tìm N. gonorrhoeae C. trachomatis. Thử nghiệm hoạt động nguyên tắc nào, có đáng tin cậy không? 102 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Các thử nghiệm đa số dựa nguyên tắc thử nghiệm sắc ký miễn dòch (xem trang 45) phát kháng nguyên vi sinh vật có bệnh phẩm. Vì thử nghiệm phát kháng nguyên nên giá trò thử nghiệm phát kháng thể. Tuy nhiên độ nhạy cảm độ đặc hiệu cao hay không lại thay đổi tuỳ theo hãng sản xuất. Do trước áp dụng phải nghiên cứu so sánh với phương pháp nuôi cấy (đối với vi khuẩn N. gonorrhoeae), hay phương pháp miễn dòch huỳnh quang trực tiếp (đối với C. trachomatis), hay có điều kiện so với phương pháp PCR. Tuy nhiên hãng sản xuất mà sản phẩm FDA đánh giá chấp nhận lưu hành sử dụng mà không cần phải nghiên cứu. Kết nhuộm Gram phết âm đạo hay cổ tử cung thấy có song cầu Gram [-], nội tế bào. Có thể nghi ngờ bệnh nhân nhiễm N. gonorrhoeae không? Nếu quệt mủ niệu đạo đàn ông kết khẳng đònh chẩn đoán bệnh nhân bò lậu. Nhưng trường hợp bệnh phẩm quệt âm đạo hay cổ tử cung đàn bà nghi ngờ chắn, cần phải nuôi cấy Để nuôi cấy, cần phải cấy quệt lên hộp thạch Thayer Martin (CATM) có kháng sinh ức chế vi khuẩn nấm ủ bình nến hay tủ ủ CO2 5%. Sau phân lập, khúm nghi ngờ phải đònh danh xác đònh N. gonorrhoeae phương pháp lên men đường nhanh (3 loại đường: Glucose, Lactose, Maltose, Sucrose). Vi khuẩn N. gonorrhoeae lên men đường Glucose, không lên men đường khác. Xin cho biết giá trò thử nghiệm miễn dòch huỳnh quang phát C. trachomatis bệnh phẩm mẫu quệt cổ tử cung. Đây thử nghiệm phát trực tiếp vi khuẩn C. trachomatis kỹ thuật miễn dòch huỳnh quang trực tiếp dùng kháng thể đặc hiệu C. trachomatis gắn huỳnh quang. Nếu làm theo dẫn nhà sản xuất thử nghiệm đáng tin cậy. Một khó khăn thực thử nghiệm nên dùng dụng cụ lấy mẫu thích hợp bàn chải quệt lấy cổ tử cung mà phải đặt mua Việt Nam giá thành đắt. 103 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác A B Hình 29: Phết nhuộm Gram mẫu mủ niệu đạo người đàn ông nghi bò lậu. Quan sát quang khuẩn x1000. Có nhiều tế bào bạch cầu đa nhân có song cầu Gram [-] nội tế bào. Với kết chẩn đoán gần 100% bệnh nhân bò lậu. Tuy nhiên cần phải tiến hành nuôi cấy để làm kháng sinh đồ. C Hình 30: Phết nhuộm Gram mẫu cặn lắng nước tiểu người đàn ông nghi bi lậu cho thấy có số tế bào bạch cầu đa nhân có song cầu Gram [-] nội tế bào. Kết giúp chẩn đoán bệnh nhân bò lậu, nhiên cần xác đònh nuôi cấy. Hình 31: Hình ảnh vi thể phết tế bào âm đạo bệnh nhân nhiễm Gardnerella vaginalis. (A) phết soi tươi thấy trực khuẩn cong bám đầy lên tế bào chất tế bào biểu mô âm đạo. (B) phết nhuộm Gram cho thấy trực khuẩn G. vaginalis bám đầy lên tế bào biểu mô âm đạo. (C) Cũng phết nhuộm Gram quệt âm đạo, G. vaginalis (g), thấy vi khuẩn khác Bacteroides (b)-Mobilincus (c)Peptostreptococci (p). 104 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Sơ đồ 10: QUI TRÌNH VI SINH LÂM SÀNG CÁC MẪU LẤY TỪ ĐƯỜNG SINH DỤC D0 KSTT: GRAM Cấy phân lập • CATM • BANg* MC/EMB * Nếu BANg, thay BA KQ sơ bộ: KSTT o Ủ 37 C/CO2 (CATM/BA) Trên CATM có khúm nghi N. gonorrhoeae D1 + Đònh danh (RNIS) KSĐ (CAIS) Theo qui trình N. gonorrhoeae Chọn khúm VK khác BANg MC/EMB Cấy tăng sinh lên BA/NA - OXIDASE Ủ 37oC/từ sáng đến chiều Đònh danh KSĐ Theo qui trình VK N. gonorrhoeae Đònh danh KSĐ Theo qui trình VK N. gonorrhoeae KQ chung RNIS D2 KQ chung cuộc: KSĐ KQ chung 105 . thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau 97 MẪU SINH DỤC Mục tiêu • Thực hiện lấy đúng bệnh phẩm đường sinh dục vì biết được cách lấy các loại bệnh phẩm đường sinh dục. thích hợp nhất để thực hiện được xét nghiệm vi sinh lâm sàng các mẫu lấy từ đường sinh dục. Chỉ đònh Khi nghi ngờ nhiễm trùng bệnh lây truyền bằng đường sinh dục (đàn ông, đàn bà) hay khi bò. đường sinh dục, và từ đó cho biết các phương tiện cần thiết để thực hiện được qui trình này. 4. Hãy cho biết các vi khuẩn gây bệnh có thể tìm thấy từ đường sinh dục. Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh