Tổng hợp, nghiên cứu sự tạo phức của đồng (II) sulfate với hexaconazole và hoạt tính sinh học của chúng

MỞ ĐẦU Phức chất là những hợp chất tạo được các nhóm riêng biệt từ các nguyên tử, ion hoặc phân tử với những đặc trưng như số phối trí, không phân ly hoàn toàn trong dung dịch hoặc trong

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC 1

LỜI CAM ĐOAN 3

LỜI CẢM ƠN 4

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT 5

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH 6

MỞ ĐẦU 8

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 10

1 1 Triazole và hexaconazole 10

1 1 1 Nhóm triazole 10

1 1 2 Hexaconazole 14

1 1 3 Phức chất của kim loại chuyển tiếp với nhóm triazoles 14

1 1 4 Một số ứng dụng của phức chất của kim loại chuyển tiếp với nhóm triazoles 19

1 2 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NGUYÊN TỐ ĐỒNG 21

1 2 1 Giới thiệu chung 21

1 2 2 Khả năng tạo phức 21

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2 1 Vật liệu 24

2 2 Máy móc, thiết bị 24

2 3 Phương pháp nghiên cứu 25

2 3 1 Phương pháp tổng hợp phức 25

2 3 2 Phương pháp xác định thành phần 25

2 4 Phương pháp xác định cấu trúc 26

2 4 1 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 26

2 4 2 Phương pháp phổ khối lượng 27

2 4 3 Phương pháp phổ hấp thụ hồng ngoại 29

2 4 4 Phương pháp phân tích nhiệt 29

2 5 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học của phức chất 30

2 5 1 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 30

2 5 2 Chủng nấm Rhizoctonia solani 30

2 5 3 Môi trường nuôi cấy 31

2 5 4 Cách tiến hành 32

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Tổng hợp và nghiên cứu sự tạo phức của đồng sulfate với hexaconazole 34

3 1 1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất phản ứng 35

3 1 2 Ảnh hưởng tỷ lệ mol đến hiệu suất phản ứng 36

3 1 3 Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất phản ứng 37

3 1.4 Quy trình điều chế phức Cu (II) hexaconazole 37

3 1 5.Tính chất vật lý của phức 38

3 2 Nghiên cứu cấu trúc của phức 38

3 2 1 Nghiên cứu cấu trúc của phức bằng phổ hồng ngoại của hexaconazole và Cu(hexa)2 38

3 2 2 Nghiên cứu cấu trúc phức chất bằng NMR 41

3 2 3 Nghiên cứu cấu trúc phức chất bằng phổ MS 50

3 2 4 Nghiên cứu cấu trúc phức bằng phương pháp phân tích nhiệt 52

3 2 4 Phân tích hàm lượng kim loại trong phức chất 53

3 2 5 Phân tích hàm lượng hexaconazole trong phức chất 54

3 2 5 Thăm dò hoạt tính sinh học của phối tử và phức chất 55

KẾT LUẬN 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận văn này do bản thân tôi thực hiện, những kết quả nghiên cứu được đưa ra trong luận văn này là của bản thân tôi và chưa từng được ai nghiên cứu, sử dụng và công bố trên các tạp chí khoa học trước đây, các số liệu và kết quả nghiên cứu được thực hiện một cách trung thực và chính xác

Tác giả luận văn

LỜI CẢM ƠN

 

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Trần Khắc Vũ, Phó chủ nhiệm Bộ môn Hóa Dược-Bảo vệ thực vật - Khoa Hóa - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình hướng dẫn về chuyên môn, phương pháp nghiên cứu và tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn Ban chủ nhiệm, các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ Hóa dược và BVTV, trường Đại học Bách khoa Hà nội đã luôn tạo điều kiện

và hỗ trợ tôi trong công việc để tôi có thể hoàn thành luận văn này

Xin cảm ơn Viện Kỹ thuật Hóa học, Viện Đào tạo Sau đại học, trường Đại học Bách Khoa Hà nội đã tạo điều kiện thuận lợi để luận văn hoàn thành đúng tiến

độ

Xin trân trọng cảm ơn Ban giám đốc, lãnh đạo và cán bộ Phòng Kiểm định

Dư lượng và Chất luợng thuốc BVTV – Trung tâm Kiểm định và Khảo nghiệm thuốc BVTV ph a Bắc – C c Bảo Vệ Thực đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình triển khai nghiên cứu đề tài

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè, và các bạn cùng lớp Cao học Kỹ thuật hóa học 2014B đã giúp đỡ và động viên tôi trong hai năm học tập và quá trình làm luận văn

Hà Nội, tháng 06 năm 2016

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

2 HPLC Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH

Trang

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của triazoles 11

Hình 1.2: Công thức cấu tạo tautomeric của 1, 2, 4 triazoles 11

Hình 1.3: Công thức cấu tạo tautomeric của 1, 2, 3 triazoles 12

Bảng 1.1: Sự phụ thuộc cấu trúc và tác dụng của 1, 2, 4 triazole 13

Hình 1.4: Công thức cấu tạo của hexaconazole 15

Hình 1.5: Sự tạo phức của phenyl triazole với đồng II 16

Hình 1.6: Các khả năng tạo liên kết của nhóm triazol với kim loại chuyển tiếp 16

Hình 1.7: Sơ đồ biểu diễn các kiểu phối hợp của triazole, acetate, và Pb (II) trong [Pb 2 (μ-atrz) 2 (μ-CH 3 COO) (CH 3 COO)]n 17

Hình 1.8: Vị trí liên kết tạo phức của Pt 2+ với 4-R-1, 2, 4-triazole 17

Hình 1.9: Sơ đồ tạo phức của đồng II với 3, 5-diamino-1, 2, 4-triazole 17

Hình 1.10: Phức chất của đồng acetate với hexaconazole 18

Hình 1.11: Phức chất của Zn(II), Cd(II) và Hg(II) với N-3, 4-bis(2-pyridyl)-5-(3-pyridyl)-1, 2, 4-triazole 18

Hình 1.12: Phức của Ni2+ với 4-amino-3, 5-bis(pyridyl)-1, 2, 4-triazole 19

Bảng 1.2: Khả năng ức chế của phức chất và phối tử 20

Hình 1.13: Đồng phân hình học của phức đồng 23

Hình 1.14: Công thức dự đoán phức chất của đồng II với hexaconazole 23

Hình 2.1: Sợi nấm Rhizoctonia solani 31

Hình 3.1: Sơ đồ tổng hợp phức chất 34

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất tạo phức 35

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của tỷ lệ mol chất tham gia phản ứng 36

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất phản ứng 37

Hình 3.2: Phổ hấp thụ hồng ngoại của hexaconazole 38

Bảng 3.4: Vùng phổ hấp thụ đặc chưng của hexaconazole 39

Bảng 3.5: Một số dải hấp thụ đặc trưng cho phổ Hexaconazole và Cu(hexa)2 40

Hình 3.4: Sự liên kết của hexaconazole với đồng II 41

Hình 3 5: 1H-NMR của hexaconazole 42

Bảng 3.6: Các tín hiệu trong phổ 1H NMR của hexaconazole 43

Hình 3.6: 1H-NMR của phức chất 43

Bảng 3.7: Các tín hiệu trong phổ 1H NMR của phức chất 44

Hình 3.7: 13C-NMR của hexaconazole 46

Bảng 3.8 Bảng quy kết các tín hiệu trong phổ 13C-NMR của hexaconazole 46

Hình 3.8: Phổ 13C-NMR của phức chất 48

Bảng 3.9 Bảng quy kết các tín hiệu trong phổ 13C-NMR của phức chất 48

Hình 3.9: Mô hình chuyển hóa electron trong vòng triazoles 49

Hình 3.10: Phổ khối lượng của phức chất Cu(hexa)2 50

Bảng 3.10: Cường độ tương đối của pic đồng vị trong phổ khối lượng Cu[hexa]2 51

Hình 3.11 Phổ phân tích nhiệt của phức chất Cu(hexa)2 52

Bảng 3.11: Quá trình phân hủy phức chất bởi nhiệt 52

Bảng 3.12: Kết quả phân tích hàm lượng kim loại đồng trong phức chất 53

Bảng 3.13: Sự phụ thuộc của nồng độ và diện tích của chuẩn hexaconazole 54

Hình 3.12: Đường chuẩn 5 điểm của hexaconazole 54

Bảng 1.14: Kết quả phân tích hàm lượng hexaconazole trong phức chất 54

Bảng 3.15: khả năng ức chế nấm Rhizoctonia solani 55

Bảng 3.16: Phần trăm ức chế tăng trưởng trên nấm Rhizoctonia solani của hexaconazole và phức chất 56

MỞ ĐẦU

Phức chất là những hợp chất tạo được các nhóm riêng biệt từ các nguyên tử, ion hoặc phân tử với những đặc trưng như số phối trí, không phân ly hoàn toàn trong dung dịch (hoặc trong chân không), có thành phần phức tạp (số phối trí và số hoá trị không trùng nhau) [3]

Từ thế kỷ XVIII, nhà hóa học người Đức Diesbat đã điều chế ra được phức chất đầu tiên là xanh Beclin có thành phần KCN Fe(CN)2Fe(CN)3 [4] và phức chất luôn được nghiên cứu và phát triển cho đến ngày nay Việc nghiên cứu tổng hợp và

và ứng dụng các hợp chất phức chất hiện nay vẫn đang là một trong những hướng phát triển cơ bản của hóa học hiện đại Với sự phát triển của của các phương tiện thiết bị phân tích, cho phép xác định thành phần và cấu cấu trúc ngày càng chính xác đã giúp cho việc nghiên cứu tổng hợp và ứng dụng của các phức chất trong các lĩnh vực đời sống đạt được nhiều thành tựu và ngày càng phong phú Có thể nói rằng hiện nay hóa học phức chất đang phát triển rực rỡ và là đối tượng nghiên cứu rộng lớn của các chuyên ngành hóa lý, hóa phân tích, hóa học hữu cơ, hóa sinh, hóa môi trường, hóa dược, hóa chất bảo vệ thực vật…

Trong lĩnh vực hóa học hữu cơ phức chất là lĩnh vực mà các nhà hóa học hữu cơ có thể tìm thấy những ứng dụng thực tế cho các hợp chất mà họ tổng hợp hoặc tách biệt ra được Rất nhiều phức chất đã được sử dụng làm xúc tác cho các phản ứng mới lạ trong tổng hợp hữu cơ nhất là trong tổng hợp bất đối, tổng hợp lựa chọn lập thể… Việc sử dụng các phối tử hữu cơ đã mở ra một không gian phát triển

vô tận và đầy hứa hẹn đối với phức chất, với kỹ thuật tổng hợp hữu cơ tinh vi có thể giúp tạo ra hàng loạt phối tử thỏa mãn yêu cầu đa dạng của sự tạo phức và phù hợp với hiện thực hóa các ý tưởng sáng tạo độc đáo của các nhà hóa học phức chất Hóa học phức chất đã và đang phát huy ảnh hưởng sâu rộng sang lĩnh vực hóa sinh cả về

lý thuyết và ứng dụng Rất nhiều thành tựu trong các lĩnh vực như hóa sinh vô cơ, y dược và trong nông nghiệp gắn liền với việc nghiên cứu tổng hợp và ứng dụng của phức chất có các phối tử hữu cơ

Một trong những phối tử hữu cơ có khả năng dùng để tổng hợp ra các phức chất có hoạt tính sinh học có khả năng ứng dụng trong trong đời sống là triazole Bladin là người đầu tiên tổng hợp và nghiên cứu triazole và ông là người đặt tên cho lớp chất này cách đây hơn một thế kỷ Cho đến nay, các nhà hóa học đã tổng hợp được hơn 2000 chất từ triazole nhưng ứng dụng thực tế lại chưa được nghiên cứu nhiều Các chất có vòng triazole thường được dùng như một chất trung gian để tổng hợp thành các chất có ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực như y học, dược phẩm, hóa chất bảo vệ thực vật [17]

Nghiên cứu sự tạo phức của các kim loại chuyển tiếp với hợp chất hữu cơ nhóm triazole đã được thực hiện bởi rất nhiều nhà khoa học Các ứng dụng phức chất của kim loại chuyển tiếp với lớp triazole đã được biết đến trong lĩnh vực y học

và dược phẩm [10, 11, 12, 13, 14, 17, 19, 20, 22, 23, 24] Tuy nhiên các chất hữu cơ triazole do có cấu tạo phong phú bởi các radical (-R ) mà nó được gắn vào vòng triazole có ảnh hưởng lớn đến khả năng tạo phức, độ bền vững của phức cũng như hoạt tính sinh học của phức còn nhiều vấn đề cần nghiên cứu nhất là nghiên cứu để tạo ra phức chất của kim loại chuyển tiếp với nhóm triazole [10, 11, 12, 13, 14, 17,

19, 20, 22, 23, 24] do nhóm phức chất này còn chưa được nghiên cứu nhiều cả về tổng hợp ra lẫn ứng dụng Bởi vậy nghiên cứu phức chất của kim loại chuyển tiếp với nhóm triazole cần tiếp tục được nghiên cứu và khảo sát các khả năng ứng dụng của nó

Trong lĩnh vực nông nghiệp, lớp chất triazole được nghiên cứu sử dụng để phòng trừ sâu, bệnh hại cây trồng và đôi khi còn có khả năng trừ cỏ Để tăng hiệu lực phòng trừ cũng như tăng dải phổ đối với sâu bệnh hại cây trồng đã có những công trình nghiên cứu sự kết hợp giữa kim loại chuyển tiếp với nhóm triazole [8, 9] Kết quả nghiên cứu, ứng dụng của các hợp chất tạo thành còn hạn hẹp

Hiện nay, đồng (II)sulfate đã và đang được ứng dụng trong bảo vệ cây trồng tránh khỏi tác hại của một số nấm bệnh như rỉ sắt, phấn trắng, sương mai… Tuy nhiên do đồng (II) sulfate tan tốt trong nước nên chúng dễ bị rửa trôi bởi các tác nhân khách quan như thời tiết nên hiệu quả phòng trừ của chúng chưa được cao

Nhưng nếu biến đổi chúng thành một chất mà tính tan của chúng giảm đi như cho tác dụng với nước vôi trong để tạo ra đồng oxychloride thì chúng lại hiệu quả hơn rất nhiều

Hexaconazole là một trong những chất thuộc lớp chất triazole được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong việc bảo vệ cây trồng Phổ tác động của hexaconazole rất rộng, chúng có khả năng phòng trừ được nhiều loại bệnh hại cây trồng như đạo ôn, khô vằn, phấn trắng, rỉ sắt… Nhưng khi sử dụng hexaconazole thuần tiễn trong bảo vệ cây trồng đôi khi chúng bị kháng thuốc và hiệu quả phòng trừ giảm đi Để khắc phục những nhược điểm, phát huy những ưu của đồng (II) sulfate và hexaconazole chúng tôi mong muốn kết hợp đồng với hexaconazole tạo

ra một chất mới với hy vọng chúng có ưu điểm vượt trội so với đồng sulfate và

hexaconazole khi chúng đứng riêng rẽ Bởi vậy, tôi đã chọn đề tài: “Tổng hợp, nghiên cứu sự tạo phức của đồng (II)Sulfate với hexaconazole và hoạt tính sinh học của chúng” Với mục tiêu tìm ra được những chất mới có khả năng ứng dụng

trong việc bảo vệ cây trồng, giảm thiểu tác hại của nấm bệnh và sâu đối với cây trồng và tăng khả năng bảo vệ cây trồng, chống kháng thuốc của các loài nấm bệnh

