Bài viết nghiên cứu tác dụng chữa bệnh của các loài cây địa phương nhằm nâng cao giá trị của chúng, thông qua thử hoạt tính kháng khuẩn, gây độc tế bào và chống oxy hóa của dịch chiết bằng Metanol từ một số loài cây thuộc chi rau răm.
31(2): 43-46 T¹p chÝ Sinh häc 6-2009 HO¹T TÝNH SINH HọC CủA DịCH CHIếT BằNG METANOL Từ MộT Số LOàI CÂY THUộC CHI RAU RĂM (POLYGONUM) TỉNH LÂM ĐồNG NGUYễN THị DIệU THUầN, NGUYễN HữU TOàN PHAN, HOàNG THị ĐứC, NGUYễN ĐìNH TRUNG Viện Sinh học Tây Nguyên Nớc ta có nguồn tài nguyên thực vật phong phú đa dạng, chi loài chứa hoạt chất sinh học có giá trị kinh tế lớn Để góp phần nghiên cứu tác dụng chữa bệnh loài địa phơng nhằm nâng cao giá trị chúng, tiến hành thử hoạt tính kháng khuẩn, gây độc tế bào chống ôxy hãa cđa dÞch chiÕt b»ng metanol (MeOH) tõ mét sè loài thuộc chi Rau răm (Polygonum), họ Rau răm (Polygonaceae) phân bố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng I PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU Đối tợng Chúng tiến hành nghiên cứu dịch chiết MeOH từ loài thuộc chi Rau răm (Polygonum) đợc thu hái thành phố Đà Lạt Thời gian thu hái vào đầu mùa ma (tháng 4) Thân thu hái đợc sấy khô nhiệt độ 40oC Với ký hiệu: P1 - rau răm (P odoratum Lour.), P2 - nghể bún (P pesicaria L.), P3 thåm låm (P chinensis L.), P4 - thåm låm gai (P perfoliatum L.), P5 - nghÓ c¸nh (P alatum Buch.-Ham ex D Don), P6 - nghĨ ốm (P strigosum R Br.), P7 - nghể đông (P orientale L.) P8 - răm nớc (P hydropiper L.) [1-3, 57] Phơng pháp a Thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Các kháng sinh kiểm định bao gồm: ampixilin vi khuẩn gram (+), tetraxilin vi khuẩn gram (-), nystatin nấm sợi nấm men Các chủng vi sinh vật kiểm định: vi khuẩn gram (-) Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923); c¸c vi khuÈn gram (+) lµ Bacillus subtillis (ATCC 27212), Staphylococus aureus; nấm sợi Aspergillus niger, Fusarium oxysporum; nấm men Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae b Thư nghiƯm ho¹t tÝnh chèng «xy hãa hÖ DPPH - antioxydant MÉu sÊy kh« đợc chiết MeOH, cô thu hồi dung môi cắn thô thu đợc, đợc đem thử hoạt tính chống «xy hãa hƯ DPPH (1,1diphenyl-2-picrylhydrazyl) - antioxydant Dùa trªn nguyên tắc 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) có khả tạo gèc tù bỊn dung dÞch EtOH b o hòa Khi cho chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, chất có khả làm trung hòa bao vây gốc tự làm giảm cờng độ hấp thụ ánh sáng gốc tự DPPH Khả chống ôxy hóa đợc đánh giá thông qua giá trị hấp phụ ánh sáng dịch thí nghiệm so với đối chứng đọc máy Elisa ë b−íc sãng 515 nm c Thư nghiƯm ho¹t tính gây độc tế bào Phơng pháp Likhiwitayawuid: Sử dụng dòng tế bào: KB (ung th biểu mô), Fl (ung th− mµng tư cung), RD (ung th− mµng tim), HepG2 (ung th gan) Tế bào đợc trì liên tục điều kiện tiêu chuẩn Sau tế bào đợc hoạt hóa phát triển đến pha log, đợc sử dụng để thử nghiệm với chất thử đ đợc chuẩn bị sẵn 4-10 thang nồng độ khác nhau; thử nghiệm đợc lặp lại lần phiÕn vi l−ỵng 96 giÕng PhiÕn thư nghiƯm bao gåm: tế bào cộng với môi trờng nuôi cấy cộng với mẫu thử, đợc ủ tủ ấm điều kiện CO2/37oC/48-72h để tế bào tiếp tục phát triển Sau lấy cố định tế bào, rửa, nhuộm tế bào hòa lại dung dịch chuẩn Đọc kết máy đọc Elisa bớc 43 sóng 495-515 nm Giá trị IC50 đợc tính chơng trình Table Curve với giá trị logarit dựa giá trị d y thang nồng độ khác chất thử giá trị OD đo đợc Mẫu thô có IC50 20 àg/ml có hoạt tính [4] Phơng pháp MTT: Sử dụng dòng tế bào ung th vú MCF-7 Dựa vào hoạt động enzim dehydrogenaza ty thể tế bào sống xúc tác chuyển chÊt mµu vµng tan n−íc MTT [3-(4,5 dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] thành tinh thể formazan có màu xanh đen không tan ®−ỵc n−íc Sè l−ỵng tinh thĨ formazan ®−ỵc ®o phơng pháp đo mật độ quang OD bớc sóng 570 nm Chất so sánh đợc sử dụng camptothexin Khả gây độc tế bào ung th MCF-7 hợp chất đợc tính theo công thức: H(%) = O§C - OTN O§C Ghi chó: H tû lƯ (%) gây độc tế bào hợp chất; OĐC giá trị OD mẫu đối chứng (môi trờng chứa DMSO); OTN giá trị OD mẫu thí nghiệm (môi trờng chứa hợp chất) II KếT QUả Và THảO LUậN Thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Mẫu thử đợc hòa tan DMSO 100%, với 4-10 thang nồng độ đợc pha lo ng từ dịch gốc nhá sang phiÕn vi l−ỵng 96 giÕng Vi sinh vËt kiểm định sau đợc hoạt hóa, đợc pha lo ng môi trờng dinh dỡng nồng độ tơng đơng 0,5 đơn vị McLand (khoảng 108 vsv/ml) Để tđ Êm ë ®iỊu kiƯn 37oC/24h ®èi víi vi khuẩn 30oC/48h nấm Sau đọc kết tính giá trị ức chế tối thiểu (MIC) Mẫu thô có MIC 200 àg/ml có hoạt tính Phơng pháp thử đợc tiến hành Phòng thÝ nghiƯm ho¹t tÝnh sinh häc cđa ViƯn Hãa häc hợp chất thiên nhiên Kết nghiên cứu đợc trình bày bảng Kết cho thấy mẫu thu hái đợc có hoạt tính kháng số vi sinh vật kiểm định mức độ khác Trong đó, dịch chiết MeOH từ nghể đông (P orientale L.) có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định, từ nghể ốm (P strigosum R Br) có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định, từ răm nớc (P hydropiper L.) có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Đây dịch chiết có hoạt tính kháng vi sinh vật mạnh Bảng Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định P aeruginosa B subtillis S aureus A niger F oxysporum S cerevisiae C albicans P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 (-) 200 (-) (-) 200 100 (-) 200 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) 100 200 100 (-) 200 200 200 50 100 50 (-) (-) (-) (-) (-) 100 100 200 (-) (-) (-) 200 (-) 50 50 50 (-) 100 (-) (-) (-) (-) (-) (-) 200 100 200 (-) (-) 200 (-) 100 Thử nghiệm hoạt tính chống ôxy hóa hệ DPPH - Antioxydant Mẫu sấy khô đợc chiết dung môi 44 NÊm men E coli Vi khuÈn gram (-) Ký hiệu mẫu Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC: àg/ml) Vi khuÈn gram (+) NÊm mèc MeOH; c« thu håi dung môi cắn thô thu đợc đem thử hoạt tÝnh chèng «xy hãa hƯ DPPH (1, - diphenyl - - picrylhydrazyl) - antioxydant Phơng pháp thử đợc tiến hành Phòng thí nghiệm hoạt tính sinh học Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên Kết đợc trình bày bảng Bảng Hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết MeOH tõ c¸c mÉu P1-P5 Ký hiƯu mÉu Chøng (+) Chøng (-) DMSO/EtOH P1 P2 P3 P4 P5 SC50 (µ µg/ml) 25,33 107,43 165,42 83,58 55,16 86,40 SC (%) 68,02 ± 0,1 0,00 ± 0,0 58,57 ± 0,3 50,52 ± 0,1 61,90 ± 0,8 68,93 ± 0,5 68,58 ± 0,8 Dùa kết thử hoạt tính chống ôxy hóa hệ DPPH loài thuộc chi Rau răm (Polygonum) cho thấy, chúng có hoạt tính chống ôxy hóa mạnh Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào Mẫu sấy khô đợc chiết dung môi MeOH; cô thu hồi dung môi cắn thô thu đợc đem thử hoạt tính gây độc tế bào theo phơng pháp Likhiwitayawuid phơng pháp Kết Dơng tính Âm tÝnh D−¬ng tÝnh D−¬ng tÝnh D−¬ng tÝnh D−¬ng tÝnh D−¬ng tính MTT Các phơng pháp thử đợc tiến hành Phòng thí nghiệm hoạt tính sinh học - Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử - Trờng đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Kết đợc trình bày bảng bảng Kết cho thấy, dịch chiết MeOH toàn phần từ loài P1-P5 có hoạt tính gây độc tế bào Bảng Hoạt tính gây độc tế bào dịch chiết MeOH từ mẫu P1-P5 theo phơng pháp Likhiwitayawuid Tỷ lệ (%) tế bào sống dòng tế bào Ký hiÖu mÉu Hep-G2 RD Fl DMSO 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 Chøng (+) 2,05 ± 0,0 1,2 ± 0,06 2,5 ± 0,7 P1 91,5 ± 0,9 75,1 ± 1,2 83,3 ± 1,5 P2 90,2 ± 1,15 78,5 ± 1,5 92,6 ± 1,9 P3 88,1 ± 0,2 83,6 ± 0,1 85,2 ± 1,8 P4 97,1 ± 0,6 81,5 ± 0,7 89,8 ± 1,4 P5 