Tieu Luan Phan tich thuc pham AFLATOXIN, E.COLI TRONG THỰC PHẨM VÀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

Tiểu luận Phân tích thực phẩm đề tài: AFLATOXIN, E.COLI TRONG THỰC PHẨM VÀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH giúp sinh viên có hiểu biết tổng quan về Aflatoxin và E.Coli trong thực phẩm, tác hại đến sức khỏe và các phân tích chúng.

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC ◊…….◊ TIỂU LUẬN MÔN HỌC PHÂN TÍCH THỰC PHẨM AFLATOXIN, E.COLI TRONG THỰC PHẨM VÀ PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH GVHD: Ths Hoàng Thị Kim Khuyên Lớp: ĐHPT5 SVTH: Nguyễn Hữu Tiến Huỳnh Thị Bích Vân 09078011 09082441 NỘI DUNG Tổng quan Aflatoxin phƣơng pháp phân tích Tổng quan E.Colivà phƣơng pháp phân tích Tổng quan Aflatoxin phƣơng pháp phân tích 1 Tổng quan Aflatoxin 1.2 Các phƣơng pháp xác định Aflatoxin 1.3 Phƣơng pháp sắc ký mỏng 1.4 phƣơng pháp Elisa 1.1 Tổng quan Aflatoxin Khái niệm, tính chất Độc tính Các thực phẩm chứa Aflatoxin Giới hạn cho phép Khái niệm, công thức cấu tạo  Aflatoxin độc tố tiết từ nấm Aspergillus flavus, parasiticus fumigatus  Aflatoxin có dẫn xuất quan trọng • AFB1: C17H12O6 • AFB2: C17H14O6 • AFG1: C17H12O7 • AFG2: C17H14O7  Giữa loại thì Aflatoxin B1 chiếm nhiều nông sản gây tác hại nhiều nhất, gây ngộ độc nhanh phổ biến Khái niệm, công thức cấu tạo Hình AFB1 AFB2 Hình AFG1 AFG2 Độc tính  Độc tính aflatoxin cao gấp 10 lần HCN gấp 68 lần Arsen  Gây ngộ độc cấp tính (liều gây chết ngƣời khoảng 10mg)  Phá huỷ tế bào gan, thận phận sống khác  Ảnh hưởng lên hệ miễn dịch  Ăn mòn thành ruột dày  Suy dinh dưỡng, chậm lớn, chết, gây ung thư cho gia súc, gia cầm.Và người ăn thịt chứa aflatoxin bị ung thư gan Aflatoxin xem nguyên nhân gây xơ gan ung thư Hình Bệnh ung thƣ gan Thực phẩm nhiễm Aflatoxin Giới hạn cho phép FDA đƣa giới hạn tối đa Hàm lƣợng ML Tiêu chí (ppm) Ngô loại hạt cho vật 20 Bộ Y tế Việt Nam nuôi chưa trưởng thành Tiêu chí (g/kg) Aflatoxin 15 vật nuôi trưởng thành Ngô loại hạt dùng cho 200 lợn thịt từ 100 pound trở lên Ngô loại hạt cho bò 300 giai đoạn cuối B1, B2, G1, G2 Ngô loại hạt cho giống 100 Aflatoxin B1 Aflatoxin 0.5 M1 sữa sản phẩm sữa 1.2 Các phƣơng pháp phân tích Aflatoxin Phƣơng pháp định tính • Phương pháp BGYF •Phương pháp vi cột •Phương pháp cột lực - típ Florisil •Phƣơng pháp Elisa Phƣơng pháp định lƣợng •Phương pháp huỳnh quang kế - lực •Phƣơng pháp sắc ký mỏng •Phương pháp sắc ký lỏng (LC) Tổng quan E.coli phƣơng