đối với cây trồng

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1 1 Triazole và hexaconazole

1 1 1 Nhóm triazole

Triazoles là những lớp chất dị vòng được tổng hợp và nghiên cứu đầu tiên bởi Bladin [17] Hầu như tất cả các triazoles là rắn ở nhiệt độ phòng Chúng có màu sắc khác nhau, từ trắng đến nâu sẫm Triazoles tan tốt trong dung môi phân cực như ethanol, chloroform, dimethyl sulfoxide và dimethyl formamid, nhưng không tan trong các dung môi không phân cực như ete … [16]

Ngày nay, lớp triazole được biết đến với hai dạng cấu tạo là 1, 2, 3 triazole

và 1, 2, 4 triazole được thể hiện qua hình 1[17, 20]

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của triazoles

1, 2, 4-Triazoles tồn tại ở hai dạng tautomeric: 1H- và 4H- dạng như trong hình 2 [17, 20]

Hình 1.2: Công thức cấu tạo tautomeric của 1, 2, 4 triazoles

Bằng các thiết bị nghiên cứu đồng phân hiện đại đã chỉ ra rằng đồng phân 4H- là ổn định nhất

1, 2, 3-Triazole tồn tại ở ba dạng tautomeric: 1H-, 2H- và 3H- dạng như trong hình 3[9]

Hình 1.3: Công thức cấu tạo tautomeric của 1, 2, 3 triazoles

Trong đó R1, R3, R4, R5 có thể là hydro hoặc các nhóm chức khác nhau Vị trí và cấu tạo của các nhóm chức R1, R3, R4, R5 sẽ quyết định đến tính chất hóa lý

và hoạt tính sinh học của chúng

Trong y học và dược phẩm triazole đã được nghiên cứu ứng dụng trên nhiều đối tượng bệnh như là kháng khuẩn, kháng virus, kháng nấm, chống co giật, chống ung thư, chống viêm và kháng lao [18, 20]

Trong lĩnh vực hóa chất bảo vệ thực vật, từ những năm 1970 lớp chất triazole

đã được nghiên cứu và đưa vào sử dụng thực tế để bảo vệ cây trồng bởi các tập đoàn đa quốc gia như bayer, mosanto Phổ tác động của 1, 2, 4 Triazole và dẫn xuất của nó rất rộng, chúng có thể dùng để trừ sâu, trừ bệnh, trừ cỏ và ức chế sinh trưởng phát triển cây trồng như hoạt chất paclobutrazole Hoạt tính sinh học phụ thuộc vào cấu trúc của mỗi hoạt chất Với việc thay thế các nhóm chức R1, R3, R5 khác nhau, các nhà khoa học đã tìm ra được những hoạt chất mới, các hoạt chất này có độ hòa tan, cơ chế tác động và hiệu lực hiệu quả khác nhau phụ thuộc vào các dẫn xuất R1,

R3, R5 khác nhau [16] có cấu tạo và ứng dụng như trong bảng 1.1:

Bảng 1.1: Sự phụ thuộc cấu trúc và tác dụng của 1, 2, 4 triazole

dẫn

Trừ bệnh nấm mốc và

rỉ sét

Có tác động thấm sâu bảo vệ và diệt trừ

Trừ bệnh nấm như Ascomycetes

và lưu dẫn

Trừ bệnh đạo ôn

Trừ các loại nấm trên nhiều loại cây trồng

lúa

Trừ cỏ tiền nảy mầm và hậu nảy mầm

Trừ cỏ

mầm và hậu nảy Trừ cỏ

mầm, Trừ cỏ lá rộng

Trừ bệnh đạo ôn, khô vằn, rỉ sắt, phấn trắng

Ngăn ngừa quá trình tổng hợp sterol và GA3, hấp thụ vào cây qua hệ thống lá, thân và rễ

Điều hòa sinh trưởng cây trồng

Kìm hãm men chlolinesterase, thuốc trừ sâu phổ rộng qua con đường tiếp xúc và miệng

Trừ sâu

Kìm hãm men acetylchlolinesterase qua con đường tiếp xúc và miệng

Trừ sâu, tuyến trùng

Từ bảng 1.1 cho thấy R5 thường là H, các nhóm thế R1 và R3 có sự thay đổi nhiều đặc biệt là R1 Sự phụ thuộc giữa cấu trúc các nhóm thế R1, R3, R5 khác nhau thì chúng có cơ chế tác động cũng như ứng dụng khác nhau

Về cơ chế tác động, các loại thuốc trừ nấm nhóm triazole ức chế một enzym đặc biệt là C14-demethylase Enzym này đóng một vai trò trong việc sản xuất sterol Sterol như ergosterol cần thiết cho cấu trúc màng tế bào Khi bị ức chế, tế bào không sản sinh được ergosterol, các chất bị tích tụ bên trong tạo ra khối u trong

tế bào[4]

1 1 2 Hexaconazole

Hexaconazole là một loại thuốc diệt nấm chứa nhóm triazole dùng trong bảo

vệ cây trồng

Về tính chất lý hóa, hexaconazole là chất rắn kết tinh màu trắng, nhiệt độ sôi ở

111oC và tan tốt trong các dung môi hữu cơ

Theo phân cấp độc của WHO thì hexaconazole được xếp vào nhóm độc IV và thường được gia công ở dạng 5% SC để phòng trừ các bệnh hại lúa và hoa màu, chúng được dùng để đặc trị các bệnh khô vằn, lem lép hạt, phấn trắng, … Ở Việt Nam, hoạt chất hexaconazole được đăng ký với nhiều tên thương phẩm với các mức hàm lượng khác nhau và các dạng thuốc khác nhau như SC, WG, WP Trên thực tế thì hoạt chất hexaconazole thường được hỗn hợp với nhiều loại thuốc bảo vệ thực vật khác để tăng phổ phòng trừ và hiệu quả cho đối tượng sử dụng

Về mặt cấu trúc hóa học, hexaconazole có công thức phân tử là C14H17Cl2N3O

và có công thức cấu tạo như sau:

Hình 1.4: Công thức cấu tạo của hexaconazole

1 1 3 Phức chất của kim loại chuyển tiếp với nhóm triazoles

Như đã trình bày ở trên, do cấu tạo của vòng triazole có 3 nguyên tử nitơ và

2 nối đôi trong vòng dị vòng bởi vậy có mật độ electron lớn, các cặp electron tự do của nguyên tử nitơ có thể tạo liên kết σ- cộng hoá trị cho - nhận với các obitan trống của các kim loại chuyển tiếp [5, 7] Đã có nhiều công trình nghiên cứu sự tạo phức của kim loại chuyển tiếp với lớp chất triazole và ứng dụng của nó như các tác giả [8, 10, 11, 12, 17, 21, 22]

Theo tác giả [9] 1, 2, 4-Triazole ngoài hoạt tính sinh học chúng còn có khả năng tạo phức với các nguyên tử kim loại để làm xúc tác cho phản ứng oxy hóa

Phức chất này được coi như một loại enzyme thúc đẩy sự chuyển giao của một nguyên tử hydro từ một bề mặt đặc biệt đến một phân tử ôxy, tạo thành nước hoặc hydro peroxide Sự hình thành của phức được tạo ra nhờ liên kết cho nhận giữa đôi điện tử tự do của nitơ với kim loại chuyển tiếp như hình 1.5

Hình 1.5: Sự tạo phức của phenyl triazole với đồng II

Theo Irene Braunlich [12] nghiên cứu đã chỉ ra các hợp chất 1, 2, 4-triazole (trz) và các dẫn xuất của nó là phối tử đa năng có khả năng tạo liên kết phức với kim loại chuyển tiếp vì chúng chứa 3 nguyên tử nitơ với 2 nối đôi, các nguyên tử nitơ này có khả năng tạo ra nhiều liên kết và có rất nhiều kiểu liên kết tạo phức có thể hình thành như mô tả trong hình 1.6

Hình 1.6: Các khả năng tạo liên kết của nhóm triazol với kim loại chuyển tiếp

Trong hình 1.6, điểm màu xanh là nguyên tử nitơ, màu nâu là kim loại chuyển tiếp Từ cấu tạo của triazole cho thấy không những chúng có cấu trúc tautomeric khác nhau mà còn là một phối tử anion (trz -) và do đó chúng có khả năng tạo phức Bên cạnh những phức thường thấy là 1 nguyên tử nitơ tham gia tạo phức thì chúng có thể tạo cầu nối của 2 thậm chí cả 3 nguyên tử nitơ cùng có thể tham gia tạo phức Về cơ bản 1, 2, 4-triazole có thể tạo liên kết cho nhận đối với cả

3 nguyên tử nitơ trong phân tử Tuy nhiên, trong các hợp chất thì N4 thường bị che chắn và chỉ có N1 và N2 không bị che chắn nên có khả năng tạo liên kết [12]

Cũng đồng quan điểm nhƣ trên, tác giả [10] cũng nêu giả thiết sự tạo phức của Pb với nhóm triazol đƣợc thực hiện qua nguyên tử N của nhóm triazol với kim loại chì nhƣ hình 1.7

Hình 1.7: Sơ đồ biểu diễn các kiểu phối hợp của triazole, acetate, và Pb (II) trong [Pb 2

Cùng nghiên cứu sự tạo phức của chì với triazole, Irene Br¨aunlich trong luận án tiến sỹ của mình, ông đã đƣa ra công thức phức tạo thành dựa trên kỹ thuật phân tích cấu trúc X-ray kết quả cho thấy 2 nguyên tử nitơ đã tham gia phối trí với 2 nguyên tử paladi và tạo ra vòng càng cua 6 cạnh bền vững nhƣ hình 1.8 [12]

Hình 1.8: Vị trí liên kết tạo phức của Pt 2+ với 4-R-1, 2, 4-triazole

Đồng quan điểm với tác giả [12], Ashesh Shirish Belapure [9] cũng nêu cơ chế tạo phức của đồng II với 3, 5-diamino-1, 2, 4-triazole đƣợc thực hiện qua 2 nguyên tử nitơ của vòng triazole nhƣ hình 1.9

Hình 1.9: Sơ đồ tạo phức của đồng II với 3, 5-diamino-1, 2, 4-triazole

Ngoài các nguyên tử nitơ của nhóm triazol, nhiều tác giả cũng chỉ ra rằng sự tạo phức còn có thể xảy ra ở nhóm chức khác như OH như tác giả [22] đã đề cập

Tuy nhiên, khi bị che chắn bởi các các nhân như acetate hóa, sự tạo liên kết trong phức chất lại không được thực hiện bởi các nguyên tử nitơ như đã nêu ở trên

mà thực hiện liên kết tạo phức qua nguyên tử các bon của vòng triazole Điều này thể hiện trong công trình công bố của tác giả [24] và được mô tả như hình 1.10

Hình 1.10: Phức chất của đồng acetate với hexaconazole

Trong công trình nghiên cứu của mình, các tác giả [16] đã đưa ra cấu tạo của phức 1 càng giữa kim loại Zn(II), Cd(II) và Hg(II) với N-3, 4-bis(2-pyridyl)-5-(3-pyridyl)-1, 2, 4-triazole như hình 1.11:

4-bis(2-pyridyl)-5-(3-pyridyl)-1, 2, 4-triazole

Bằng phương pháp kết tinh đơn tinh thể và chụp phổ nhiễu xạ tia x, tác giả [10] đã chứng minh được sự tạo phức của Ni2+ với 4-amino-3, 5-bis(pyridyl)-1, 2, 4-triazole kết quả thu được tương tự như các tác giả trên và được mô phỏng qua hình 1.12 như sau:

Hình 1.12: Phức của Ni 2+ với 4-amino-3, 5-bis(pyridyl)-1, 2, 4-triazole

Phức này còn được thử nghiệm hoạt tính kháng nấm của nó để chống lại ba

loại nấm Aspergillus niger, Aspergillus flavus và Candida albicans, kết quả cho

thấy hiệu quả của phức chất cao hơn so với phối tử [10]

Tùy thuộc vào vị trí của các nguyên tử trong vòng năm cạnh mà các nguyên

tử trong triazoles có thể tạo thành liên kết với các kim loại chuyển tiếp để tạo ra các cầu nối và dạng hình học khác nhau để tạo liên kết bền vững [17]

Nói chung, với nhóm triazole khi gặp kim chuyển tiếp loại đều có thể tham gia tạo phức Liên kết tạo phức có thể ở tại vị trí nguyên tử N hoặc C với kim loại tùy thuộc vào dạng muối của kim loại, xu hướng tạo phức thường tạo ra các vòng 4,

5 hoặc 6 cạnh tùy thuộc vào cấu trúc của phối tử Thông thường phối tử có số cạnh chẵn như là 4 hoặc 6 cạnh và càng cua thì thường cho cấu trúc bền vững hơn

1 1 4 Một số ứng dụng của phức chất của kim loại chuyển tiếp với

nhóm triazoles

Phức chất của kim loại chuyển tiếp với nhóm triazole đã được nghiên cứu và ứng dụng bởi nhiều nhà khoa học [10, 14, 15, 24] Ứng dụng của chúng được nghiên cứu vào nhiều lĩnh vực khác nhau như sinh học, y học, nông nghiệp bảo vệ cây trồng…

Trong kết quả nghiên cứu của tác giả [10] đã tổng hợp thành công phức của

Ni (II) với 4-amino-3, 5-bis(pyridyl)-1, 2, 4-triazole (abpt) và Fe(II) với phenyl-1H-pyrazole-5-yl) pyridine (phpzpy) và thử hoạt tính của các phức chất

2-(3-này trên nấm Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Candida albicans Kết quả thử

nghiệm tính kháng khuẩn thể hiện trong bảng 1 2

Bảng 1.2: Khả năng ức chế của phức chất và phối tử

do Để giải thích cho khả năng ức chế cao hơn của phức chất so với phối tử, tác giả [10] đã giải thích bằng lý thuyết chelation Chelation làm giảm đáng kể sự phân cực của các ion kim loại vì chia sẻ một phần điện tích dương của nó với nhóm các nhóm liên kết cho nhận electron Khi phức chất được tạo ra hệ thống vành đai chelate được hình thành Chelation như vậy có thể tăng cường tính ưa mỡ của các nguyên

tử kim loại trung tâm và do đó làm tăng tínhkỵ nước của phức khi đó chúng có thể

dễ dàng thấm vào bên trong màng tế bào thông qua các lớp lipid của màng tế bào

Cùng với công bố của tác giả [10], tác giả [14] cũng đã nghiên cứu tổng hợp

sự tạo phức của Cu2+ với hexaconazole để cải tạo môi trường bằng việc thử hoạt

tính sinh học của chúng với các chủng nấm Botrytis cinerea, Sclerotonia

sclerotiorum, Ventuia pirina và Blumeria graminis kết quả cho thấy phức không ức chế bằng phối tử với các nấm Botrytis cinerea, Sclerotonia sclerotiorum, Ventuia pirina nhưng lại đặc biệt hiệu quả đối với nấm Blumeria graminis

Kết quả nghiên cứu của tác giả [15] cũng chỉ ra rằng cả phức chất và phối tử

đều ức chế các nấm Vibrio cholerae O1 và Salmonella paratyphi

Tác giả [24] đã tổng hợp, nghiên cứu hoạt tính sinh học của 4 - {[(Z) - metoxyphenyl) methylidene] amin} -5-phenylglycine 4H-1, 2, 4-triazole-3-thiol với một số phức kim loại chuyển tiếp Kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học được thử

(2-nghiệm trên nấm Escherichia coli và Staphylococcus Aurens Kết quả là cả phối tử

và phức chất đều ức chế nấm Phức chất có khả năng ức chế nấm tốt hơn phối tử

Có nhiều phát minh sáng chế về sự tạo phức và ứng dụng của phức chất trong nhiều lĩnh vực khác nhau H Bayer, R Cook và meyer W Von đã phát minh ra ứng dụng của phức niken với triazole trong nhiều lĩnh vực khác nhau như sử dụng

sử lý hạt giống, dùng làm thuốc trừ sâu Ví dụ như phức chất của niken với lớp chất

l, 2, 4 triazole có thể gia công thành các dạng bột thấm ướt, dạng nhũ tương đạm đặc, hạt phân tán trong nước để phòng trừ nhiều loại sâu bệnh

Từ các kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy, phức chất của nhóm triazole có rất nhiều ứng dụng trong thực tiễn và cần khảo sát và nghiên cứu nhiều hơn nữa

1 2 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NGUYÊN TỐ ĐỒNG

1 2 1 Giới thiệu chung

Đồng nguyên chất rất mềm và dễ uốn Bề mặt tiếp xúc có một xỉn màu cam Nó được sử dụng như một chất dẫn nhiệt và điện, vật liệu xây dựng, và một thành phần của hợp kim Các kim loại và hợp kim của nó đã được sử dụng hàng ngàn năm nay Trong thời đại La Mã, đồng đã được chủ yếu được khai thác trên đảo

đỏ-Síp, vì thế mà nguồn gốc của tên của kim loại như сyprium (kim loại của Síp), sau

đó rút ngắn сuprum Các hợp chất của nó thường gặp phải như muối đồng, thường

truyền đạt màu xanh hoặc màu xanh lá cây để các khoáng chất như màu ngọc

lam và đã được sử dụng rộng rãi trong lịch sử như các sắc tố Công trình kiến trúc được xây dựng với ăn mòn đồng để cung cấp cho lên men xanh Nghệ thuật trang trí nổi bật tính năng đồng, cả của chính nó và như là một phần của các sắc tố

Đồng có hai hóa trị 1 và 2 và có khối lượng nguyên tử là 63,546 gam và nhiệt độ nóng chảy là 1,083 4 °C

Trong tự nhiên, nguyên tố Cu tồn tại hai đồng vị là Cu(63) và Cu(65) trong

đó Cu(63) chiếm 73% và Cu (65) chiếm 27%

1 2 2 Khả năng tạo phức

Cấu hình electron của nguyên tử Cu2+: 1s²2s²2p63s23p63d9

Cấu hình obitan lai hóa của Cu2+ (3d9) như sau:

Khi có sự lai hóa sp3, nguyên tử đồng (II) tạo ra những obitan lai hóa trống Các obitan này dễ dàng nhận những cặp electron tự do của các nguyên tử như: O; N; Cl, F… để lấp đầy các obitan này tạo liên kết bền vững Cũng như các ion kim loại nhóm d khác, nó có khả năng tạo phức với hầu hết các phối tử như O, N, Cl,

Cl-, I-, SCN-, CN-

Do có cấu hình electron (3d9) các phức chất của Cu2+ sự lệch đáng kể với cấu hình bát diện đều, ngay cả khi có sự phối trí của sáu phối tử đồng nhất (do hiệu ứng Ian - Telơ) Có hai kiểu lệch cấu hình bát diện đều: kiểu lệch tamphương, ở đó bát diện bị kéo dài hoặc bị nén lại theo một trong số các trục bậc ba và chuyển thành hình đối lăng trụ tam phương (II 4‟) Kiểu lệch thứ hai là kiểu lệch tứ phương (II 4”), khi đó bát diện bị kéo dài ra hoặc bị nén lại theo trục bậc bốn Kiểu tứ phương

(kéo dài) khi đến giới hạn có thể làm mất hoàn toàn hai phối tử trans và biến thành

phức chất vuông phẳng phối trí bốn Hiện tượng đồng phân hình học thường xảy ra với các phức chất có số phối trí sáu [3]

Hình 1.13: Đồng phân hình học của phức đồng

Trong công thức phân tử của hexaconazole có chứa một nhóm chức (-OH) và một

dị vòng chứa 3 nguyên tử nitơ với các liên kết –C=N và –C-N- Nhóm chức –OH và nhóm –C=N, –C-N- đều còn dư một đôi điện tử tự do trên nguyên tử O và N nên chúng có khả năng tham gia tạo phức với các kim loại chuyển tiếp như Cu (II)

Trong cấu tạo của phức chất, các phức có vòng và đặc biệt là các vòng 6 cạnh thì luôn bền vững hơn các trường hợp khác Căn cứ vào lý thuyết trên, có thể

dự đoán cấu trúc của phức Cu (II) với hexaconazole như hình 1.14 dưới đây

C

2

C O H

Cl Cl

Hình 1.14: Công thức dự đoán phức chất của đồng II với hexaconazole

Từ những vấn đề đã trình bầy ở trên, có thể thấy các phức chất của đồng với các hợp chất chứa nhóm triazole đã được quan tâm nghiên cứu nhiều trong những năm gần đây Nghiên cứu sự tạo phức của kim loại chuyển tiếp với vòng triazole và những ứng dụng của nó đã được một số tác giả thực hiện và công bố Tuy nhiên phức chất của đồng (II) sulfate với hexaconazole và ứng dụng của chúng thì chưa được nghiên cứu nhiều, các nghiên cứu của tác giả [14,17] về phức chất của đồng với hexaconazole lại ứng dụng trên những đối tượng nấm không phổ biến ở Việt Nam

 Dung môi: methanol, ethanol, dimethylformanmide, dioxane, dimethylsulfoxide, tetrahydrofuran, các dung môi tinh khiết dạng PA do Merck và Aldrich cung cấp

2 2 Máy móc, thiết bị

 Tiến hành phản ứng trên máy khuấy từ trong tủ hút

 Tủ sấy, tủ bảo ôn, cân điện tử, dụng cụ thủy tinh…

 Thiết bị sắc ký lỏng cao áp với detector UV-Vis

 Tủ vô trùng, máy hấp tiệt trùng, bể ổn nhiệt…

- Các phương pháp đo phổ:

 Phổ hồng ngoại được đo trên máy FT-IR IMPACT-410

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được đo trên máy Bruker AM500 NMR Spectrometer

FT- Phổ khối ESI-HRMS được đo trên máy FTICR MS Varian tại Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

 Phổ phân tích nhiệt được thực hiện trên máy NETGSCH STA 409 PC/PG

 Phổ UV-VIS được ghi trên máy sắc ký lỏng cao áp với detector DAD tại Trung tâm kiểm định và khảo nghiệm thuốc Bảo vệ thực vật phía Bắc

 Thử hoạt tính sinh học được thực hiện tại Trung tâm kiểm định và khảo nghiệm thuốc Bảo vệ thực vật phía Bắc

2 3 Các phương pháp thực nghiệm

2 3 1 Phương pháp tổng hợp phức

- Tham khảo các công trình nghiên cứu đã được công bố về phức chất của đồng acetate và đồng clorua với hexaconazole cũng như phương pháp tổng hợp chúng theo tác giả [8, 23] Đồng thời tham khảo tác giả [3] về phản ứng tạo phức của phối

tử không tan trong nước

Điều kiện phân tích như sau [8]:

ra bằng dung dịch chuẩn natrithiosulfate với chỉ thị hồ tinh bột trong môi trường axit acetic [7]

Hàm lượng đồng trong mẫu, X, biểu thị bằng phần trăm khối lượng (%) được

tính theo công thức

m

N V

1000

5 ,

Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C) dưới tác dụng của từ trường ngoài Sự cộng hưởng này được biểu diễn bằng độ chuyển dịch hoá học Ngoài ra, đặc trưng của phân tử còn được xác định nhờ vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling)

 Phổ 1H - NMR: Trong phổ này, độ chuyển dịch hoá học () của các proton được xác định trong thang ppm từ 0- 14 ppm, tùy thuộc vào mức độ lai hoá của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phần Dựa vào những đặc trưng của

độ chuyển dịch hoá học và tương tác spin mà xác định cấu trúc phân tử của hợp chất

 Phổ 13

C - NMR: Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon Mỗi nguyên tử cacbon

sẽ cộng hưởng ở trường khác nhau và cho các tín hiệu phổ khác nhau Thang đo của phổ này là 0- 230 ppm

Phân tử hexaconazole và phức chất của chúng đều không có nhiều proton nên việc quy kết các pic trong phổ 1H-NMR tương đối dễ dàng Thông thường,

proton có mặt trong các nhóm OH, NH-hidrazin, NH-amit, CH=N đôi lúc có thêm proton của các nhóm CH3, C6H5, CH2 Trong phổ cộng hưởng từ, proton ở liên kết đôi CH=N cộng hưởng ở vùng gần 8, 3ppm và proton của OH ở khoảng 6 ppm [6, 13]

Ngoài ra phương pháp cộng hưởng 13C cũng bổ trợ cho việc nghiên cứu cấu tạo của phối tử và phức chất vì số lượng các nguyên tử C trong chúng cũng không nhiều

Sự thay đổi tín hiệu cộng hưởng của cacbon trong các nhóm nguyên tử sẽ giúp ta khẳng định sự hình thành liên kết mới đã xảy ra chưa và xảy ra tại vị trí nào

2 4 2 Phương pháp phổ khối lượng

Phương pháp phổ khối lượng là phương pháp khá hiện đại và quan trọng trong việc xác định một cách định tính và định lượng thành phần cũng như cấu trúc của các hợp chất hoá học Ưu điểm nổi bật của phương pháp này là có độ nhạy cao, cho phép xác định tương đối chính xác phân tử khối của hợp chất

Cơ sở của phương pháp là sự bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ trung hoà bằng các phân tử mang năng lượng cao để biến chúng thành các ion phân tử mang điện tích dương hoặc phá vỡ thành các mảnh ion, các gốc Tuỳ thuộc vào cấu tạo và tính chất của chất nghiên cứu mà người ta chọn phương pháp bắn phá và năng lượng bắn phá thích hợp

Hiện nay trong phương pháp phổ khối người ta thường áp dụng các phương pháp ion hoá khác nhau như: ion hoá hoá học (CI), ion hoá bằng phương pháp bụi electron (ESI), bắn phá bằng nguyên tử tăng tốc (FAB), phun mù e dùng khí trợ giúp (PAESI)…Các phương pháp này đều có những ưu, nhược điểm riêng Tuy nhiên, trong số các phương pháp trên, phương pháp bụi e là phù hợp nhất và được

sử dụng để nghiên cứu các phức chất của kim loại Ưu điểm của phương pháp này

là năng lượng ion hoá thấp do đó không phá vỡ hết các liên kết phối trí giữa kim loại và phối tử Phương pháp ESI gồm 4 bước cơ bản như sau:

+ Bước 1: Ion hoá mẫu trong dung dịch: Bước này thực hiện sự chuyển đổi

pH để tạo ra sự ion hoá trong dung dịch mẫu

+ Bước 2: Phun mù: Dựa trên hai tác động là sức căng bề mặt và độ nhớt của dung môi hoà tan mẫu để điều chỉnh áp suất phun dung dịch mẫu

+ Bước 3: Khử dung môi: Giai đoạn này phụ thuộc vào nhiệt bay hơi của dung môi để cung cấp khí khô và nóng cho phù hợp với sự bay hơi của dung môi

+ Bước 4: Tách ion ra khỏi dung dịch: ion được tách ra có thể là một phân tử chất nghiên cứu liên kết với H+

hay Na+, K+, NH4+… nếu chúng có mặt trong dung dịch hoặc có thể là một ion chất khi mất đi một proton

Điều kiện ghi mẫu: Vùng đo m/z: 50-2000; áp suất phun mù 30psi; tốc độ khí làm khô 8lít/phút, nhiệt độ làm khô 3250C; tốc độ khí: 0, 4ml/phút; chế độ đo possitive

Dựa vào phổ khối lượng có thể thu được các thông tin khác như: khối lượng phân tử chất nghiên cứu, các mảnh ion phân tử, tỉ lệ các pic đồng vị Từ các thông tin này có thể xác định được công thức phân tử của phức chất và cấu tạo của phức chất dựa vào việc giả thiết sơ đồ phân mảnh

Trong các phức chất nghiên cứu đều có các nguyên tố có nhiều đồng vị thì pic ion phân tử sẽ tồn tại dưới dạng một cụm pic của các đồng vị Cường độ tương đối giữa các pic trong cụm pic đồng vị cũng cho ta thông tin để xác nhận thành phần phân tử hợp chất nghiên cứu Muốn vậy người ta đưa ra công thức phân tử giả định của hợp chất nghiên cứu Tính toán lý thuyết cường độ tương đối của các pic đồng vị sau đó so sánh với cường độ của các pic trong phổ thực nghiệm để suy ra sự tương quan tỷ lệ các pic đồng vị theo thực tế và theo lý thuyết Từ đó khẳng định công thức phân tử phức chất giả định

2 4 3 Phương pháp phổ hấp thụ hồng ngoại

Phổ hấp thụ hồng ngoại được xây dựng nhờ vào sự khác nhau về dao động của các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại Như

vậy, dựa vào phổ hồng ngoại có thể xác định được các nhóm chức đặc trưng của từng loại hợp chất, ví dụ dao động hoá trị của nhóm OH tự do trong các nhóm hydroxyl là 3450 – 3200 cm-1[5, 8]; của nhóm C=N khoảng 1600 – 1400 cm-1 và của nhóm N=N khoảng 1600-1500 cm-1 [3]

2 4 4 Phương pháp phân tích nhiệt

Đây là phương pháp thuận lợi để nghiên cứu phức chất, nó cho phép thu được những dữ kiện lý thú về tính chất của các phức chất rắn Dựa vào hiệu ứng nhiệt có thể nghiên cứu những quá trình biến đổi hoá lý phát sinh ra khi đun nóng hoặc làm nguội chất, ví dụ sự phá vỡ mạng tinh thể, sự chuyển pha, sự biến đổi đa hình, sự tạo thành và nóng chảy các dung dịch rắn, các tương tác hoá học, …

Nếu trong thành phần của phức chất có các phân tử nước kết tinh thì khi đốt nóng chúng sẽ bị tách khỏi phức chất Trong khoảng 60 † 135oC có các hiệu ứng thu nhiệt, gây ra bởi sự tách các phân tử nước kết tinh Dựa vào độ giảm khối lượng trên đường TG khi xảy ra hiệu ứng này, có thể kết luận rằng các phức chất trên đều chứa một phân tử nước kết tinh trong thành phần của chúng [3]

