TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH THỰC PHẨM ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN

TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH THỰC PHẨM ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN

1 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM KHOA KĨ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH THỰC PHẨM ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN GVHD: Ts. PHAN NGỌC HÒA TP. HỒ CHÍ MINH, ngày 11/12/2011 2 MỤC LỤC 1. KHUYẾN NGHỊ CĂN BẢN CHO QUÁ TRÌNH PHÂN TÍCH 5 2. ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL 6 2.1. Tổng quan 6 2.1.1. Lĩnh vực áp dụng 6 2.1.2. Ưu điểm và hạn chế 6 2.2. Nguyên tắc chung 6 2.3. Định lượng nitơ tổng 8 2.3.1. Vô cơ hóa mẫu (trong tủ Hotte) 8 2.3.2. Cất đạm (trong máy cất đạm) 8 2.3.3. Chuẩn độ 8 2.4. Định lượng nitơ phi protein 9 3. PHƯƠNG PHÁP BIURET 9 3.1. Nguyên tắc chung 9 3.2. Ưu điểm và hạn chế 10 3.3. Định lượng protein bằng phương pháp so màu, có mặt thiol 10 3.4. Định lượng protein bằng phương pháp so màu với sự can thiệp của TCA 10 3.5. Định lượng protein bằng phương pháp so màu đối với mẫu giàu lipid 10 3.6. Định lượng protein bằng phương pháp so màu, có mặt đường khử 10 3.7. Định lượng protein bằng phương pháp so màu, có mặt DNA 10 4. PHƯƠNG PHÁP LOWRY 11 4.1. Nguyên tắc chung 11 3 4.2. Ưu điểm và hạn chế 11 5. PHƯƠNG PHÁP LIÊN KẾT THUỐC NHUỘM (DYE-BINDING) 12 5.1. Nguyên tắc chung 12 5.2. Phương pháp Bradford 12 5.2.1. Nguyên tắc 12 5.3. Phương pháp Udy 13 5.3.1. Nguyên tắc 13 5.4. Ưu điểm và hạn chế của phương pháp liên kết thuốc nhuộm 13 6. PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ TNBS (TNBS- SPECTROPHOTOMETRIC) 13 6.1. Nguyên tắc 13 6.2. Ưu điểm và hạn chế 13 7. PHƯƠNG PHÁP HẤP THU TIA CỰC TÍM (ULTRAVIOLET ABSORPTION) 14 7.1. Nguyên tắc chung 14 7.2. Ưu điểm và hạn chế 14 7.3. Lĩnh vực áp dụng 14 8. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ (CHROMATOGRAPHY) 15 8.1. Sắc ký lọc gel (Gel Filtration Column Chromatography) 15 8.1.1. Nguyên tắc 15 8.1.2. Các bước tiến hành tổng quát 16 8.1.3. Ưu điểm và hạn chế 16 8.2. Sắc ký trao đổi ion (Ion-Exchange Chromatography) 17 8.2.1. Nguyên tắc 17 4 8.3. Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High-Performance Liquid Chromatography – HPLC) 18 8.3.1. Nguyên lí 18 8.3.2. Ưu điểm và hạn chế 19 8.4. Phương pháp sắc ký ái lực – hấp phụ (Affinity Chromatography) . 19 8.4.1. Nguyên tắc 19 9. PHƯƠNG PHÁP DUMAS 20 9.1. Nguyên tắc 20 9.2. Ưu điểm và hạn chế 20 Tài liệu tham khảo 20 5 Danh mục hình Hình 1.phức hợp protein-đồng 9 Hình 2. đo cường độ màu sắc ở 540 nm 9 Hình 3. đo cường độ màu ở 750 nm 11 Hình 4. phản ứng nhuộm màu với Coomassie Brilliant Blue G-250 13 Hình 5. cột sắc ký lọc gel 15 Hình 6. sắc ký trao đổi ion 17 Hình 7. tương tác của protein với pha tĩnh và pha động 18 Hình 8. veggies cap 20 Hình 9. quy trình của Phương Pháp Dumas 20 1. KHUYẾN NGHỊ CĂN BẢN CHO QUÁ TRÌNH PHÂN TÍCH Để hạn chế những biến đổi có thể xảy ra đối với protein, mẫu nên được thu nhận nhanh nhất có thể và đặt ngay vào môi trường cách ly ở nhiệt độ thấp (từ 0 đến 4 o C). Điều này là tối quan trọng, đặc biệt khi protein được cách li để tiến hành các phân tích sâu hơn (ví dụ như điện di), môi trường cách ly bao gồm những chất ngăn ngừa sự tạp nhiễm của vi khuẩn (VD: 0,1 mM sodium azide), bảo vệ protein khỏi những chất tạo phức (VD: Cu, …) như (VD: Ethylenediaminetetraacetic acid 2 mM), ngăn chặn các thoái hóa protein do các protease nội sinh (VD: phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) 0,1 mM). Protein cần được phân riêng và tinh chế, nhằm múc đích tách riêng biệt protein, ở dạng đồng nhất hoặc một nhóm protein phù hợp cho quá trình phân tích sâu hơn, từ nguyên liệu ban đầu. Có nhiều biện pháp phân riêng và tinh chế protein, cụ thể như: o Chiết (Etraction) o Deproteination o Lọc (Filtration) o Ly tâm (Centrifugation) o Kết tủa bằng muối (Salting-Out) o Thẩm tách và thẩm tách điện (Dialysis & Electrodialysis) o Lọc bằng phương pháp sắc ký 6 2. ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL 2.1. Tổng quan 2.1.1. Lĩnh vực áp dụng Phương pháp Kjeldahl là một kỹ thuật quan trọng trong phân tích thực phẩm, nó được sử dụng như một tham chiếu để so sánh với các phương pháp khác. 2.1.2. Ưu điểm và hạn chế 2.1.2.1. Ưu điểm - Sai số không vượt quá 1% - Khả năng lặp lại kết qu ả tốt. - Dễ thao tác. - Phân tích được tất cả các loại protein thực phẩm. 2.1.2.2. Hạn chế - Yêu cầu lượng mẫu lớn. - Thời gian phân tích dài. - Độ phân giải thấp do tính chọn lọc không cao. 2.2. Nguyên tắc chung Sự khác biệt chủ yếu giữ các phương pháp Kjeldahl là chất xúc tác được sử dụng trong quá trình vô cơ hóa mẫu, kỹ thuật cất đạm và chu ẩn độ. Tuy có sự khác nhau nhưng chung nhất phương pháp Kjeldahl bao gồm năm bước: a) Chuẩn bị mẫu và cân mẫu b) Bổ sung chất phản ứng c) Vô cơ hóa mẫu d) Cất đạm e) Chuẩn độ Khối lượng mẫu được lấy có thể biến động từ 0,2 đến 2,0g, phụ thuộc vào lượng protein trong mẫu đem kiểm nghiệm. Đối vớ i mẫu lượng protein nằm trong khoảng 5 – 25%, lượng mẫu tối ưu cần lấy là 0,5 – 1,0g. Trong quá trình tiến hành cần thêm vào mẫu 3 nhóm chất với các chức năng khác nhau trong quá trình vô cơ hóa mẫu: a) Sulfuric acid: tác nhân oxy hóa các hợp chất hữu cơ thành CO 2, H 2 O, bẻ gãy và chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ thành khí NH 3 tự do, sau đó liên kết với NH 3 tạo thành muối (NH 4 ) 2 SO 4 . 7 b) Muối (K 2 SO 4 , Na 2 SO 4 ): cần thiết cho quá trình nâng cao nhiệt độ trong quá trình vô cơ hóa. c) Các chất xúc tác đẩy nhanh quá trình oxy hóa: bao gồm các kim loại: Hg, Cu, Se; oxide: CuO, HgO, P 2 O 5 , TiO 2 ; peroxide: Hg 2 O 2 ; muối: CuSO 4 , Hg 2 SO 4 . Thủy ngân và oxide thủy ngân là chất xúc tác oxy hóa hiệu quả nhất tuy nhiên, có thể gây ô nhiễm môi trường, nguy hiểm cho người và đặc biệt có thể tạo phức hợp với NH 3 , gây khó khăn cho quá trình cất đạm sau này. Để phân tách các phức hợp amoniac – thủy ngân, cũng như nitrate và nitrite, dung dịch natri thiosulfate và salicylic được thêm vào. Tuy khả năng xúc tác kém hơn, và quá trình vô cơ hóa mẫu chậm hơn so với thủy ngân nhưng đồng thân thiện với môi trường nên chúng được sử dụng nhiều hơn (đã được phê duyệt bởi ISO và AOAC). Hiệu quả nhất và thân thiện với môi trường là xúc tác CuSO 4 . Qua trình vô cơ hóa mẫu được sử dụng để chuyển hóa nitơ trong hợp chất hữu cơ thành ion amoni. Sự có mặt của sulfuric acid làm hạn chế nhiệt độ vô cơ hóa (nhiệt độ sôi của sulfuric acid là 338 o C, do đó muối K 2 SO 4 hoặc Na 2 SO 4 được thêm vào nhằm tăng điểm sôi của hỗn hợp, giảm thời gian phân hủy các hợp chất hữu cơ, tạo điều kiện phân hủy những hợp