76,4 ± 1,3 75,2 ± 1,4 98,1 ± 2,8 KÕt luËn ¢m tÝnh ¢m tÝnh ¢m tÝnh ¢m tÝnh ¢m tÝnh B¶ng Tỷ lệ (%) gây độc tế bào mẫu P6-P8 dòng tế bào MCF-7 Ký hiệu mẫu P6 P7 P8 TB 0,610 0,651 0,552 Nång ®é 100 ppm STD H% 0,040 6,654 0,024 0,270 0,038 15,442 Nång ®é 10 ppm TB STD H% 0,691 0,023 -5,843 0,748 0,039 -14,477 0,703 0,049 -7,655 Ghi chú: TB giá trị trung bình mật độ quang; STD độ lệch chuẩn; H% phần trăm gây độc tế bào 45 Kết cho thấy mẫu P6, P7, P8 có hoạt tính gây độc tế bào thấp nồng độ 100 ppm hoạt tính gây độc tế bào nång ®é 10 ppm y häc cỉ trun th−êng dïng chúng để trị vết thơng da [1, 2, 5] III KếT LUậN Nguyễn Thọ Biên, 1996: Cây thuốc Lâm Đ xác định đợc dịch chiết MeOH từ rau răm (P odoratum Lour.), nghể bún (P pesicaria L.), thåm låm (P chinensis L.), thåm låm gai (P perfoliatum L.), nghĨ c¸nh (P alatum Buch.-Ham ex D Don) có hoạt tính chống ôxy hóa mạnh Dịch chiết từ mẫu có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định, dịch chiết MeOH từ nghể đông (P orientale L.) kháng vi sinh vật kiểm định, từ nghể ốm (P strigosum R Br.) kháng vi sinh vật kiểm định, từ răm nớc (P hydropiper L.) kháng vi sinh vật kiểm định Nh vậy, dịch chiết MeOH từ loài thuộc chi Rau răm (Polygonum) Lâm Đồng có hoạt tính chống ôxy hóa hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định mạnh; điều phù hợp với TàI LIệU THAM KHảO Đồng: 66-70, 230-231 Sở Y tế Lâm Đồng Võ Văn Chi, 1996: 200 thuốc thông dụng: 207 Nxb Tổng hợp Đồng Tháp Phạm Hoàng Hộ, 1999: Cây cỏ Việt Nam, I: 743-749, Nxb TrỴ, Hå ChÝ Minh Likhitwitayawuid et al., 1993: J Nat Prod., 56: 30-38 Đỗ Tất Lợi, 2004: Những thuốc vị thuốc Việt Nam: 111-119, 283, 547 Nxb Y häc, Hµ Néi Xingzhong Sun et al., 2000: J Nat Prod., 63: 1094-1097 Lê Thị Xuân, D D Soejarto, 2008: Tuyển chọn thuốc cộng đồng ngời Mờng Cúc Phơng: 258 Nxb Khoa học tự nhiên Công nghệ, Hà Néi BIO-ACTIVITIES OF THE METHANOL EXTRACTS FROM SOME SPECIES BELONGING TO THE GENUS POLYGONUM in LAM DONG PROVINCE NGUYEN THI DIEU THUAN, NGUYEN HUU TOAN PHAN, HOANG THI §UC, NGUYEN DINH TRUNG SUMMARY The methanol extracts from the aerial parts of eight species (Polygonum odoratum Lour., P pesicaria L., P chinensis L., P perfoliatum L., P alatum Buch.-Ham ex D Don, P strigosum R Br., P orientale L., P hydropiper L.) collected in Lam Dong province were submitted to bio-tests in order to evaluate the antibacterial, antioxidant and cytotoxic effects All of these extracts had antimicrobial activities, especially P strigosum R Br could resist to E coli, S aureus, F oxysporum, A niger and S cerevisiae; P orientale L could resist to S aureus, B subtillis, F oxysporum and A niger; P hydropiper could resist E coli, S aureus, B subtillis, F oxysporum, A niger and S cerevisiae As far as DPPH test, the MeOH extracts from P chinensis L., P perfoliatum L and P alatum Buch.-Ham ex D Don were found to be the most active extracts The MeOH extracts from these eight species had antioxydant and antimicrobial activities, therefore they had been used to cure the skin desease in the traditional medicine Ngày nhËn bµi: 16-12-2008 46 ... kh¸ng vi sinh vËt kiĨm định, từ răm nớc (P hydropiper L.) kháng vi sinh vật kiểm định Nh vậy, dịch chi t MeOH từ loài thuộc chi Rau răm (Polygonum) Lâm Đồng có hoạt tính chống ôxy hóa hoạt tính kháng... ex D Don) có hoạt tính chống ôxy hóa mạnh Dịch chi t từ mẫu có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định, dịch chi t MeOH từ nghể đông (P orientale L.) kháng vi sinh vật kiểm định, từ nghể ốm (P... tính kháng vi sinh vật kiểm định, từ răm nớc (P hydropiper L.) có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Đây dịch chi t có hoạt tính kháng vi sinh vật mạnh Bảng Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm