Nuôi cấy tế bào thực vật sản xuất các hợp chất tự nhiên dùng trong y học và thực phẩm

Nuôi cấy tế bào thực vật sản xuất các hợp chất tự nhiên dùng trong y học và thực phẩm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

H p Ch t t nhiên ợ ấ ự

là gì???

Chúng Đ ượ c Chia Làm m y ấ

lo i??? ạ

và…S n xu t chúng ả ấ

ra sao???

 Là các chất trao đổi thứ cấp

(secondary metabolite) được hình

thành với một lượng rất nhỏ trong

cây với chức năng trao đổi sau đó

chúng thoát ra khỏi tế bào đi ra môi

trường ngoài.

Khái Ni mệ

 Là sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với môi trường, bảo vệ thực vật chống lại các tác nhân gây bệnh và động vật ăn cỏ

I T NG QUAN V CÁC H P CH T T NHIÊN Ổ Ề Ợ Ấ Ự

Tinh d uầ

glycoside alkaloid

Phân lo iạ

 Là nhóm chất hữu cơ có chứa Nitơ, có tính bazơ

 Họ alkaloid gồm: codein, nicotine, cafeine, morphine

 Hoạt tính sinh học của các alkaloid rất cao: kích thích hệ

thần kinh (caffein, atropin, cocaine, cathinone…), làm giãn

mạch, hạ huyết áp (Ergot alkaloids), tác dụng lên mạch máu

(hydrastin, ephedrin,…), tác dụng lên bộ máy hô hấp

 Tinh dầu là một loại chất lỏng được chiết

xuất từ thiên nhiên cây cỏ và nhiều loại

thảo dược khác

 Tinh dầu có hai loại: nguyên chất và tinh

dầu hỗn hợp (pha chế tinh dầu nguyên

chất với các loại dầu hoặc tinh dầu khác).

 Sử dụng như chất mùi, chất thơm và dung

 Bao gồm các hợp chất phenolic và flavonoid,

saponin và các cyanogenic glycoside

 Có tính phân cực khá mạnh, nên không tan

trong dung môi kém phân( este, dầu hỏa,

benzen ) Nhưng tan được trong cloroform,

dietyl eter, tan tốt trong ancol và nước.

 Dùng làm thuốc nhuộm và chất mùi thực phẩm

CÁC HO T CH T S D NG TRONG TH C PH MẠ Ấ Ử Ụ Ự Ẩ

 Ch t màuấ  Anthocyannin, betalaine, crocin, crocetin, capsaicin, capsaicinoid

 Ch t mùiấ  Vanilla (Vanilla planifolia), garlic (Allium sativum), onion (A.cepa), chuối, mơ,

táo ,đào, nho, lê, dứa

 Ch t ng tấ ọ  Stevioside (Stevia rebaudiana), miraculin, monellin…

 Tinh d uầ  Hòa nhài, ôliu, bạc hà, hành tây, cam…

CÁC H P CH T S D NG TRONG Y H CỢ Ấ Ử Ụ Ọ

 Alkaloid  Betalain (Callus củ cải đường), caffein (Coffea arabica), berberin (Coptis

japonica), reserpine (Rauwolfia serpentina) , Scopolamine (Hyoscyanus aegypticus) , serpentin (Catharanthus), vinblastine và vincristine

(C.roseus)…

 Steroid  Diosgenin , digoxin, digitoxin….

 Các chất khác  Shikonin, ubiquinone-10, rosmarinic acid, diosgenin, ginsengoside,

Ii QUY TRÌNH S N XU T CÁC H P CH T T NHIÊN Ả Ấ Ợ Ấ Ự

1 Các bước th c hi nự ệ

Mẫu thực vâât

Nuôi cấy trong môi trường lỏng trong các bình thủy tinh có dung tích nhỏ, lắc liên tục

Nuôi cấy tạo thành mô sẹo

Nuôi trong các thiết bị lên men có dung tích lớn, khuấy đảo liên tục Xử lý mẫu thực vâât

Tái sử dụng để sản xuất cây con

Chúng ta sẽ tiết kiệm

được cả 2 thứ này nếu tăng sản lượng các hợp chất tự nhiên khi nuôi

cấy

Sự tiết sản phẩm từ tế bào ra ngoài môi trường.

Biến đổi tiền chất ( precuror feeding) ,

các biến đổi sinh học

Chọn lựa các chủng có khả năng sản xuất cao

Điều kiện môi trường thích hợp.

Xử lý với các chất cảm ứng

Gi i pháp ả

1 Điều kiện môi trường thích hợp.

Môi trường nuôi cấy

Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, ánh sáng, oxygen

Nuôi cấy tế bào ở mật độ cao

2 Chọn lựa các chủng có khả năng sản xuất cao

 Các đặc tính sinh lý của mỗi cá nhân tế bào không luôn luôn thống nhất với nhau Các nhà khoa học đã sử dụng phương pháp chọn dòng tế bào với mục đích là tăng khả năng sản xuất ra các hợp chất cần thiết.

 Người ta cũng sử dụng tế bào trần để chọn lọc các dòng có khả năng sản xuất cao.

3 Biến đổi tiền chất và các biến đổi sinh học

 Việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy các tiền chất thích hợp đôi khi kích thích sự sản xuất các hợp chất thứ cấp

 Sử dụng tế bào thực vật nuôi cấy để biến đổi các cơ chất thích hợp thành sản phẩm mong muốn.

Sự tiết sản phẩm từ tế bào ra ngoài môi trường

 Nhiều sản phẩm thứ cấp được tích lũy trong tế bào nuôi cấy Tuy nhiên có thể làm tăng khả năng sản xuất những chất này bằng cách kích thích cho chúng được tiết ra ngoài môi

trường

 Để làm tăng sự tiết sản phẩm ra môi trường, ta làm tăng tính thấm của màng tế bào nhưng kết quả đạt được rất hạn chế.

5

III S N XU T H P CH T TAXOL T CÂY THÔNG Đ Ả Ấ Ợ Ấ Ừ Ỏ

1 G i á t r c a c â y t h ô n g đ v à h p c h t t a x o l ị ủ ỏ ợ ấ

Thông đỏ xuất hiện cách đây khoảng 1.000 – 1.800

năm là nguồn dược liệu quý trong y học dùng để trị

hen suyễn, viêm phế quản, nấc, tiêu hóa, đau đầu…

Năm 1994, một số nhà khoa học đã công bố” Từ

cây thông đỏ có thể tìm thấy các hoạt chất để chữa

trị bệnh ung thư cụ thể là Taxol chiết xuất từ vỏ các

loài: T.bervifilia, T.cuspidata, T.Yunnanensis,

T.baccata

Mansukh Wani Mornoe Wall

GIAI ĐOẠN 1

NUÔI CẤY MÔ

1 Chuẩn bị mẫu 2 Khử trùng 3 Nuôi cấy tạo mô sẹo

Chuẩn bị mẫu:

 Mẫu được lấy từ những cây thông đỏ đầu dòng được giâm cành trong bầu đất với nhiều độ

khác nhau, có thể là phần ngọn, lá Mẫu phải đáp ứng các tính chất sau

 Mẫu được lấy từ cây biết chắc chắn có khả năng sinh tổng hợp Taxol

 Mẫu phải được chắc chắn rằng lấy từ những cơ quan ( bộ phận) của cây được nói trên

 Mẫu phải sạch bệnh và đang trong giai đoạn phát triển mạnh nhất.

a Mẫu cấy

1

b.Môi trường nuôi cấy

 Khoáng MS (murashige – skoog)

 Ngoài ra, bổ sung thêm nước dừa,

2,4 –D hoặc các loại auxin , bột

chiết nấm men, bổ sung

saccharose,

Khử trùng mẫu:

Các mô cấy được rửa bằng xà phòng cho thật sạch, sau đó rửa dưới vòi nước chảy cho hết xà pòng Sau đó ngâm mô cấy trong dung dịch cồn 700 trong 3 phút, đem ngâm vào dung dịch canxihypocloride 10% trong 15 phút Rửa nước cất vô trùng 3 lần trong tủ cấy.

2

Nuôi cấy tế bào mô sẹo

 Mô sẹo được nuôi cấy trong bình tam giác 200ml, chứa 20ml môi trường , và đặt

trên máy lắc có tốc độ 90-100 vòng / phút Nuôi cấy ở nhiệt độ 28-300 C, ánh sáng 3000lux (100 PPF)

 Sau 2-3 ngày lấy mẫu ra kiểm tra dưới kính hiển vi, đếm số lượng tế bào và xây

dựng đường cong sinh trưởng

3

 Sau 1-2 tuần trong bình nuôi cấy sẽ tạo huyền phù tế bào

 Sau 8 ngày sẽ thu được sinh khối, chuyển sinh khối này sang môi trường nuôi cấy

kế tiếp

 Dung dịch lần sau nhiều hơn dung dịch lần trước 10-15 lần

 Trong khi tiến hành quá trình nuôi cấy , có thể tiến hành nuôi cấy theo từng đợt ,

cũng có thể nuôi cấy liên tục

CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT

Sử dụng dung môi

Sử dụng vi sóng

Nuôi cấy tế bào trần

Phương pháp siêu tới hạn

Step 1 Step 2 Step 3 Step 4

 hỗn hợp cetone:hexane được sắc ký với

cột sắc ký Florisil pha động là hỗn hợp

hexane:acetone 70/30 đê phân tách thành

phần taxol.Thành phần taxol sau đó được

cô đặc để làm khô.

 taxol cô đặc được kết tinh từ hỗn hợp methanol:water.Sau đó kết tinh lại từ hỗn hợp aceton:hexane đạt được 85-95% taxol tinh khiết.

 taxol được sắc ký trong cột silica gel đạt được lượng taxol tinh khiết đến 98%.

 Thu Taxol tinh sạch và nguyên chất

Sử dụng dung môi

hòa chung trong hỗn hợp Acetone: hexane

( 1:1) Taxol trong dung d ch sau ly ị

tâm

IV NH NG THÀNH T U ĐÃ Đ T Đ Ữ Ự Ạ ƯỢ C

 Ở V i ệ t N a m , c ô n g n g h ệ n u ô i c ấ y t ế b à o p h á t t r i ể n v à o n h ữ n g n ă m 1 9 7 0

 Q u y t r ì n h S ả n x u ấ t c á c h ợ p c h ấ t t h ứ c ấ p t ừ s â m N g ọ c L i n h d o H o c v i ệ n Q u â n y k h a i t h á c

 V i ệ t n a m đ a n g t r i ể n k h a i d ự á n n u ô i c ấ y v à c h i ế t x u ấ t t a x o l t ừ t h ô n g đ ỏ ở L â m Đ ồ n g