Nghiên cứu chế tạo chế phẩm đông khô probiotic chống loạn khuẩn đường ruột

BỘ Y TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI NGUYỄN VĂN THÀNH NGHIÊN CỨU CHÊ TẠO CHÊ PHAM đ ồ n g k h ô PROBIOTIC CHỐNG LOẠN KHUAN đ ư ờn g r u ộ t (KHOÁ LUẬN TỐT NGHÍỆP Dược SỸ KHOÁ 2002-^07'^?' Người hướng dẫn Nơi thực hiện Thời gian thực hiện TS. ĐÀM THANH XUÂN Bộ môn Công Nghiệp Dược 02/2007 - 05/2007 HÀ NỘI, THÁNG 05/2007 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đàm Thanh Xuân - người thầy đã trực tiếp tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn PGS.TS Từ Minh Koóng, Thạc sĩ Lê Xuân Hoành đã đóng góp những ý kiến quí báu cho tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn. Hoàn thành luận văn này, tôi cũng đã nhận được nhiều sự giúp đỡ của các thầy cô và các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Công nghiệp Dược- trường Đại học Dược Hà Nội. Tôi xin chân thành cam ơn. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè những người đã luôn khích lệ và động viên tôi đạt được những thành công ngày hôm nay. Hà Nội, tháng 05 năm 2007 Sinh viên Nguyễn Văn Thành MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH VẼ, Đổ THỊ ĐẬT VẤN ĐỂ 1 PHẦN 1. TỔNG QUAN 2 1.1. LOẠN KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT 2 1.1.1. Vai trò của hệ vi sinh vật đường ruột 2 1.1.2. Loạn khuẩn đường ruột 3 1.2. ĐẠI CƯƠNG VỂ PROBIOTIC 6 1.2.1. Khái niệm về probiotic 6 1.2.2. Các vi khuẩn dùng làm probiotic 8 1.2.3. Cơ chế tác động của probiotic 9 1.2.4. ứng dụng của probiotic 10 1.3. PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG KHÔ 13 1.3.1. Khái niệm về đông khô và sự chuyển pha của nước trong 13 đông khô 1.3.2. ứng dụng của phương pháp đông khô 14 1.3.3. Các giai đoạn trong quá trình đông khô 15 1.3.4. Cấu trúc máy đông khô 17 PHẦN 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 18 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIÊT BỊ 18 2.1.1. Nguyên liệu, hoá chất 18 2.1.2. Máy móc, thiết bị 18 2.1.3. Một số môi trường sử dụng trong nghiên cứu 19 2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứ u 19 2.2.1 Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng 19 2.2.2. Phương pháp tạo dịch tế bào 20 2.2.3 Phương pháp đông khô chê tạo chê phẩm probiotic 21 2.2.4. Phương pháp đánh giá tỉ lệ sống sót của vi khuẩn trong 22 một số chế phẩm probiotic 2.2.5. Phương pháp đánh giá tỉ lệ sống sót của L. acidophilus; s. 22 cerevisỉae trước và ngay sau đông khô. 2.2.6. Phương pháp đánh giá độ ổn định của chế phẩm với các 23 môi trường độn khác nhau và điều kiện bảo quản khác nhau PHẦN 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24 3.1. KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT 24 3.1.1. Khảo sát tỷ lệ sống sót của vi khuẩn trong một số chế 24 phẩm probiotic trên thị trường 3.1.2. Đánh giá tỉ lệ sống sót của L. acidophilus, s. cerevisiae 25 trước và ngay sau đông khô 3.1.3. Đánh giá độ ổn định của chế phẩm đông khô Lactobacillus 27 acidophilus ở điều kiện bảo quản khác nhau vói cùng một môi trường độn 3.1.4. Đánh giá độ ổn định của chế phẩm đông khô L. 34 acừlophilus với các môi trường độn khác nhau trong cùng một điều kiện bảo quản 3.1.5. Đánh giá độ ổn định của chế phẩm đông khô 36 Saccharomyces cerevisiae sau 4 tuần ở các điều kiện bảo quản. 3.2. BÀN LUẬN 37 KẾT LUẬN 39 ĐỂ XUẤT 39 ran 24 25 27 28 29 29 31 31 33 34 35 36 37 3.1: Kết quả khảo sát một số chế phẩm probiotic 3.2: Kết quả đếm số lượng tế bào trước và ngay sau đông khô 3.3: Số lượng tế bào còn sống trước và sau khi đông khô 3.4: Số lượng tế bào trong 0,20g chế phẩm đông khô với sữa gầy 5% 3.5: Số lượng tế bào trong 0,20g chế phẩm đông khô vói sữa gầy 10% 3.6: Số lượng tế bào trong 0,20g chế phẩm đông khô vói sữa gầy 30% 3.7: Số lượng tế bào trong 0,20g chế phẩm đông khô với lactose 10% 3.8: Số lượng tế bào trong 0,20g chế phẩm đông khô với lactose 30% 3.9: Số lượng tế bào trong 0,20g chế phẩm đông khô với nước cất 3.10: Số lượng tế bào trong 0.20g chế phẩm đông khô với các môi trường độn ở điều kiện 5°c 3.11: Số lượng tế bào trong 0.20g chế phẩm đông khô với các môi trường khi bảo quản ở nhiệt độ phòng 3.12: Số lượng tế bào trong 0.20g chế phẩm đông khô với các môi trường khi bảo quản ở nhiệt độ 40°c 3.13: Số lượng tế bào trong 0,20g chế phẩm sau 4 tuần ở các điều kiện bảo quản DANH MỤC CÁC BÁNG Hình 1.1: Hình 3.1: Hình 3.2: Hình 3.3: Hình 3.4: Hình 3.5: Trang Giản đồ pha của nước 13 Số lượng tế bào còn sống trước và ngay sau đông khô 26 Số lượng tế bào trong 0,20g chế phẩm đông khô với sữa 28 gầy 5% ở điều kiện bảo quản 5°c Sự biền thiên về số lượng tế bào trong chế phẩm đông 30 khô với sữa gầy 30% ở các điều kiện bảo quản Sự biền thiên về số lượng tế bào trong chế phẩm đông khô 32 gầy 30% ở các điều kiện bảo quản Sự biền thiên về số lượng tế bào trong chế phẩm đông 33 khô vói môi trường nước ở các điều kiện bảo quản DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, Đổ THỊ ĐẶT VẤN ĐỂ Thế giới ngày nay không ai còn nghi ngờ gì nữa về những đóng góp của công nghệ sinh học cho sự tiến bộ của xã hội loài người. Chẳng thế mà trong hai thập kỷ cuối cùng của thế kỉ XX, khoảng 20 giải Nobel đã được trao cho những khám phá trong lĩnh vực nghiên cứu này. Các sản phẩm của công nghệ sinh học rất phong phú, đa dạng, được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả trong nhiều lĩnh vực sản xuất và đời sống. Trong lĩnh vực y tế là kháng sinh, insulin, vaccin ; trong lĩnh vực nông nghiệp là thuốc trừ sâu có nguồn gốc vi sinh, phân hữu cơ vi sinh vật, chế phẩm vi sinh vật hữu hiệu ; trong lĩnh vực năng lượng là cồn, khí sinh học Sản phẩm probiotic là một trong những thành tựu của công nghệ sinh học. Nó được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của đời sống, một trong những ứng dụng quan trọng nhất là chống rối loạn tiêu hoá ở người. Xuất phát từ những hiệu quả điều trị của chế phẩm probiotic chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu chế tạo chế phẩm đông khô probiotic chông loạn khuẩn đường ruột” với các mục tiêu: • Đánh giá tỉ lệ sống sót của vi khuẩn Lactobacillus acidophilus và nấm men Saccharomyces cerevỉsiae trước và ngay sau quá trình đông khô. • Đánh giá độ ổn định của chế phẩm với các môi trường độn khác nhau và điều kiện bảo quản khác nhau. • Sơ bộ đánh giá tỉ lệ sống sót của vi khuẩn trong một số chế phẩm probiotic lưu hành trên thị trường. PHẦN 1. TỔNG QUAN 1.1. LOẠN KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT: 1.1.1. Vai trò của hệ vi sinh vật đường ruột Cơ thể người chứa đến 1014 tế bào vi sinh vật, gấp khoảng 10 lần tổng số tế bào của bản thân cơ thể. Chúng chủ yếu cư trú trong đường tiêu hoá với thành phần rất phong phú, thậm chí đến 400 loài. Chất chứa trong dạ dày có khoảng 103- 105 vi khuẩn /gam. Trong ruột có pH kiềm hơn nên số lượng vi khuẩn tăng lên. Đối với ngưói lớn ở chất chứa trong dạ dày có 103-106 vi khuẩn/gam. Trong hỗng tràng có 105-108 vi khuẩn/gam, trong hồi tràng có 108-1010 vi khuẩn/gam, còn ở trực tràng và đại tràng thì có khoảng 1011 vi khuẩn/gam chất chứa bên trong. Số vi khuẩn này chiếm đến 40% trọng lượng của phân khô [9], [11], [13]. Vi khuẩn trong ống tiêu hoá cùng với vật chủ hình thành một hệ sinh thái mà sự cân bằng là cần thiết cho sức klioẻ vật chủ [9]. Vi khuẩn ở một có một vai trò sinh lý rất lớn, chúng tham gia vào quá trình tiêu hoá các chất và chuyển hoá các chất. Chúng hoàn thành tiêu hoá tinh bột và chất xơ, góp phần vào chuyển hoá nước, dị hoá protein và sản sinh các amino acid như indol, làm giảm bilirubil ở ruột, thuỷ phân ure, tổng hợp vitamin nhóm B, nhóm K [9], [13]. Ở manh tràng và đại tràng, chúng “hoá giáng” các thuốc uống vào đường tiêu hoá: ví dụ thuỷ phân glucosid trợ tim bằng các enzym đặc hiệu do chúng bài suất ra; phân huỷ một số thuốc có độc tính như digitalin thành những chất không độc [9]. Ngoài ra vi sinh vật ở đường ruột còn giữ vai trò là một “ hàng rào vi khuẩn” ngăn chặn các vi khuẩn gây bệnh đường ruột xâm nhập như: Shigella, Samonelỉa, Escherichia, Klebsiella, Clostridium, Campylobacter, Streptococcus, Staphylococcus và Enterococcus [9], [11] 2 1.1.2. Loạn khuẩn đường ruột a. Khái niệm Khái niệm về loạn khuẩn và danh từ loạn khuẩn đã được A. Nissh đưa vào thực tế vi sinh vật học từ những năm 1916 nhưng ý nghĩa của nó về mặt bệnh học thì mới được chú ý đến kể từ sau Chiến tranh Thế giới thứ hai khi đã xuất hiện những thuốc kháng sinh để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn [9]. Vi khuẩn sống ở đường ruột gồm có hai nhóm vi khuẩn: nhóm thứ nhất là nhóm vi khuẩn có lợi như: Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus acidophilus, Bacterodes (vi khuẩn kị khí) các vi khuẩn có lợi này giúp cơ thể tiêu hoá thức ăn tốt hơn, giúp cơ thể tổng hợp một số vitamin nhóm B, vitamin nhóm K và tiết ra một số chất ức chế không cho vi khuẩn có hại sinh trưởng vượt trội. Nhóm thứ hai là nhóm vi khuẩn gây bệnh đường ruột như: Shigella, Samonella, Escherichia, Klebsiella, Clostridium, Campylobacter, Streptococcus, Staphylococcus, Enterococcus Bình thường hai nhóm vi khuẩn này kiềm chế lẫn nhau trong đường ruột tạo thế cân bằng. Vì một lý do nào đấy các vi khuẩn có lợi chết đi, vi khuẩn gây bệnh tăng sinh một cách đột ngột vượt quá ngưỡng sẽ đưa đến rối loạn tiêu hoá biểu hiện qua các triệu chứng như tiêu chảy, khó tiêu, chướng bụng Ví dụ, khi uống thuốc kháng sinh kéo dài có thể làm chết nhiều vi khuẩn có ích dẫn đến phá huỷ mối cân bằng. Trong trường hợp đó loạn khuẩn sẽ xảy ra [9]; [11; [13]. b. Nguyên nhân và điều kiện phát sinh loạn khuẩn Loạn khuẩn có rất nhiều nguyên nhân và điều kiện phát sinh như: [9] • Suy dinh dưỡng • Suy mòn cơ thể do bệnh mãn tính (khối u, bệnh cơ quan tạo huyết, bệnh thuộc các hệ thống) • Thay đổi thời tiết • Phẫu thuật 3 [...]... bào trong 0,20g sản phẩm Số lượng tế bào ngay sau đông khô được tính bằng công thức 2: At= A*m/0.2 Với At : là Số lượng tế bào trong sản phẩm ngay sau đông khô A: là số lượng tế bào trong 0,20g sản phẩm ngay sau đông khô m: là khối lượng sản phẩm 2.2.6 Phương pháp đánh giá độ ổn định của chế phẩm với các môi trường độn khác nhau và điều kiện bảo quản khác nhau Sản phẩm sau khi đông khô với các môi trường... PHÁP ĐÔNG KHÔ 1.3.1 Khái niệm về đông khô và sự chuyển pha của nước trong đông khô Đông khô là quá trình làm khô các thuốc và chế phẩm sinh học ở nhiệt độ thấp, dưới các điều kiện cho phép, để loại trừ nước bằng cách thăng hoa (thay đổi trạng thái từ thể rắn sang thể hơi mà không qua thể lỏng) [2], [5], [16] 13 Trong giản đồ pha (chỉ điều kiện cân bằng giữa các dạng hay các pha khác nhau) của nước: đường. .. nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn và một số virus [22], [26] 14 Phương pháp đông khô còn một vài hạn chế như: thời gian tiến hành đông khô đòi hỏi khá dài, giá thành sản phẩm tương đối cao, một số thuốc có bản chất là protein dễ bị phá huỷ bởi quá trình đông lạnh hoặc làm khô Độ ổn định của các chủng vi sinh vật được bảo quản theo phương pháp đông khô ở các đợt đông khô khác nhau là khác nhau [2],... cầu không còn lớp tuyết bao phủ Sản phẩm đông khô được lấy ra khỏi bình, cân sản phẩm và bảo quản trong các điều kiện khác nhau - Tiến hành đông khô nhiều lần với các môi trường chất độn khác nhau như: nức cất; sữa gầy 5%, 10%, 20% và 30%; lactose 5%, 10%, 20% và 30% 2.2.4 I ỉ ương pháp đánh giá tỉ lệ sống sót của vi khuẩn trong một số chế phẩm probiotic Để đánh giá tỉ lệ sống sót của vi khuẩn trong chế. .. khuẩn có ích là nguyên nhân quan trọng nhấtdẫn đến rối loạn tiêu hoá [9]; [13] c Phương hướng điều trị Sử dụng các chế phẩm probiotic là biện pháp vừa đơn giản, rẻ tiền vừa có tác dụng cải thiện rõ rệt chứng loạn khuẩn đường ruột, phục hổi lại cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột [11] Các vi sinh vật probiotic được lựa chọn dùng cho người rất phong phú Tuỳ từng mục tiêu chữa bệnh mà lựa chọn các vi khuẩn. .. L bulgarỉcus 9 tháng Tên sản phẩm 1 o r-H o Biolacto (Mỹ) 00 Số lượng vi khuẩn đếm được r*H Số lượng vi khuẩn trên nhãn C Tên v sv Thời hạn bảo quản 2,3.105 8 tháng 109 4,1.106 7 tháng 108 6,3.107 Nhân xét: Chế phẩm Antibio có tỉ lệ vi sinh vật sống cao nhất: sau 12 tháng số lượng vi khuẩn trong chế phẩm hầu như không giảm 24 So với các chế phẩm nước ngoài thì hai chế phẩm của Việt nam (Biolactyl,... trường MRS), để trong tủ C02 ở nồng độ 5%; 32°c Sau 3-4 ngày đọc kết quả 2.2.3 Phương pháp đông khô chê tạo chế phẩm probiotic Nguyên tắc: hỗn dịch vi sinh vật được đem đi đông lạnh và làm khô dưới áp suất chân không Ở đây nước sẽ được chuyển trực tiếp từ pha rắn sang pha khí mà không qua pha lỏng Sơ đồ quá trình đông khô: 21 Tiến hành: - Lấy 100ml dịch tế bào đem ly tâm với vận tốc 4.000v/phút, trong thời... quản huyết tương, sau đó tiếp tục được nghiên cứu và ngày càng được chú ý phát triển và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: Dùng để bào chế các dạng thuốc đông khô như thuốc tiêm, thuốc nhỏ mắt, ngoài ra còn được dùng trong một số dạng bào chế đặc biệt như viên nén rã nhanh, bột vô khuẩn dùng cho đường hô hấp [2], [12] Dùng để bào chế các chế phẩm sinh học như probiotic, vaccin [2], [23] Dùng để... ngay sau đông khô 22 Tiến hành đếm số lượng tế bào Lactobacillus acidophilus, Saccharomyces cerevisiae trước và ngay sau đông khô Số lượng tế bào trước khi đông khô chính là số lượng tế bào trong 100ml dịch tế bào Sử dụng phương pháp pha loãng liên tục, tính số lượng tế bào theo công thức 1 Số lượng tế bào ngay sau đông khô được xác định như sau: Cân chính xác 0,20g chế phẩm ngay sau đông khô pha loãng... vật, chất thải và thực phẩm lên men hay hư hỏng [25] Bifidobacteria là vi khuẩn Gram dương, không di động, không bào tử, hình que với rất nhiều dạng, phần lớn là kị khí bắt buộc Chúng có mặt trong phân một vài ngày sau khi sinh và là một thành phần chính của vi sinh vật đường ruột bình thường [25] 1.2.3 Cơ chế tác động của probiotic a Probiotic sản sinh các chất ức chế Vi khuẩn probiotic có thể sản sinh . chống rối loạn tiêu hoá ở người. Xuất phát từ những hiệu quả điều trị của chế phẩm probiotic chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: Nghiên cứu chế tạo chế phẩm đông khô probiotic chông loạn khuẩn. 2 1.1. LOẠN KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT 2 1.1.1. Vai trò của hệ vi sinh vật đường ruột 2 1.1.2. Loạn khuẩn đường ruột 3 1.2. ĐẠI CƯƠNG VỂ PROBIOTIC 6 1.2.1. Khái niệm về probiotic 6 1.2.2. Các vi khuẩn dùng. lượng tế bào trong 0,20g chế phẩm đông khô với lactose 30% 3.9: Số lượng tế bào trong 0,20g chế phẩm đông khô với nước cất 3.10: Số lượng tế bào trong 0.20g chế phẩm đông khô với các môi trường