chất khó vô cơ hóa. Nhiệt độ sôi của hỗn hợp tăng gần như tuyến tính với tỷ lệ K 2 SO 4 /H 2 SO 4 (g/mL), đạt 383 o C vơi tỷ lệ 1:1, ở tỷ lệ 2:1 nhiệt độ đạt 450 o C. K 2 SO 4 không chỉ được thêm vào để tăng nhiệt độ sôi hỗn hợp mà còn hấp thu bớt lượng H 2 SO 4 để tạo thành KHSO 4 . Trong thực phẩm còn bào gồm các hợp chất kháng vô cơ hóa như nitrate, nitrite, alkaloid, pyridine, chinoline derivative, triazole, pyrazolone, aminopyrine và antipyrine. Để quá trình vô cơ hóa dễ dàng hơn, ta cần bổ sung các chất như crom, kẽm, sắt (IV) sulfate, salicylic acid và đường sucrose. Những mẫu có chất béo với protein sẽ khó vô cơ hóa và dễ tạo bọt hơn so với các mẫu giàu protein, carbohydrate. Để ngăn chặn sự tạo bọt boiling rod hoăc chip được sử dụng, thêm một vài giọt hydrogen peroxide hoặc octanol, hoặc dùng chất tạo nh ũ đặc biệt chống tạo bọt. Trong điều kiện bình thường, chất chống tạo bọt có thể được bỏ qua khi áp dụng làm nóng hai giai đoạn. Ở giai đoạn đầu, mẫu được đốt thành tro, phải tiến hành cẩn thận nâng nhiệt mẫu lên đến 200 o C. Giai đoạn hai, nâng nhiệt mẫu đến 420 o C, bao gồm cả thời gian 8 cần thiết để mẫu được vô cơ hoàn toàn. Sau khi khoáng hóa hoàn thành, phải làm lạnh nhiệt độ mẫu đến nhiệt độ phòng. Theo nguyên tắc, protein được định lượng bằng cách xác định lượng nitơ tổng và nitơ phi protein, từ đó tính được nitơ của protein. Định lượng được nitơ protein ta nhân kết quả này với một hệ số nhất định (VD: 6,25 vì hàm lượng Nitơ trong protein là 16% , hàm lượng khá cao và ổn định). Nitơ protein = Nitơ tổng – Nitơ phi protein Hệ số cho các nhóm thực phẩm nhất định. Cụ thể như: 2.3. Định lượng nitơ tổng  Nguyên tắc tiến hành: 2.3.1. Vô cơ hóa mẫu (trong tủ Hotte)  Ở nhiệt độ cao, dưới tác dụng của H 2 SO 4 các hợp chất chứa nitơ bị phân hủy và bị oxy hóa thành CO 2, H 2 O, và NH 3 . NH 3 kết hợp H 2 SO 4 tạo thành (NH 4 ) 2 SO 4 . 2.3.2. Cất đạm (trong máy cất đạm)  Đuổi NH 3 ra khỏi muối bằng dung dịch NaOH  (NH 4 ) 2 SO 4 + NaOH  Na 2 SO 4 + NH 3 + H 2 O  Lượng NH 3 được lôi cuốn bằng máy Parmas, sau đó được dẫn đến erlen có chứa sẵn lượng thừa H 2 SO 4 đã xác định chính xác nồng độ. NH 3 sẽ kết hợp H 2 SO 4 tạo thành (NH 4 ) 2 SO 4 .  NH 3 + H 2 SO 4 dư  (NH 4 ) 2 SO 4 + H 2 SO 4 dư 2.3.3. Chuẩn độ  Chuẩn độ lượng acid dư bằng dung dịch NaOH qua đó tính được lượng Nitơ có trong mẫu.  NaOH + H 2 SO 4  Na 2 SO 4 + H 2 O  Tính toán kết quả. 9 2.4. Định lượng nitơ phi protein  Nguyên tắc tiến hành  Dùng dung môi chiết rút tất cả các dạng nitơ phi protein.  Do trong dịch chiết vẫn còn lẫn vài loại protein, vì vậy ta cần dùng chất kết tủa protein hòa tan trong quá trình chiết rút.  Kết tủa Protein có thể tiến hành theo nhiều cách nhưng phổ biến nhất ta dùng TCA 10%, Pb(CH 3 COO) 2 10 – 15%, CuSO 4 10% trong hỗn hợp với NaOH 10% với tỉ lệ 1:1.  Lọc kết tủa protein.  Vô cơ hóa dung dịch phi protein.  Cất đạm.  Chuẩn độ.  Tính toán kết quả. 3. PHƯƠNG PHÁP BIURET 3.1. Nguyên tắc chung  Phương pháp Biuret dựa trên sự hình thành phức màu xanh tím có độ hấp thu cực đại ở bước sống 540nm của đồng và liên kết amide trong dung dịch kiềm mạnh. Cường độ màu tỷ lệ thuận với số liên kết peptide trong chuỗi. Hình 1.phức hợp protein-đồng Hình 2. đo cường độ màu sắc ở 540 nm 10 3.2. Ưu điểm và hạn chế Ưu điểm: đơn giản, nhanh chóng Hạn chế: o Độ nhạy kém o Dễ bị nhiễu khi mẫu protein chứa các thiol, DNA, saccharide hoặc chất béo.  Phản ứng Biuret trải qua một số CẢI BIẾN sau. 3.3. Định lượng protein bằng phương pháp so màu, có mặt thiol Các thiol (β-mercaptoethanol, β-mercaptoethylamine, glutathione) có thể được ngăn chặn trong hầu hết các trường hợp bằng cách thêm vào các chất phản ứng Biuret là các chalate với EDTA. Tuy nhiên nếu mẫu có dithiothreitol (DTT), ta cầ n thêm vào iodoacetamide trước khi thêm các chất phản ứng 3.4. Định lượng protein bằng phương pháp so màu với sự can thiệp của TCA Phương pháp này dựa trên việc kết tủa protein bằng cách thêm vào trichloacetic (nồng độ 5 – 25%) tùy thuộc vào thành phần protein, phân tách kết tủa ra khỏi dịch mẫu bằng phương pháp lọc, giải kết tủa bằng dung dịch muối hoặc KOH, xác định protein với phản ứng Biuret. 3.5. Định lượng protein bằng phương pháp so màu đối v ới mẫu giàu lipid Mẫu với tỷ lệ lipid/protein hoặc phospholipid/protein cao có độ đục cao sẽ khó tiến hành xác định so màu. Vì vậy trước khi tiến hành phản ứng so màu cần phải tách lipid ra khỏi mẫu bằng hỗn hợp trích ly (VD: acetone:petroleum ether 1:1). Mẫu không chứa lipid sẽ được hòa tan vào muối natri deoxycholate 10% hoặc NaOH. Sau đó xử lí mẫu với các chất phản ứng Biuret. 3.6. Định lượng protein bằng phương pháp so màu, có mặt đường khử Đường khử có khả n ăng làm gây trở ngại phản ứng Biuret. Do đó, H 2 O 2 được thêm vào để oxy hóa đường khử. Ngoài ra, tăng thêm 10 lần nồng độ của chất phản ứng Biuret. 3.7. Định lượng protein bằng phương pháp so màu, có mặt DNA Độ hấp thu tia cực tím của phức hợp Protein – đồng trong dung dịch đồng sulfate nhạy gấp 10 – 15 lần so với phản ứng Biuret tiêu chuẩn. Có thể định lượng được xác định được protein trong dung dịch rất loãng (0,01 – 0,1 mg/mL). Ellman (1962), đề xuất phương án đo độ hấ p thu của phức hợp protein – đồng ở 263nm, sử dụng đồng sulfate 0,04% và dung dịch NaOH 2N. sự lựa chọn bước [...]... nghị áp dụng để phân tích một loạt các mẫu có hàm lượng protein tương đối thấp hoặc nồng độ muối amoni cao khiến các phương pháp khác trở nên không hiệu quả Thông qua định lượng protein, phương pháp được dùng để kiểm tra mức độ thủy phân protein 14 8 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ (CHROMATOGRAPHY) Phương pháp sắc ký thường dùng để tinh sạch protein, sau đó protein được tinh sạch được phân tích định lượng thông qua... với Biuret và gấp 10 lần so với đo quang phổ) 11 Hạn chế: dễ bị nhiễu và không thể xác định các protein trong phân tử không chứa vòng thơm 5 PHƯƠNG PHÁP LIÊN KẾT THUỐC NHUỘM (DYE-BINDING) Kỹ thuật này được khuyến nghị chủ yếu dùng cho phân tích protein sữa và để phân tích định kỳ các sản phẩm thực phẩm có hàm lượng protein rất thấp như: bia, rượu vang, nước ép rau quả, … 5.1 Nguyên tắc chung Cơ sở của... Orange G, and Acid Orange 12 được sử dụng phổ biến trong phân tích thực phẩm Trong đó hai phương pháp được sử dụng phổ biến nhất để phân tích hàm lượng protein trong thực phẩm là Bradford và Udy 5.2 Phương pháp Bradford 5.2.1 Nguyên tắc Được phát triển bởi Bradford (1976), thuốc nhuộm được sử dụng là Coomassie Brilliant Blue G-250 tạo phức với protein trong môi trường kiềm yếu Có thể tạo kết tủa ở nhiệt... acid amin, protein có chứa vòng thơm trong cột sẽ kéo dài, mà không bị phân tách theo thứ tự trọng lượng phân tử 16 8.2 Sắc ký trao đổi ion (Ion-Exchange Chromatography) Hình 6 sắc ký trao đổi ion 8.2.1 Nguyên tắc Tại bất kỳ một điểm pH nào trừ điểm đẳng điện, các protein đều có mang một điện tích tương ứng với điểm pH đó Dựa vào điện tích thực của chúng tại một điểm pH nhất định, ta có thể phân tách... pha tĩnh phân cực hơn pha động b) sắc ký pha đảo: pha tĩnh kém phân cực hơn pha động đối với thực phẩm, hầu hết các phân tích được thực hiện theo sắc ký pha đảo (reversed-phase chromatography – RFC) Sự tách và thu protein trong RFC thường được thực hiện bằng cách rửa giải với sự tăng nồng độ của các hợp chất hữu cơ như acetonitril, methanol, tetrahydrofuran, isopropanol Pha động thường chứa một lượng. .. tinh sạch của sản phẩm protein sẽ tăng lên khi các phân đoạn protein được chạy qua nhiều cột sắc ký khác nhau Thông thường một cột sắc ký đơn lẻ không đủ để tinh sạch được một loại phân tử protein mong muốn nào đó dù quá trình sắc ký được lặp đi lặp lại nhiều lần, thay vào đó người ta thường phải áp dụng một chuỗi các bước kỹ thuật để có thể thu được một phân đoạn chứa một lượng lớn loại protein cần quan... tỷ lệ với hàm lượng protein trong thực phẩm Thuốc nhuộm hữu cơ liên kết với protein bằng các liên kết ion, tĩnh điện, hoặc cả van der Waals Phản ứng này tối ưu trong môi trường acid mạnh, tạo ra các phức tan hoặc không tan Vì vậy nồng độ protein có thể dễ dàng xác định thông qua đo cường độ màu của dung dịch thuốc nhuộm trước và sau khi thêm protein, hoặc sau khi tách riêng phức hợp protein- thuốc nhuộm... mang điện tích dương Ngược lại, nếu hạt mang điện tích dương (như cột diethylaminoethyl-cellulose (DEAE-cellulose)), gọi là sắc ký trao đổi ion âm, thì tương tác với phân tử mang điện tích âm Vì thế, những protein cùng dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu bị giữ lại cột Để phóng thích những protein này, ta tăng nồng độ ion của pha động, những ion này sẽ thế phân tử protein. .. thành công để phân tách trực tiếp protein khỏi các thành phần khác trong dịch chiết thực phẩm Nó được sử dụng như một kỹ thuật giúp tiện lợi hơn cho việc phân đoạn sơ bộ các peptide trước khi chúng được phân tích sâu hơn bằng cách lập bản đồ TLC (sắc ký bản mỏng) peptide, sắc ký cột trao đổi ion, điện di mao quản và các phương pháp khác 8.1.1 Nguyên tắc Kỹ thuật này cho phép phân tách các loại protein trên... hỗn hợp protein Phương pháp này gọi là phương pháp sắc ký trao đổi ion Trong phương pháp này, pha tĩnh là những hạt mang sẵn một điện tích nhất định, những hạt này sẽ tương tác với các phân tử (protein) mang điện tích trái 17 dấu với chúng Cụ thể, nếu hạt mang điện âm (như cột carboxymethyl-cellulose (CM-cellulose)), tiến trình được gọi là sắc ký trao đổi ion dương, thì sẽ tương tác với những phân tử . ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM KHOA KĨ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH THỰC PHẨM ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN GVHD: Ts. PHAN NGỌC HÒA TP. HỒ. tắc, protein được định lượng bằng cách xác định lượng nitơ tổng và nitơ phi protein, từ đó tính được nitơ của protein. Định lượng được nitơ protein ta nhân kết quả này với một hệ số nhất định. vì hàm lượng Nitơ trong protein là 16% , hàm lượng khá cao và ổn định) . Nitơ protein = Nitơ tổng – Nitơ phi protein Hệ số cho các nhóm thực phẩm nhất định. Cụ thể như: 2.3. Định lượng