Nhiệt tạo thành của phức chất và độ bền nhiệt của nó trước hết phụ thuộc vào đặc điểm của liên kết ion trung tâm-phối tử Vì bản chất của liên kết này được xác định bởi các tính chất của kim loại tạo phức (kích thước, điện tích, các tính chất phân cực) cũng như của phối tử (kích thước, điện tích, momen lưỡng cực), cho nên

độ bền nhiệt của phức chất cũng phụ thuộc vào các tính chất đó Ngoài ra, độ bền nhiệt của phức chất và các phản ứng phân huỷ nhiệt còn được quyết định bởi tính chất của các ion ở cầu ngoại [3]

2 5 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học của phức chất

2 5 1 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Phức chất của hexaconazole với đồng đã có nhiều tác giả nghiên cứu về hiệu lực kháng khuẩn Theo tác giả [15] nghiên cứu sự ảnh hưởng của phức chất trên các đối tượng như Botrytis cinerea, Sclerotonias clerotiorum, Ventuia pirina, Blumeria graminis

cho kết quả khá thú vị Đối với Botrytis cinerea, Sclerotonias clerotiorum, Ventuia pirina thì phần trăm ức chế tăng trưởng của phức so với hexaconazole là thấp hơn, nhưng đối với Ventuia pirina thì phần trăm ức chế tăng trưởng của phức so với

hexaconazole lại cao hơn Điều này có nghĩa là tùy từng đối tượng mà phức chất có thể có hiệu lực thấp hoặc cao hơn phối tử hexaconazole Trong luận văn này chúng tôi sử dụng nấm Rhizoctonia solani làm đối tượng nghiên cứu hiệu lực sinh học vì

Rhizoctonia solani là loài nấm gây bệnh phổ biến ở Việt Nam

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trên phương pháp pha loãng đa nồng độ Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thông

qua các giá trị thể hiện hoạt tính là MIC (Minimum inhibitor concentration - nồng

độ ức chế tối thiểu) và phần trăm ức chế sự tăng trưởng tăng trưởng đối với sự phát triển của sợi nấm [23] sau 10 ngày và được xác định theo công thức:

I=100X (C-T)/C Trong đó: I = Phần trăm ức chế tăng trưởng sợi nấm

C = Đường kính tăng trưởng của nấm trong mẫu đối chứng (mm)

T = Đường kính tăng trưởng của nấm trong mẫu điều trị (mm)

2 5 2 Chủng nấm Rhizoctonia solani

Rhizoctonia solani là một nấm gây bệnh có phổ ký chủ rộng và phân phối trên toàn thế giới Mầm bệnh này được phát hiện hơn 100 năm trước đây R solani thường xuyên tồn tại và được xem là một tác nhân gây bệnh trong đất gây ra

R solani là được biết đến gây nhiều bệnh thực vật khác nhau như bệnh lở cổ rễ, thối

nấm và xâm nhập vào cây trồng qua các vết thương cơ giới do tưới, canh tác hoặc chăm sóc cây trồng gây ra

Rhizoctonia solani không tạo bào tử và do đó được xác định dựa vào đặc

điểm sợi nấm hoặc phân tích DNA Sợi nấm màu nâu đậm khi nuôi cấy trên môi trường nhân tạo Các sợi nấm rộng 4-15 μm và có xu hướng chia nhánh ở góc bên phải và có góc vuông hoặc gần vuông Một vách ngăn thắt nhẹ ở các chỗ chia nhánh

là dấu hiệu nhận biết dễ dàng nhất với R solani

Hình 2.1: Sợi nấm Rhizoctonia solani Bệnh lở cổ rễ cây con

2 5 3 Môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy PDA thành phần môi trường gồm:

2 5 4 1 Chuẩn bị cấy chuyển tạo nguồn nấm thí nghiệm

Nguồn nấm được Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam cung cấp ở dạng ống thạch nghiêng Tiến hành cấy chuyển sang môi trường đĩa petri để lấy nguồn tản nấm thí nghiệm

Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng PDA nền Tiến hành cân lượng môi trường PDA đủ cho thí nghiệm (theo tỷ ở mục 1 5 3), đưa môi trường vào lò vi sóng làm tan đều môi trường Dùng bông không thấm nước nút để nút miệng bình và dùng giấy bạc bọc kín nút cổ bình

Hấp thanh trùng: Bình đựng môi trường; các dụng cụ khác (đũa thủy tinh, que cấy, khoan thạch; đĩa petri) được gói trong giấy bạc và được cho vào nồi hấp thanh trùng ở nhiệt độ 1200C trong 20 phút

Sau khi hấp thanh trùng, bình tam giác đựng môi trường được đưa vào bể điều nhiệt và được giữ ở nhiệt độ 50 oC; các dụng cụ khác được chuyển sang tủ sấy khô Tiến hành đổ môi trường lên các đĩa Petri đã sao cho độ dày môi trường trên mỗi đĩa khoảng 2mm và để khô 30 phút trong tủ cấy vô trùng Cấy từ ống nghiệm chứa giống sang ống nghiệm chứa môi trường PDA và ủ ở nhiệt độ 27-28 oC Sau

10 ngày các sợi nấm phát triển thành tản đồng đều về tuổi cho thí nghiệm

1 5 4 2 Pha loãng mẫu thử

Mẫu ban đầu được pha loãng trong DMSO và nước cất tiệt trùng thành một dãy nồng độ hoặc theo yêu cầu và mục đích thử Nồng độ mẫu thử được pha loãng

từ cao xuống thấp để thử đến khi tìm được nồng độ ức chế tối thiểu Nồng độ cao nhất là 25 ppm

1 5 4 3 Thử hoạt tính

Lấy 10l dung dịch mẫu thử ở các nồng độ vào 100 ml môi trường PDA được

ổn định nhiệt độ 50 oC trong bể điều nhiệt, lắc cho hoạt chất phân bố đều và chuyển sang các đĩa petri sao cho độ dày môi trường trên mỗi đĩa khoảng 2mm và để khô

30 phút trong tủ cấy vô trùng, tiến hành cấy nấm vào đĩa có chứa môi trường và ủ ở nhiệt độ 27-28 o

C Đo đường kính tản nấm sau 7-10 ngày nuôi cấy đối với tất cả các đĩa nuôi cấy (trộn thuốc và đối chứng)

Trong nghiên cứu này, hoạt tính sinh học đƣợc tiến hành tại phòng thí nhiệm

vi sinh vật của Trung tâm kiểm định và khảo nghiệm thuốc Bảo vệ thực vật phía Bắc và phòng thí nghiệm vi sinh vật của Học viện Nông Nghiệp 1 Hà Nội

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Tổng hợp và nghiên cứu sự tạo phức của đồng sulfate với

Phản ứng tạo phức được tiến hành trong môi trường trung tính bằng cách cho

từ từ hexaconazole được pha sẵn trong ethanol vào dung dịch đồng sulfate trong nước, do hexaconazole không tan trong nước nên khi cho vào dung dịch đồng sẽ bị keo tụ lại, phản ứng khó thực hiện được ở điều kiện này Chúng tôi đã nghiên cứu tìm ra điều kiện phản ứng thích hợp với tỷ lệ nước trong dung dịch đồng sulfate và etanol pha hexaconazole Nồng độ hexaconazole và đồng sulfate trong dung dịch cũng là yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tạo ra phức chất Chúng tôi cũng đã tiến hành khảo sát và nghiên cứu nồng độ phản ứng tối ưu để tạo ra phức chất, từ thực nghiệm cho thấy khi cho phản ứng ở nồng độ cao thì sản phẩm tạo ra nhanh, nhưng lại kèm theo nhiều tạp chất kết tinh cùng, bởi vậy chúng tôi cho tiến hành phản ứng ở nồng

độ thấp để giảm tạp chất sinh ra

Dung dịch CuSO4

Trong nước, CH3COOH

Phức chất của Cu(II) với hexaconazole

Để giảm thời gian phản ứng chúng tôi đã thử sử dụng bơm của sắc ký lỏng

cao áp, sử dụng dây mao quản làm ống phản ứng tăng khả năng tiếp xúc của phối tử

với ion đồng Tăng chiều dài ống phản ứng để tăng hiệu suất Sử dụng bơm cao áp

bơm 2 dung dịch của hexaconazole và đồng sulfate qua bộ trộn và đẩy hỗn hợp vào

ống phản ứng mao quản có thể điều chỉnh nhiệt độ lên 80 o

C Ưu điểm của qui trình này là có thể điều chỉnh tốc độ dòng và tỷ lệ phối trộn dễ dàng có thể tạo phản ứng

nối tiếp bằng cách hồi qui sản phẩm để tiếp tục cho các chất va chạm với nhau tăng

hiệu suất, đồng thời có thể thay đổi nhiệt độ dễ dàng để khảo sát ảnh hưởng của

nhiệt độ đến hiệu suất của phản ứng Nhược điểm là kỹ thuật phức tạp khi sản phẩm

tạo thành kết tinh sẽ gây tắc đường ống mao quản

3 1 1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất phản ứng

Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến sự tạo phức cũng được tiến

hành bằng kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp để có thể điều chỉnh nhiệt độ lò cột phản ứng

dễ dàng với nồng độ ban đầu của Cu2+ là 10- 3M, tỉ lệ Cu2+: Hexa = 1:2, chiều dài

cột phản ứng là 3m và chạy một lần trong 30 phút, nhiệt độ được thay đổi từ 300

C đến 800C Kết quả nghiên cứu được trình bày trong bảng 3.1

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất tạo phức

Với kết quả thể hiện trên bảng 2 cho thấy, khi tăng nhiệt độ thì hiệu suất

phản ứng tạo phức tăng theo, hiệu suất của phản ứng tạo phức là cao nhất ở 600

C đạt khoảng 80% Khi nhiệt độ tăng đến 800C thì hiệu suất thu nhận phức lại giảm,

điều này được giải thích do trong vùng nhiệt độ cao đã xảy ra sự phân hủy phức Vì

vậy, chúng tôi chọn nhiệt độ 600C làm điều kiện nghiên cứu cho các thí nghiệm sau

3 1 2 Ảnh hưởng tỷ lệ mol đến hiệu suất phản ứng

Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ mol đến hiệu suất phản ứng được

tiến hành bằng kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp với nồng độ ban đầu của Cu2+ là 10-3M,

Cu2+)

Hiệu suất (%)

hexaconazole Khi tỷ lệ phối tử ở nồng độ cao, hiệu suất giảm nhanh là do bản thân

phối tử không tan trong nước, khi ở tỷ lệ cao gặp môi trường nước chứa ion đồng sẽ

kết tinh trắng đục làm mất khả năng tương tác trong dung dịch

3 1 3 Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất phản ứng

Phản ứng được tiến hành với nồng độ ban đầu của Cu2+ là 10- 3M, của hexa =

2 x 10-3 M, tỷ lệ mol 1: 2 khuấy 1 giờ sau đó sản phẩm được đặt trong tủ ấm ở nhiệt

độ 600

C ± 20C Kết quả nghiên cứu được trình bày trong bảng 3.3

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất phản ứng

Ngày Hiệu

suất (%)

3 1.4.Quy trình điều chế phức Cu (II) hexaconazole

Hòa tan 0,354 gam hexaconazole (1,1 mmol) trong 80 ml ethanol và 0,1 gam CuSO4 (0,4 mmol) trong 40 ml nước Cho từ từ dung dịch CuSO4 (0,4 mmol) vào dung dịch hexaconazole và khấy đều trong bể ổn nhiệt 600C trong 1 giờ Để dung dịch trong tủ bảo ôn ở nhiệt độ 60o

C, sau 14 ngày dung dịch xuất hiện tinh thể, lọc lấy tinh thể và rửa lại bằng 40ml ethanol và 40ml nước Sấy sản phẩm ở 54oC cho đến khối lượng không đổi, bảo quản sản phẩm trong bình hút ẩm Hiệu suất thu được khoảng 80%

3 1 5.Tính chất vật lý của phức

Phức chất tạo ra là tinh thể rắn màu xanh nhạt, không tan trong methanol, etanol, nước nhưng tan trong các dung môi hữu cơ: dimethylformamide, dimethylsulfoxide, 1,4-dioxane và tetrahydrofuran cho dung dịch màu xanh lam

3 2 Nghiên cứu cấu trúc của phức

3 2 1 Nghiên cứu cấu trúc của phức bằng phổ hồng ngoại của

hexaconazole và Cu(hexa)2

Cấu trúc của phức Cu (II) hexaconazole được phân tích so sánh với hợp chất hexaconazole qua các đỉnh hấp thụ có được từ phổ hồng ngoại của hai chất này Một số dải hấp thụ chính được trình bày trong bảng 3.4

Number of sample scans: 32

Number of background scans: 32

Bảng 3.4: Vùng phổ hấp thụ đặc chưng của hexaconazole

và các dao động hoá trị νC–C, νC–N của nhóm triazole Việc quy gán những dải này gặp khó khăn vì trong vùng này còn có nhiều dải hấp thụ khác nhau của các liên kết C–H, N–H và O–Hnước [3] Trong vùng 3500÷ 3200 cm–1 có pic 3221 là dao động của nhóm OH

Number of sample scans: 32

Number of background scans: 32

Bảng 3.5: Một số dải hấp thụ đặc trưng cho phổ Hexaconazole và Cu(hexa) 2

Theo tác giả [3] sự hấp thụ của nhóm hiđroxyl, Ion hiđroxyl được đặc trưng bằng dải phổ hẹp ở 3750÷ 3500 cm–1 Dải này rõ nét hơn và có tần số cao hơn so với νO–H của nước Các liên kết hiđro giữa phân tử thường làm xuất hiện những dải hấp thụ rộng νO–H của hiđroxyl trong vùng 3450 ÷ 3200 cm–1 Cường độ của các dải này cao hơn cường độ các dải dao động của nhóm OH không liên kết Khi tạo thành liên kết phối trí có sự tham gia của nhóm OH xảy ra sự giảm hằng số lực của liên kết này do sự làm yếu liên kết O–H, do đó làm chuyển dịch dải νO–H của nhóm

OH về vùng tần số thấp Tuy nhiên, trên phổ hấp thụ hồng ngoại của của hexaconazole là 3221 cm-1và phức chất là 3381cm-1

và pic của phổ phức chất bị biến dạng Điều này có thể giải thích là trong phức chất còn có 1 phân tử nước, giữa các phân tử nước có thể tạo liên kết hydro bởi vậy tần số dịch chuyển về phía cao hơn

Ngoài ra còn thấy trên phổ của phối tử tự do có dải hấp thụ ở 1471cm-1 đặc trưng cho dao động hoá trị của liên kết C=N nhưng trong phổ của phức chất dải này dịch chuyển về số sóng thấp hơn (ở 1467cm-1) Điều này chứng tỏ nguyên tử N của nhóm triazol có tham gia tạo liên kết phối trí với ion kim loại trung tâm Khi tham gia liên kết phối trí, mật độ electron trên nguyên tử N này giảm kéo theo sự giảm về

độ bội liên kết C=N và do đó dải hấp thụ đặc trưng cho liên kết này bị dịch chuyển

về phía số sóng thấp hơn