Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của 3 (4 nitrophenyl) hydantoin và một số dẫn chất

Cho đến nay, nhiều dẫn chất của hydantoin đã được tổng hợp và cứu và cho thấy nhiều tác dụng sinh học đáng chú ý: 1.1.1 Tác dụng chống co giật Dẫn chất hydantoin được dùng nhiều nhất tr

B Ộ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

B Ộ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

L ỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới ThS

TS.Vũ Trần Anh là người thầy đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện

thuận lợi và động viên tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi cũng xin cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của : Ths Đặng Vũ Lương

(Phòng NMR- Viện hóa học- Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam), Ths

Nam), TS Nguy ễn Thị Sơn (Bộ môn Hóa vật liệu, khoa Hóa, trường Đại học

Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội) và toàn thể các thầy cô giáo, cán bộ kỹ thuật viên của Bộ môn Hóa hữu cơ, các thầy cô giáo trong trường, các phòng ban, thư viện - Trường Đại học Dược Hà Nội

Mặc dù đã có nhiều cố gắng nhưng do hạn chế về thời gian, kiến thức cũng như tài liệu tham khảo nên khóa luận của tôi không thể tránh khỏi những sai sót, khiếm khuyết trong nội dung và hình thức, tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô để khóa luận được hoàn thiện hơn

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu vừa qua

Hà Nội, ngày 1 tháng 5 năm 2013

Sinh viên

Lê Trọng Đạt

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

13

C – NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13

EGFR : Epidermal growth factor receptor, thụ thể của yếu tố

tăng trưởng biểu mô

HCT116 : Tế bào ung thư đại tràng ở người

Hep – G2 : Tế bào ung thư gan ở người

HMBC : Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết

(Heteronuclear Multiple Bond Connectivity)

1

H – NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

HSQC : Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết

(Heteronuclear Single-Quantum coherence)

IR : Phổ hồng ngoại

DANH M ỤC CÁC BẢNG

3.1: Kết quả tổng hợp của các dẫn chất

3.3: Số liệu phổ 1

3.4: Số liệu phổ 13

3.5: Kết quả thử tác dụng kháng các dòng tế bào ung thư

người của các chất tổng hợp được

31

3.7: Giá trị IC50(µg/ml) của các dẫn chất hydantoin trên Hep-G2 38 3.8: Giá trị IC50(µg/ml) của các dẫn chất hydantoin trên HTC116 39

Trang CÁC CHỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT

1.2.1.1 Phương pháp tổng hợp từ α-aminoacid và isocyanat hữu cơ 8

1.2.1.3 Phản ứng đóng vòng của các α-dicarbonyl với ure hoặc dẫn xuất của

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong tất cả các lĩnh vực, việc tìm ra những phương pháp mới để nâng cao hiệu quả sử dụng luôn là vấn đề được quan tâm hàng đầu Cũng như vậy, trong lĩnh vực Dược phẩm, các nhà khoa học luôn nỗ lực không ngừng nhằm tìm ra những dẫn chất mới có tiềm năng tác dụng sinh học để có thể nâng cao công tác phòng và chữa bệnh

Hiện nay, đã có nhiều phương pháp đươc áp dụng nhưng phương pháp

tổng hợp và bán tổng hợp vẫn giữ vai trò quan trọng và không thể thiếu Các nhà nghiên cứu thường dựa trên cấu trúc của các chất đang được dùng làm thuốc hoặc các chất có tác dụng dược lý, có triển vọng để tạo ra các chất mới

dự đoán có tác dụng tốt hơn, ít độc tính hơn và có hiệu quả cao hơn trong điều

trị

Với những tiềm năng về tác dụng sinh học, các dẫn chất của hydatoin đã được quan tâm nghiên cứu và mang lại những hiệu quả nhất định Có thể kể đến một số dẫn chất đã được sử dụng rộng rãi trong y học như phenytoin (thuốc chống động kinh), nitrofurantoin (thuốc kháng khuẩn), dantrium (thuốc giãn cơ vân), nilutamid (thuốc điều trị ung thư tuyến tiền liệt di căn)

Để góp phần nghiên cứu, tìm kiếm các dẫn chất 5-arylidenhydantoin mới

có tiềm năng về hoạt tính sinh học, chúng tôi thực hiện khóa luận với các mục tiêu sau:

1.Tổng hợp 3-(4-nitrophenyl)hydatoin và một số dẫn chất

2.Thử tác dụng chống ung thư của các hợp chất tổng hợp được

CH ƯƠNG 1.TỔNG QUAN

Hydantoin (imidazolidin-2,4-dion) là hợp chất hữu cơ được A.Bayer phát hiện năm 1861 [11] bằng phản ứng hydro phân (hydrogenolysis) allantoin (chất được phát hiện trong túi dịch niệu (the allantoic fluid) của bò cái), đó là nguồn gốc của tên hydantoin Sau đó, năm 1864, A.Bayer [11]

tổng hợp được hydatoin với nguyên liệu ban đầu là bromoacetylure Tuy nhiên cấu trúc vòng của hydantoin chỉ được xác định bởi Strecker vào năm

1873 [8] Cho đến nay, nhiều dẫn chất của hydantoin đã được tổng hợp và

cứu và cho thấy nhiều tác dụng sinh học đáng chú ý:

1.1.1 Tác dụng chống co giật

Dẫn chất hydantoin được dùng nhiều nhất trong điều trị là

5,5-diphenylhydatoin (phenytoin) (1), biệt dược là Dilantin (biệt dược của Davis), Epanutin (biệt dược của Pfizer)

Parke-NH

H N O O

(1)

Phenytoin có tác dụng chống co giật, thường được sử dụng trong điều trị

bệnh động kinh [2], [6], [19] Tuy nhiên phenytoin còn có một số tác dụng

phụ như giảm bạch cầu, giảm tiểu cầu, buồn nôn, phát ban,… vì thế đã có nhiều nghiên cứu nhằm tổng hợp các dẫn chất của hydantoin có ít tác dụng

phụ hơn nhưng vẫn duy trì được tác dụng chống co giật Ví dụ, các dẫn chất phenytoin được tổng hợp gồm ethotoin (3-ethyl-5-phenylhydantoin), mephenytoin (5-ethyl-3-methyl-5-phenylhydantoin), 5-methyl-5-phenylhydantoin, và 5-pentyl-5-phenylhydantoin [24]

1.1.2 Tác d ụng kháng khuẩn kháng nấm

Nitrofurantoin (2) là dẫn chất hydantoin được dùng điều trị nhiễm khuẩn đường tiết niệu từ năm 1959 và cho đến nay vẫn được sử dụng trong điều trị [9], [16]

Năm 1993, tác giả Janos Marton và cộng sự [20] đã tổng hợp và thử tác

dụng kháng khuẩn,kháng nấm của dẫn chất 5-arylidenehydantoin (3 a-h) cho

thấy chúng có tác dụng tốt Các chất tổng hợp có tác dụng với chủng nấm gây

bệnh trên lúa mì, đậu… như Erysiphegraminis f sp Stritici, Uromyces

appendicutalus, Botrytis nicerea

R1=R2=R3=R4=H (a) R 1 =OH, R2=R3=R4=H (e)

R3=OCH3, R1=R2=R4=H (b) R 2 =OCH3, R3=OH, R1=R4=H (f)

R1=OCH3, R2=R3=R4=H (c) R 2 =OH, R3=OCH3, R1=R4=H (g)

R2=R3=OCH3,R1=R4=H (d) R 1 =OH, R2=OCH3, R3=R4=H (h)

3 a-h

1.1.3 Tác dụng ức chế tế bào ung thư

Một dẫn chất hydantoin đã được ứng dụng trong điều trị ung thư là

Nilutamid (4)

F F F

O2N

N NH O

Một số hợp chất thiên nhiên có cấu trúc 5- arylidenhydantoin được phân

lập và tìm thấy có hoạt tính ức chế tế bào ung thư như các chất aplysinopsin

(5) và spongiacidin (6) từ bọt biển [15], [17]

N H

N

N O O

CH3

CH 3

HN O HN

NH

H N

R Br O

O

5 6

Năm 2003, các tác giả Đinh Thị Thanh Hải, Nguyễn Quang Đạt, Lê Mai Hương [4] cũng đã nghiên cứu hoạt tính kháng hai dòng tế bào ung thư ở người (tế bào ung thư biểu mô (KB) và tế bào ung thư màng tử cung (FL) của dãy chất 5-(5’-nitro-2’-furfurliden)hydantoin)

Kết quả là tìm được hai chất là

5-(5’-nitro-2’-furfuryliden)imidazolidin-2,4-dion(8) và 2,4-dion (9) có hoạt tính kháng tế bào ung thư rất mạnh (giá trị IC50 là 0,2-

3-piperidinomethyl-5-(5’-nitro-2’furfuryliden)imidazolidin-1,04 (µg/ml)) đối với dòng tế bào FL và 0,6-1,15 (µg/ml) đối với dòng tế bào

Năm 2006, C.Carmi và cộng sự [12] đã nghiên cứu tổng hợp một số dẫn

chất 1-phenyl-5-benzylidenhydantoin và thử hoạt tính ức chế EGFR (receptor

của yếu tố tăng trưởng biểu mô) và chống tăng sinh của ung thư biểu mô ở người A431 Kết quả nghiên cứu của tác giả Carmi cho thấy một số chất tổng

hợp được có tác dụng ức chế quá trình phosphoryl hóa của EGFR, có tác dụng

ức chế sự phát triển và tăng sinh của tế bào ung thư biểu mô A431 khi thử ở

nồng độ 20µM Chất có tác dụng mạnh nhất là

(E)-5-p-hydroxybenzyliden-1-phenethylhydantoin (10) với IC50= 27µM trên invivo

Năm 2009, V.Zualiani và C.Carmi tiếp tục hướng nghiên cứu các dẫn

chất 5-benzylidenhydantoin có hoạt tính ức chế EGFR và hoạt tính chống ung thư, đã tổng hợp và thử nghiệm hoạt tính chống tăng sinh dòng tế bào ung thư

phổi A549 [33] Kết quả cho thấy một số dẫn chất phenethylhydantoin có hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào ở nồng độ 20µM

(E)-5-p-hydroxybenzyliden-1-phenethylhydantoin (9)

N H

N

HO

9

Các tác giả đã giả thiết cơ chế tác dụng kép của dãy chất này là do liên

kết đôi liên hợp ở ngoài vòng đã tạo cho nhân hydantoin có hai khả năng tác

dụng là tương tác với vị trí hoạt động của EGFR và alkyl hóa các chất ái nhân sinh học Giả thuyết này được ủng hộ bởi hoạt tính gây độc tế bào ung thư đã

biết của nhiều hợp chất thiên nhiên và tổng hợp có chứa nhóm carbonyl α β

không no [14]

Năm 2009, M.Mudit, M.Khanfar đã công bố công trình nghiên cứu về phát minh, thiết kế và tổng hợp các dẫn chất 5-benzylidenhydantoin có hoạt tính chống ung thư di căn lấy cảm hứng từ hợp chất thiên nhiên ở biển [23]

Từ loài bọt biển Hemimycale Arabica (Mycalidae) ở biển Hồng Hải, các tác

giả đã phân lập được 3 chất đặc biệt là (Z)-5-(4-hydroxybenzyliden)hydantoin

(10), (R)-5-(4-hydroxybenzyl)hydantoin (11), yl)methylen)-hydantoin (12)

(Z)-5-(6-bromo-1H-indol-3-HN NH OH

O

O

HN NH OH

O

O

10 11

HN NH

N H O

tiền liệt trên invitro Về mối liên quan cấu trúc-tác dụng của dãy chất này, các tác giả có nhận xét là yếu tố lập thể ảnh hưởng đến tác dụng nhiều hơn yếu tố điện tử và các chất có nhóm thế ở vị trí para của nhóm benzlydien mà có chứa nguyên tử oxy, nitơ hoặc lưu huỳnh có hoạt tính cao Các hợp chất này có tính

chất nhận hydro, vì thế có thể có tương tác liên kết hydro ở vị trí para

HN

NH O

O S

13

Năm 2010, tác giả Vũ Trần Anh [1] đã nghiên cứu tổng hợp và thử hoạt tính của các dẫn xuất của hydantoin (14) Kết quả đã tổng hợp đựơc 43 dẫn

chất của hydantoin trong đó có 9 dẫn xuất của 5-arylidenhydantoin và 34 dẫn

chất base Mannich của các dẫn xuất 5-arylidenhydantoin Tác giả đã thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của 43 chất tổng hợp được đối với 2 dòng tế bào ung thư người là tế bào ung thư gan Hep-G2 và tế bào ung thư phổi LU Kết

quả cho thấy trong số 43 chất tổng hợp được có 4 dẫn chất 5- arylidenhydantoin và 9 dẫn chất base Mannich của chúng có hoạt tính kháng

tế bào ung thư gan người Hep-G2 (IC50=0,38÷5μg/ml) Các dẫn chất base Mannich đều có đặc điểm cấu tạo chung là chứa nhóm hút điện tử (-Cl, -NO2) trong hợp phần aryliden

N H

N O

O C

H

CH2-NR1R2R

1'

2' 3'

4'

5' 6'

1 2

3 4 5 6

(14)

R=H, 2’-OH; 4’-OH, 4’-N(CH3)2; 4’-F; 2’-Cl; 4’-Cl; 3’-NO2; 4’-NO2

1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP HYDANTOIN VÀ DẪN CHẤT

Hiện nay nhiều dẫn chất của hydantoin ngoài việc được ứng dụng làm thuốc còn được sử dụng làm nguyên liệu trong tổng hợp hóa học, trong hóa phân tích, trong nông nghiệp và nhiều ứng dụng khác Do tiềm năng ứng dụng

đa dạng của các dẫn chất hydantoin, nên từ cuối thế kỉ 19 đến nay đã có nhiều phương pháp tổng hợp hydantoin và dẫn chất được công bố trong các tài liệu khác nhau

1.2.1 Ph ản ứng tổng hợp hydantoin và hydantoin thế

1.2.1.1 Phản ứng đóng vòng của các α-aminoacid với các cyanat

Đây là phương pháp cổ điển để tổng hợp hydantoin thế ở C-5 hoặc N-1,

sử dụng phản ứng giữa α-aminoacid và kalicyanat, được tác giả Urech tiến hành đầu tiên vào năm 1873 Phản ứng được tiến hành trong dung dịch nước

H2O

100 0 C

HCl 25%

Muối kali của acid hydantoic

Phương pháp tổng hợp này cho hiệu suất cao nếu đi từ nguyên liệu là

muối hydroclorid của ester ethylglycin

1.2.1.2 Phương pháp tổng hợp từ α-aminoacid và isocyanat h ữu cơ

Đây là phương pháp mở rộng của phương pháp Urech [34], được sử

dụng để tổng hợp dẫn chất hydantoin thế ở N-3 Akyl isocyanat và aryl isocyanat được sử dụng rộng rãi trong tổng hợp hydantoin từ α-amino acid [13]

Tùy thuộc vào điều kiện phản ứng và tỷ lệ các chất tham gia phản ứng có

thể thu được sản phẩm trung gian là dihydroxyimidazolidon hoặc glycouril Khi đun nóng chất trung gian với acid hydrochloric, hydantoin sẽ tạo thành [8], [21]

H N H N N H

O O

dihydroxyinidazolidin Glycouril

HN NH O

H l -H

2

R

C CNR' NHCOOH

2

HN NH

R R'

NH

H2O

HN NH

R R' O O

1.2.1.5 Phản ứng của các cyanoacetamid với kiềm hypohalid [8], [19]

Sơ đồ phản ứng:

R' R

R' R

H N O

O

R' R NaOBr

Sản phẩm của phản ứng là các sản phẩm thế hai lần ở vị trí C-5

1.2.2 Phản ứng tổng hợp dẫn chất 5-arylidenhydantoin

Hydantoin (imidazolidin-2,4-dion) có công thức cấu tạo như sau:

NH N H

O

O

NH N H

O

O C

H R OH 1

N H

O

O 1

5 4 3 2 R

RCHO

5 2

R = phenyl, phenyl thế, furyl, pyryl, quinolyl

Năm 1911, Wheeler và Hoffman là những người đầu tiên nhận thấy hydantoin có thể ngưng tụ với các aldehyd thơm tạo thành dẫn chất có nối đôi

gắn ở C-5 của hydantoin [29] Phản ứng được thực hiện trong acid acetic băng, với natri acetat khan, anhydrid acetic Các aldehyd thơm đã được sử

dụng là benzaldehyd, 2-hydroxybenzaldehyd, furfural, vanillin,…

NH N H

NH N H

O

O

O

O Ar

Ar CHO

-H2O AcOH, AcONa

Phương pháp của Wheeler và Hoffman được sử dụng để tổng hợp nhiều

dẫn chất thế ở C-5 của hydantoin [26], [31]

Năm 1993, Marton J [20] sử dụng xúc tác có tính base mạnh là ethanolamin để tiến hành phản ứng ngưng tụ aldehyd thơm với hydantoin trong dung môi là hỗn hợp nước : ethanol (1:1), phản ứng được tiến hành ở nhiệt độ hồi lưu trong 4 giờ Tác giả sử dụng một số aldehyd thơm (p-clorobenzaldehyd, p-nitrobenzaldehyd, p-hydroxybenzaldehyd…), hiệu suất

phản ứng 44-89% Năm 2004, tác giả Thenmozhiyal và cộng sự [27] đã sử

dụng xúc tác này trong điều chế các phenylmethylenhydantoin và điều chế được 54 dẫn chất

Sơ đồ phản ứng:

R

NH N H

O

H

NH O

O R

Ethanolamin, t 0

R= alkyl, alkoxy (-OR), -NR, -OH, -X, -CN, CF3, -NO2

Để rút ngắn thời gian phản ứng, hiện nay các nhà khoa học đã sử dụng vi sóng trong tổng hợp hữu cơ Năm 2006, tác giả Lamiri [18] đã sử dụng vi sóng trong tổng hợp 5-arylidenhydantoin Hỗn hợp natri acetat, oxyd nhôm được cho vào hỗn hợp hydantoin và aldehyd trong dung môi CH2Cl2 Khuấy

hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng, sau đó cất loại CH2Cl2 , dùng vi sóng tần

số 2045Hz, công suất 1250W tác động vào trong 2 phút

NH N H O

NH H

R

O

O RCHO

natri acetat/oxyd nhôm

vi sóng, 2 phút O

Phản ứng có hiệu suất tương đối cao (74-96%), với các aldehyd là

p-clorobenzaldehyd,…

Về cơ chế phản ứng ngưng tụ

Phản ứng ngưng tụ giữa hydantoin và aldehyd thơm là phản ứng ngưng

tụ kiểu aldol xảy ra theo cơ chế như sau [25], [28]

- Giai đoạn cộng hợp:

Nhóm methylen ở vị trí 5 của hydantoin rất hoạt động, nguyên tử H ở đây dễ dàng tách khỏi carbon (khi có xúc tác base) và anion (II) được tạo thành là một tác nhân ái nhân mạnh:

NH

N HC O

O NH

H

Ar O

Ar C O H

(+)

+

(-)

(III) (II) (IV)

Ion alcolat (IV) tạo thành lại lấy một proton của BH, trả lại xúc tác Bˉ :

NH

N

O

O HC

H

Ar O

NH

N

O

O HC

H

Ar OH

+BH

+ B

(IV) (V)

- Giai đoạn ngưng tụ loại nước:

Xúc tác base (B-) lấy nguyên tử H linh động ở vị trí số 5 và tách anion hydroxyd tạo thành sản phẩm tương ứng

NH

N H

O

O C

H2Ar

+ BH + OH

CHƯƠNG 2.NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, DUNG MÔI

2.2 THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM

- Dụng cụ thủy tinh (bình cầu 3 cổ dung tích 500ml, sinh hàn, phễu nhỏ

giọt, ống đong, cốc thủy tinh các loại, bình lọc hút, phễu Buchner…)

- Cân kỹ thuật điện tử Shimadzu (Nhật)

- Bơm hút chân không DIVAC.1.21 (Mỹ)

- Bơm hút chân không VRL mode 200- 7.0 (Mỹ)

- Máy cất quay Büchi R- 210 (Thụy Sĩ)

- Tủ sấy Memmert (Đức)

- Tủ sấy chân không Shellab (Đức)

- Mấy khuấy từ IKA – RCT (Đức)

- Máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt (Mỹ)

- Phổ hồng ngoại (IR) ghi trên máy Perkin Elmer, Bộ môn hóa vật

liệu,Khoa hóa học,ĐHKHTN, ĐH Quốc gia Hà Nội

- Tổng hợp và xác định cấu trúc các dẫn chất của arylidenhydantoin

3-aryl-5 Thử hoạt tính kháng một số dòng tế bào ung thư của các chất tổng hợp được

2.4.1 Phương pháp tổng hợp các 3-aryl-5-arylidenhydantoin

- Sử dụng các phương pháp thực nghiệm trong hóa hữu cơ để tổng hợp các chất dự kiến

- Dùng phương pháp kết tinh lại để tinh chế sản phẩm thu được

- Dùng SKLM để theo dõi phản ứng và sơ bộ xác định độ tinh khiết

2.4.2 Phương pháp xác định cấu trúc

Các phương pháp phổ (IR, 1

H-NMR, 13C-NMR, MS) được sử dụng để

khẳng định cấu trúc của các sản phẩm tổng hợp được Các số liệu phổ của các

chất tổng hợp được đối chiếu với tài liệu

2.4.3 Phương pháp thử tác dụng kháng tế bào ung thư

Nguyên tắc:

- Áp dụng phương pháp MTT được biên soạn bởi tác giả Mosmann (1983) để đánh giá độc tính trên tế bào [22] Nguyên tắc của phương pháp

như sau: MTT là thử nghiệm in vitro để đo sự tăng sinh và sống sót của tế

bào Tế bào được nuôi cấy trong một đĩa 96 giếng, đáy bằng Hợp chất MTT 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, có màu vàng được thêm vào mỗi giếng và tế bào được ủ ở 37o

C, 5% CO2 Màu vàng này bị

biến đổi thành formazan tím trong ty thể của những tế bào sống Khả năng

hấp thụ của dung dịch có màu này có thể được định lượng bằng máy quang

phổ kế ở bước sóng 540 – 600nm Sự biến đổi màu chỉ xảy ra khi enzyme reductase trong ty thể là hoạt động, và do đó sự chuyển đổi có thể liên quan

trực tiếp đến số lượng tế bào sống sót Chúng tôi sử dụng phương pháp này để nghiên cứu độc tính của thuốc đối với tế bào

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Trong khóa luận này chúng tôi tiến hành thực hiện tổng hợp 1 số dẫn chất 3-aryl-5-arylidenhydantoin bao gồm các công việc sau:

- Tổng hợp dẫn chất 3-(4-nitrophenyl)hydantoin bằng phản ứng đóng vòng giữa glycin và 4-nitrophenyl isocyanat:

H2C COOH + O2N N=C=O

NH2

1.KOH/H2O

-H2O HCl 25%,t0

O2N NH

N H

OH O

O

O2N N

N H O

O

(A)

(B) 2.HCl

O

N H O

O

R (B)

R = -H (I); -4’-Cl (II); -4’-NO2 (III); -3’-NO2 (IV); -4’-F (V)

O2N NH

N H

Sau đó thêm từ từ 1,8g (0,011mol) 4-nitrophenyl isocyanat, trong quá trình cho hóa chất vẫn làm lạnh ở 100

Acid hóa dịch lọc bằng HCl (2N), lọc qua giấy lọc thu được tủa, rửa tủa

bằng nước và sấy khô

Khối lượng sản phẩm: 1,42g chất rắn màu vàng

Ph ổ 13

8,518(s;1H;N1-H); 8,324(d;2H;H3”,5”); 7,728(d;2H;H2”,6”); 4,104(s;2H;H5)

3.1.1.2 T ổng hợp 3-(4-nitrophenyl) hydantoin (B)

Công th ức:

N H O

Đun hồi lưu trong vòng 4 giờ

EtOAc/MeOH (4:1)

Sau đó hỗn hợp phản ứng được làm lạnh và lọc, hút kiệt và rửa tủa nhiều

lần cho tới khi hết acid (thử bằng giấy quỳ)

Sau đó rửa vài lần bằng cồn lạnh Sấy khô tủa thu được Kết tinh lại trong dung hệ dung môi EtOH:DMF (5:1)

Khối lượng sản phẩm: 0,7g chất rắn màu trắng

Hiệu suất: 67,88%

Nhiệt độ nóng chảy: 249,3-252,80

C (phù hợp với tài liệu tham khảo [13])