pháp phân tích Tổng quan E.Coli 2.2 Các phƣơng pháp xác định E.Coli 2.3 Phƣơng pháp đếm lạc khuẩn 2.1 Tổng quan E.Coli Khái niệm, tính chất Độc tính Các thực phẩm chứa E.Coli Khái niệm Vi khuẩn E.coli (Escherichia coli) thuộc nhóm vi trùng đường ruột Enterobacteriaceae, có nhiều tự nhiên, đường ruột người gia súc Trong đường ruột, chúng diện nhiều đại tràng nên gọi vi khuẩn đại tràng Hình Vi khuẩn E.Coli Hình Vi khuẩn E.Coli biến chứng Độc tính Vi khuẩn E.Coli chia thành nhóm với tác hại sau: • Enteroaggregative (EAggEC): ST vi khuẩn bền nhiệt • Enterohemorrhagic (EHEC): Gây bệnh chảy máu ruột, tiêu chảy • Enteroinvasive (EIEC): Gây sốt, nôn mửa, co rút bắp • Enteropathoaenic (EPEC): Nội độc tố • Enterotoxigenic (ETEC): Độc, tiêu chảy, lây nhiễm Như vậy, E.Coli xâm nhập vào thể với hàm lượng đủ lớn gây bệnh đường ruột Thực phẩm nhiễm Aflatoxin 1.2 Các phƣơng pháp phân tíchE.Coli • Phƣơng pháp MNR •Phƣơng pháp đếm lạc khuẩn Phƣơng pháp đếm lạc khuẩn xác định E.Coli Nguyên tắc Dụng cụ - hóa chất Quy trình phân tích Công thức tính Aflatoxin Lƣu ý Nguyên tắc Mẫu đồng hóa cấy lượng định môi trường thạch thích hợp có chứa Lactozo Môi trường có chứa Natri sunfit fucshin có khả ức chế vi khuẩn gram (+) Môi trường này, E.coli sinh trưởng sinh andehyt, acid Andehyt tác động đến phức chất sunfit – fucshin giải phóng fucshin Fucshin nhuộm khuẩn lạc có màu hồng, tròn, có có ánh kim Giả sử, khuẩn lạc có màu hồng, có ánh kim E.coli kiểm tra có sinh Indol hay không Dụng cụ - Hóa chất THIẾT BỊ • Đĩa Petri • Tủ sấy HOÁ CHẤT • Môi trường thạch Lucozo màu lục đỏ sáng mật bò • Tủ hấp • Môi trường EMB • Tủ lạnh • Môi trường Endol • Dụng cụ đồng mẫu • Môi trường Istatri • Pipet • Thuốc thử Indol • Tủ ấm Các hóa chất phải pha chế Dụng cụ phải vô trùng trước, khử trùng, bảo quản lạnh Quy trình phân tích Dung dịch mẫu Pha loãng (0.1; 0.01; 0.001) Mỗi nồng độ làm lần Gieo cấy Cấy 1ml mẫu vào Endol Tủ ấm, 370C, 48h Nuôi ủ Quan sát, ghi nhận lạc khuẩn màu hồng, ánh kim Khẳng định E.coli Quy trình phân tích Khẳng định E.coli MT Endo/EBM 370C, 24h Nhuộm gram, soi kính xác định gram (-) Kiểm tra hình thái Lạc khuẩn màu đỏ Phản ứng IMVIC Phản ứng Indol Phản ứng MR Phản ứng VP Phản ứng Citrate Cấy(MT: Trypton) Cấy(Clark Lubs) Cấy (NH4)2SO4) Cấy(Sim nitrate) Nuôi ủ 440C, 36h Nuôi ủ 370C, 24h Quan sát Nuôi ủ 370C, 24h Quy trình phân tích Kết • Phản ứng Indol: sau thêm thuốc thử Indol, để yên phút Kết dương tính màu đỏ • Phản ứng MR: sau thêm MR Kết dương tính có màu đỏ cho vào • Phản ứng VP: Kết dương tính màu đỏ sau cho thuốc thử 15 – 20 phút • Phản ứng citrate: Kết dương tính màu đỏ thành màu xanh Công thức tính toán Dựa vào số khuẩn lạc nghi ngờ E.Coli đếm đĩa, tổng số ống nghiệm thử Indol dương tính tổng số ống nghiệm thử Indol Số lượng E.Coli có 1ml (1g) mẫu: C CFU CFU N= R(đơn vị , ) n1 + 0.1n2 f1 v ml g C: Tổng số E.Coli đĩa n1: Số đĩa đếm nồng độ pha loãng thấp n2: Số đĩa đếm nồng độ pha loãng cao f1: Hệ số pha loãng đĩa đếm thứ v: Thể tích mẫu cấy đĩa Petri R: Số ống nghiệm thử Indol dương tính/Số ống nghiệm thử Indol Lƣu ý • Khi tiến hành phân tích xác định vi sinh vật phải tiến hành môi trường vô trùng • Dụng cụ, thiết bị phải khử trùng • Hóa chất phải pha trước, vô trùng, bảo quản lạnh • Đeo gang tay tiến hành thí nghiệm TÀI LIỆU THAM KHẢO [...]... ngâm trong nước Javen 10% tối thiểu là 30’ trước khi rửa 2 Tổng quan về E.coli và phƣơng pháp phân tích 2 1 Tổng quan về E.Coli 2.2 Các phƣơng pháp xác định E.Coli 2.3 Phƣơng pháp đếm lạc khuẩn 2.1 Tổng quan về E.Coli Khái niệm, tính chất Độc tính Các thực phẩm chứa E.Coli Khái niệm Vi khuẩn E.coli (Escherichia coli) thuộc nhóm vi trùng đường ruột Enterobacteriaceae, có nhiều trong tự nhiên, trong. .. Như vậy, khi E.Coli xâm nhập vào cơ thể với hàm lượng đủ lớn sẽ gây ra các bệnh về đường ruột Thực phẩm có thể nhiễm Aflatoxin 1.2 Các phƣơng pháp phân tíchE.Coli • Phƣơng pháp MNR •Phƣơng pháp đếm lạc khuẩn Phƣơng pháp đếm lạc khuẩn xác định E.Coli Nguyên tắc Dụng cụ - hóa chất Quy trình phân tích Công thức tính Aflatoxin Lƣu ý Nguyên tắc Mẫu đã đồng nhất hóa được cấy một lượng nhất định trong môi trường... 10x • Aflatoxin B1(1,2,4,8 ppb) Quy trình phân tích Chuẩn bị mẫu 25 ml MeOH 60% 5g mẫu Trộn đều Mẫu đã nghiền Lắc đều Để yên Lấy 15ml phân 15p-20p Lọc tích Bình định mức Quy trình phân tích Phân tích mẫu 50 ml chuẩn 50 ml MeOH 50 ml mẫu 50 ml MeOH Tiến hành song song Các giếng mẫu (không phải Erlen, hình minh họa) Để yên 10p Cho vào chậu nƣớc Javen 5% Phân tích Rửa lại 5 lần Đập khăn  = 450 nm bằng... hay nhựa tiếp xúc với Aflatoxin phải được ngâm trong nước Javen 10% tối thiểu là 30’ trước khi rửa Phƣơng pháp Elisa phân tích Aflatoxin Nguyên tắc Dụng cụ - hóa chất Quy trình phân tích Công thức tính Aflatoxin Lƣu ý Nguyên tắc Phương pháp này kết hợp của kháng thể và kháng nguyên Kháng thể kháng Aflatoxin được phủ lên bề mặt các giếng nhựa thử Aflatoxin trong mẫu sẽ cạnh tranh với Aflatoxin có gắn... Methanol HPLC grade chiết mẫu  Aflatoxin chuẩn B1 trong Benzen - Acetonitrit (98:2)  Dung dịch triển khai: Cloroform – Aceton (9:1)  Nước cất Quy trình phân tích Chuẩn bị mẫu 5g NaCl 125ml MeOH 70% 25g mẫu Trộn đều Lắc đều Để yên Lấy 15ml pha 15p-20p Lọc loãng 1/3 nƣớc Lọc và lấy 15ml Mẫu đã nghiền Bình định mức phân tích Quy trình phân tích Qua cột sắc ký H2O vào đầy cột Tránh tạo bọt khí 20 ml PSB để... mẫu đã lọc Bơm 2-3 ml không khí qua cột để khô, tháo cột và lau cột Lấy 15 ml dd 1ml MeOH rửa giải, hứng dd Dd mẫu Quy trình phân tích Qua cột sắc ký Hình Minh hoạ cột Quy trình phân tích Định lƣợng Làm khô dd giải hấp bằng khí N2 ở 40-50oC Chấm mẫu và chuẩn trên giấy silicagen Hoà tan cặn bằng Benzen-acetonitril (98:2) Clorofom-aceton (9:1) Cho vào hệ dung môi, đậy nấp Khoảng 30 phút Soi đèn UV 365nm... nhiều Aflatoxin trong mẫu thì càng ít Aflatoxin có gắn enzyme bám vào kháng thể Như vậy, màu sẽ đậm khi có ít Aflatoxin và màu nhạt khi có nhiều Aflatoxin Bằng phương pháp đo màu trên máy Elisa có thể xác định được hàm lượng Aflatoxin Dụng cụ - Hóa chất THIẾT BỊ • Micro pipet 1,8,12 • Máy đọc Elisa • Máy lắc (để chiết mẫu) • Máy lắc Vortex • Pipet tip • Giếng mini phủ kháng thể • Và các dụng cụ thủy...Phƣơng pháp sắc ký bản mỏng phân tích Aflatoxin Nguyên tắc Dụng cụ - hóa chất Quy trình phân tích Công thức tính Aflatoxin Lƣu ý Nguyên tắc Mẫu sau khi xử lý sẽ được đưa qua cột sắc ký, cột được nhồi bằng các gel kháng thể Khi mẫu đi qua cột, các gel kháng thể sẽ làm nhiệm vụ hấp phụ các vi nấm Aflatoxin Sau đó, chúng ta rửa cột bằng nước cất để loại bỏ các chất còn lại và giải hấp Aflatoxin... tính toán Nồng độ của Aflatoxin B1 là 𝑺 𝒀 𝑽 𝒈 𝑨𝒍𝒂𝒕𝒐𝒙𝒊𝒏 𝑩𝟏 = ( 𝒉𝒐ặ𝒄 𝒑𝒑𝒃 ) 𝑿 𝑾 𝒌𝒈 Trong đó: S: thể tích của Aflatoxin chuẩn có độ sáng bằng X l mẫu (l) Y: Nồng độ của Aflatoxin B1 chuẩn (0.5 l/ml hoặc 0.5 ppm) V: thể tích hoà tan cặn (200 l) X: Thể tích có độ sáng bằng S l chuẩn W: Số gam mẫu đi qua cột (1g) Lƣu ý  Chấm trong tủ hút để dung môi bay nhanh, chấm từ từ để các chấm thật nhỏ, kích thước... (Escherichia coli) thuộc nhóm vi trùng đường ruột Enterobacteriaceae, có nhiều trong tự nhiên, trong đường ruột của người và gia súc Trong đường ruột, chúng hiện diện nhiều ở đại tràng nên còn gọi là vi khuẩn đại tràng Hình Vi khuẩn E.Coli Hình Vi khuẩn E.Coli biến chứng mới Độc tính Vi khuẩn E.Coli được chia thành 5 nhóm với các tác hại như sau: • Enteroaggregative (EAggEC): ST là vi khuẩn bền nhiệt • Enterohemorrhagic