Rf = 0,43 (TLC, silicagel 60 F254, hệ dung môi EtOAc/MeOH (4:1)

Cho vào bình cầu 0,03 mol aldehyd thơm; 0,66g (0,03 mol) chất B; 0,74 (0,09 mol) natri acetat và 5ml acid acetic Khuấy đều cho hỗn hợp tan hoàn toàn, đun nóng hỗn hợp, duy trì nhiệt độ phản ứng ở 150-1600C Xác định

thời gian phản ứng là 6 giờ Để nguội, đổ hỗn hợp ra cốc có mỏ, ngâm lạnh 5 phút sau đó để hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Lọc hút kiệt, rửa tủa nhiều lần bằng nước cất cho đến khi hết acid acetic (thử bằng giấy quỳ) Rửa

tiếp vài lần bằng cồn lạnh Sấy khô tủa thu được Kết tinh lại trong dung môi thích hợp Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi khai triển cloroform : methanol (9: 0,5) Sau đây là kết quả cụ thể:

1 5-benzyliden-3-(4- nitrophenyl)hydantoin (chất I)

Công th ức

N H O

lại trong hỗn hợp dung môi EtOH:DMF (5:1)

Sản phẩm thu được là 0,56g chất kết tinh màu vàng

Ph ổ IR (KBr), υmax (cm-1) : xem phụ lục 3.1

Ph ổ 1

Sản phẩm thu được là 0,61g chất kết tinh màu vàng nhạt

O

NO2

CTPT:C16H10N4O6, KLPT: 354,27

Tiến hành

0,45g 4-nitrobenzaldehyd (0,003 mol) – 0,66g chất B (0,003 mol)- 0,74g natri acetat (0,009 mol) – 5ml acid acetic Đun hồi lưu trong vòng 6 tiếng, kết tinh lại trong hỗn hợp dung môi EtOH:DMF (5:1)

Sản phẩm thu được là 0,60g chất kết tinh màu vàng đậm

Sản phẩm thu được là 0,79g kết tinh màu trắng

Phổ LC-MS: [M-H]

(tính toán: 354,27 [C16H10N4O6], tìm thấy 353,0) (xem phụ lục 6.4)

tiếng, kết tinh lại trong hỗn hợp dung môi EtOH:DMF (5:1)

Sản phẩm thu được là 0,58g tinh thể màu vàng nhạt

Phổ hồng ngoại được ghi trên máy Perkin Elmer tại Bộ môn hóa vật liệu, Khoa hóa học,ĐHKHTN, ĐH Quốc gia Hà Nội 5 phổ đồ được ghi ở các phụ

lục 2.1 ÷ 7.1 Kết quả phân tích số liệu phổ hồng ngoại được ghi ở bảng 3.2

3.2.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton, 13C được ghi trên máy phổ AVANCE Spectrometer AV500 (BRUKER, Đức) trong dung môi DMSO-d6, chất chuẩn nội TMS tại Viện hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Bảy phổ đồ được ghi ở các phụ lục 1.2 ÷ 7.2, 1.3 ÷ 7.3 Kết quả phân tích số

liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton và 13C được ghi ở bảng 3.3, 3.4

3.2.3 Ph ổ khối lượng

Phổ khối lượng (LC/MS) ghi trên máy LS-MSD-Trap-SL, tại Viện hóa học, Viện khoa học và công nghệ Việt Nam 5 phổ đồ được ghi ở các

phụ lục 3.4 ÷ 7.4 Kết quả phổ MS được ghi ở bảng 3.1

THƯ NGƯỜI

Tại khoa Dược lý- Sinh hóa (Viện dược liệu), 5 chất do chúng tôi tổng

hợp đã được thử hoạt tính kháng các dòng tế bào ung thư người theo phương pháp sử dụng thuốc nhuộm MTT Giá trị IC50 được tính bằng phân tích hồi quy không tuyến tính của đường cong đáp ứng liều tương ứng, sử dụng phần

mềm Exell [32] Kết quả được trình bày ở bảng 3.5

Cách ti ến hành:

- Nuôi cấy tế bào: Các dòng tế bào được lưu giữ trong nitơ lỏng, đánh thức và duy trì trong môi trường DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) có bổ sung huyết thanh bê tươi 10%, dung dịch kháng sinh và kháng nấm 1% (penicillin 50,000 units/L và streptomycin 50 mg/L) Tế bào được nuôi cấy cho phát triển tới mức khoảng 70%, thay môi trường

sạch, tế bào này được dùng làm thí nghiệm

- Mẫu thí nghiệm: Hòa mẫu thí nghiệm vào dung dịch DMSO 100% sao cho nồng độ gốc của các mẫu là 2 mg/ml Tiếp theo pha thuốc nghiên cứu thành thang nồng độ gồm 5 nồng độ 100, 50, 25, 12.5, và 6.25 μg/ml Nồng độ của thuốc thử được dùng theo tiêu chuẩn sàng lọc thuốc chống ung thư có nguồn gốc dược liệu của tác giả Teicher 1997 [10] Ellepticine được sử dụng làm chứng dương, với nồng độ thử lần lượt là 50; 25; 12,5; 5,25; và 3,125 μM Dung dịch DMSO 0,1% được

sử dụng làm chứng âm

- Quy trình nuôi c ấy:

1 Cho khoảng 2X104tế bào/ml môi trường nuôi cấy (đối với các dòng

tế bào MCF-7, Hep-G2, A549) và 4X104

tế bào/ml môi trường nuôi cấy (đối với dòng tế bào HTC116) Để 2 giếng trống làm chứng trắng (blank control)

2 Các tế bào được nuôi trong môi trường ở 37o

C và 5% CO2 cho phép

tế bào gắn vào đáy mỗi giếng của đĩa nuôi cấy Giữ tế bào trong 24

giờ để tế bào ổn định

3 Sau 24 giờ nuôi cấy, thêm 20 μl thuốc thử và thuốc chuẩn ở các

nồng độ khác nhau vào mỗi giếng Mỗi nồng độ được lặp lại ở 2

giếng Lắc nhẹ đĩa nuôi cấy để thuốc được tan hoàn toàn trong môi trường

4 Ủ đĩa nuôi cấy từ 48 giờ (37o

C, 5% CO2)cho phép thuốc phát huy tác dụng Quan sát tế bào hàng ngày bằng kính hiển vi

5 Chuẩn bị dung dịch MTT nồng độ 5mg/ml

6 Thêm 20 μl dung dịch MTT vào mỗi giếng của đĩa nuôi cấy Lắc

nhẹ cho MTT khuếch tán đều trong môi trường nuôi cấy

7 Ủ 37o

C trong 3 giờ để MTT được chuyển hóa

8 Loại bỏ môi trường trong các giếng của đĩa nuôi cấy

9 Hoàn trả formazan (sản phẩm chuyển hóa MTT) bằng 100 μl DMSO Lắc kỹ để formazan có thể tan hoàn toàn

10 Đọc mật độ quang ở bước sóng 540 nm Mật độ quang sẽ phản ánh

- Dòng tế bào MCF-7 (tế bào ung thư vú)

- Dòng tế bào Hep-G2 (tế bào ung thư gan)

- Dòng tế bào A549 (tế bào cung thư phổi)

- Dòng tế bào HTC116 (tế bào ung thư đại tràng)

Hóa ch ất:

- MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide) của hãng in vitrogen

- Adriamycin của hãng Sigma

- DMSO của hãng sigma

- Và các hóa chất khác

Máy móc thiết bị: máy đọc ELISA của hãng Thermo Labsystems, kính

hiển vi soi ngược, và các máy móc khác

Ch ất chuẩn dương tính: Adriamycin được sử dụng làm chứng dương.

Th ực nghiệm Nhi ệt độ nóng

B ảng 3.2 Kết quả phổ IR của các chất đã tổng hợp được

B ảng 3.3 Số liệu phổ 1

H – NMR c ủa các chất tổng hợp được Công th ức cấu tạo chung:

O2N N

N H O

O 1 2

3 4 5 1"

O

1 2 4 5

R

1' 2' 3' 4' 5' 6'

B ảng 3.4 Số liệu phổ 13

C – NMR c ủa các chất tổng hợp được Công th ức cấu tạo chung

O2N N

N H O

O 1 2

3 4 5 1"

O

1 2 4 5

R

1' 2' 3' 4' 5' 6'